人类急性髓系白血病逆转录病毒感染的研究
作者：徐荣臻 高其康 王世赵小英 徐潍生 李翠琴 王炜琴 张克奇
单位：310009 杭州，浙江医科大学附属第二医院血液科(徐荣臻、王世、赵小英、徐潍生、李翠琴、王炜琴、张克奇)；浙江农业大学中心实验室(高其康)
关键词：白血病，粒细胞，急性；病因学；逆转录病毒科感染
中华医学杂志980708 【摘要】 目的 探索人类急性髓系白血病(AML)逆转录病毒病因学的可能性。方法 应用细胞培养，D-IGSS，逆转录酶测定，XC细胞合胞体试验以及电镜技术对白血病细胞和正常造血细胞进行逆转录病毒相关抗原(RVAAg)，逆转录酶活性，病毒致细胞病变效应(CPE)及病毒颗粒进行检测与分析。结果 32例AML患者培养前后白血病细胞样本RVAAg阳性检出率分别为50.0%和87.5%。其中14例RVAAg阳性样本同时表达逆转录酶活性且XC细胞合胞体试验阳性。电镜观察证实，75%AML细胞样本中可见典型的C型逆转录病毒颗粒。20例正常对照细胞培养前后样本的RVAAg，逆转录酶活性，合胞体试验及电镜观察结果均为阴性。结论 AML患者的白血病细胞中含有完整的逆转录病毒基因组。在体外经适当的诱导后能以完整病毒颗粒通过芽生方式释放到细胞外。
, http://www.100md.com
Investigation of retroviral infection in human acute myeloid leukemia Xu Rongzhen, Gao Qikang, Wang Shijiong，et al. Department of Hematology, 2nd Affiliated Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310009
【Abstract】 Objective To explore the potentiality of retroviral etiology in human acute myeloid leukemia(AML). Methods Cell culture techniques, direct immunogold silver staining(D-IGSS), reverse transcriptase(RT)assay, XC syncytium assay，and electron microscopy were employed to evaluate retrovirus associated antigens(RVAAgs), RT activities, CPE， and virus particles of both leukemic cells and normal hematopoietic cells. Results RVAAgs were detected by D-IGSS in 50.0% of fresh AML cell samples and 87.5% of cultured AML samples. RT assay showed that RVAAg-positive samples from 14 cases simultaneously expressed RT activities, and XC syncytium assay also revealed positive results. Electron microscopy demonstrated typical type C retrovirus particles at various maturation in 75% of cultured leukemic cell samples. In contrast, neither RVAAgs and RT activity nor syncytium and virus particles were detected in normal controls. Conclusions AML cells harbor the entire genome(s) of retrovirus(es), which could release into extracellular spaces in intact particles via budding from the target cells stimulated in vitro by appropriate RV inducing agents. The exact relationship between these viruses and AML etiology is uncertain and needs further study.
, 百拇医药
【Key words】 Human acute myeloid leukemia Etiology Retroviridae infection
(Natl Med J China, 1998, 78：504-507)
一些自发性哺乳类动物白血病早已被证实是由逆转录病毒(RV)感染引起[1]。80年代初，成人T淋巴细胞白血病也已确认由逆转录病毒成人T淋巴细胞白血病病毒(HTLV-1)感染所致[2]。然而，与人类普通白血病有关的病毒至今仍未得到证实。近年来已初步证实，急性白血病患者的白血病细胞中含有可诱导的逆转录病毒相关抗原与逆转录酶，而相应正常造血细胞则阴性[3]。为了进一步明确急性髓系白血病(AML)是否与逆转录病毒感染有关，本研究采用新的培养体系与逆转录病毒诱导剂对32例AML患者的白血病细胞进行体外培养与逆转录病毒诱导，对AML细胞中可能存在的逆转录病毒进行系统分析，以期为AML病毒病因学提供直接证据。
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对象与方法
一 、对象
1.AML组：AML患者32例，男18例，女14例，平均年龄38.3岁。所有病例均按FAB分型标准诊断，其中M01例，M12例，M2 4例，M3 5例，M4 7例，M512例，M71例。
2.对照组：为20名健康供者。男12名，女8名，平均年龄40.16岁。
二、方法
1.细胞培养：无菌取AML患者外周血或骨髓液或正常健康人外周血2～5 ml，肝素抗凝，用Ficoll-Hypaque介质(ρ=1.077±0.002g/ml)进行密度梯度离心分离白血病细胞或正常人外周血单个核细胞(PBMNCs)。经RPMI-1640培养液(补加20%热灭活56℃，30分钟特级新生小牛血清和1%青链霉素)洗涤2次后，用完全培养液将细胞密度调至(1～2)×106/ml，补加造血细胞生成因子(HGFs)：rhIL-2(100 U/ml)，rhIL-3(100 U/ml)，rhIL-6(100 U/ml)，rhGM-CSF(100 U/ml)，rhbFGF(100 ng/ml)及诱导剂至所需浓度，放入玻璃细胞培养瓶中，置37℃细胞培养箱恒温培养7天。培养期间每天用倒置显微镜观察与记录细胞生长情况，并根据需要及时更换培养液，HGFs和诱导剂。
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2.逆转录病毒相关抗原测定：应用直接免疫金银染色法(D-IGSS)[3]。
3.病毒逆转录酶活性(RTA)测定：采用非同位素法，详细方法参见文献[4，5]。
4.合胞体形成试验：参照文献[6]，略加修改。XC细胞购于上海医科大学病理生理教研室(来自美国加州大学)，用含10%小牛血清RPMI-1640培养液培养，每隔3天传代一次。取待测细胞样本经紫外线照射10 秒钟后加入待用XC细胞培养瓶内，同时补加Polybrene(4 μg/mL，美国Sigma公司)置37℃细胞培养箱混合培养48～72小时，然后，用甲醇固定，Wright-Giemsa 染色，光学显微镜下观察合胞体(多核巨细胞)形成情况。XC细胞自身不产生合胞体。
5.透射电子显微镜观察：培养前后的细胞样本进行常规戊二醛，锇酸双固定，环氧树脂包埋，超薄切片，铀铅双染色，用JEM-1200EX电镜仔细观察与拍摄病毒及相关结构照片。
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6.病毒颗粒分离纯化与鉴定：应用低温(4℃)超速蔗糖密度梯度离心(100 000g，18小时)，具体方法参见文献[7]。
7.免疫金探针制备：参照文献[3]。
结 果
一、 逆转录病毒相关抗原(RVAAg)表达
在AML组中，培养细胞样本RVAAg检出率和阳性细胞百分率均值分别为50.0%(16/32)和12.0%，而培养后分别为87.5%(28/32)和52.8%。经统计学分析，培养前后RVAAg阳性检出率和阳性细胞百分率均值差异均有非常显著意义。20名健康者PBMNCs培养前后均未检出RVAAg。
二、病毒性逆转录酶活性测定
14例AML患者及10名正常对照者培养前后RVAAg阳性细胞样本逆转录酶活性测定结果见图1，RVAAg阳性AML样本不仅同时表达逆转录酶活性，而且AML细胞RVAAg表达水平与逆转录酶活性呈显著正相关(γ=0.90)，而10名正常对照PBMNCs样本未测出逆转录酶活性。
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图1 AML细胞培养后RVAAg含量和RT活性增加倍数相关性分析
三、XC细胞合胞体形成试验结果
为证实RVAAg和逆转录酶阳性样本是否含有感染性与致病性的病毒颗粒，对其中12例RVAAg和逆转录酶均阳性的AML细胞样本进行XC细胞合胞体形成试验。结果12例样本均可见典型的合胞体。20名正常PBMNCs合胞体形成试验阴性。
四、 透射电镜观察结果
在未经培养的20例AML样本，仅1例可见典型的逆转录病毒颗粒(RVP)，且数量少，单个散在分布。经体外7天培养与诱导后，其中15例AML样本中观察到RVP。分布于胞内空泡中或胞外间隙。大多数RVP以成熟或不成熟形式存在，也可见处于不同发育阶段的芽生。RVP呈球形，平均直径约100 nm。成熟的病毒粒子呈双层囊膜结构，内含一个位于中心位置的球形电子致密核心，而未成熟的RVP则无致密核心。部分样本的病毒颗粒的电镜照片见图2～6。根据这些形态学特征结合以下鉴定结果，RVP属于C型逆转录病毒。而正常对照未见类似病毒颗粒。
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五、病毒颗粒的分离纯化与鉴定结果
对部分AML细胞培养物进行逆转录病毒分离，纯化与初步鉴定结果为在蔗糖密度梯度超速离心中
图2 白血病细胞胞浆空泡内可见成堆的不同成熟期的病毒颗粒 图3 为图2的局部放大，箭头所指为正在出芽的病毒颗粒
图4 胞浆空泡内可见一典型的晚期芽生病毒颗粒，病毒囊膜与拟核之间隐约可见一层细小间隙 图5 细胞外成熟的病毒颗
粒，病毒囊膜与拟核之间可见一层细小间隙 图6 细胞外正在出芽的病毒颗粒
病毒颗粒主要集中在1.15～1.18 g/ml区带，逆转录酶阳性。纯化的病毒能利用自身模板与引物合成cDNA(结果另文报道)。电镜负染技术显示，纯化的病毒颗粒形态与细胞超薄切片中观察到的一致。
, 百拇医药
讨 论
分析以往的研究资料，我们认为普通白血病病毒至今未能成功分离与鉴定可能与以下一些因素有关：(1)逆转录病毒感染具有其独特的生物学特征，病毒通常以单拷贝前病毒(provirus)形式稳定地整合于靶细胞的基因组中，并且随靶细胞的分裂增殖而传递给子代细胞[8]；(2)病毒转化细胞效率极高，如大鼠红白血病病毒只需1～10拷贝mRNA即可使靶细胞完全转化；(3)逆转录病毒的增殖与复制需要靶细胞处于增殖与分裂周期[8]，而目前常用细胞培养技术还不能使大部分白血病患者的原代白血病细胞在体外长期大量扩增；(4)病毒颗粒在体外极不稳定，在37℃其半衰期仅为2.5小时；(5)机体被病毒感染后，其免疫系统通常会产生相应的抗体封闭靶细胞上的病毒抗原，并抑制病毒表达与复制，使得新鲜靶细胞上的病毒抗原检出率极低[9]。本研究应用我们新近建立的适合于AML细胞体外长期生长的培养体系和病毒诱导剂对AML 细胞中可能存在的逆转录病毒进行扩增，然后，从以下几个方面对AML细胞中可能存在的逆转录病毒进行仔细检测与分析。(1)根据不同RV 之间存在共同抗原表位特点，利用HTLV-I多克隆抗体结合敏感特异的D-IGSS 技术同时检测AML患者白血病细胞和正常健康人PBMNCS表明，RVAAg仅在AML白血病细胞中表达；(2)对部分RVAAg阳性AML样本和正常对照样本的逆转录酶活性测定结果证实，与RVAAg的表达具有良好的正相关关系，进一步证实AML细胞中检出的抗原为逆转录病毒源性，而不是由于非特性的细胞分子模拟所致；(3)合胞体试验是用于检测逆转录病毒感染的经典方法之一。其原理是，逆转录病毒env基因表达的糖蛋白具有融合靶细胞而形成多核巨细胞的能力，是病毒感染靶细胞特征性致细胞病变效应(CPE)。本研究用XC细胞系作为指示性靶细胞来检测AML细胞中可能感染的逆转录病毒，证实AML细胞样本能与XC细胞形成典型的多核巨细胞即合胞体，而正常对照无类似现象；(4)应用电子显微镜进行细胞超微结构水平寻找病毒颗粒及其相关结构是证实逆转录病毒感染最直接证据方法之一，结果显示AML细胞中含有典型的C型逆转录病毒颗粒，而正常对照样本未见类似病毒颗粒。表明，急性髓系白血病患者白血病细胞中含有完整的逆转录病毒基因组，在适宜的环境下能感染合适的靶细胞，表达各种病毒蛋白如RVAAg、逆转录酶、囊膜糖蛋白等，并且，能组装完整的病毒颗粒释放到细胞外间隙(培养液及小牛血清逆转录病毒检测均阴性，可排除污染可能性)。相应正常造血细胞培养前后逆转录病毒检测结果均阴性，提示AML细胞中发现的逆转录病毒可能是外源性。目前，有关这些病毒与AML病因学之间的确切关系尚不清楚，有待进一步研究与阐明。
, 百拇医药
参考文献
1 Vogt PK.Human T-cell leukemia/lymphoma virus-an introduction. In: Vogt PK. eds. Current topics in microbiology and immunology. New York: Springer-Verlag, 1980, 115：1-5.
2 Poiesz B J,Ruscetti F W,Gazdar A F, et al.Detection and isolation of type C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma.Proc Natl Acad Sci USA,1980,77：7415-7419.
, 百拇医药 3 王炜琴，徐荣臻，张克奇，等.人急性白血病HTLV-1相关抗原和逆转录酶活性的初步研究.浙江医学，1997，19：1-3.
4 Porstman T, Merssner K, Glaser R, et al. A sensitive non-isotopic assay specific for HIV-I associated reverse transcriptase. J Virol Methods, 1991, 31：181-188.
5 Urabe T,Sano K,Tanno M,et al. A non-radioisotopic reverse transcriptase assay using biotin-11-deoxyuridine triphosphate on primer-immobilized microtiter plates.J Virol Methods,1992,40：145-154.
, 百拇医药
6 Bastian I,Gardner J,Webb D,et al. Isolation of a human T-lymphotropic virus type I strain from Australian aboriginals. J Virol, 1993, 67：843-851.
7 Mak TW,Manaster J,Howatson, A F,et al.Particles with characteristics of leukoviruses in cultures of marrow cells from leukemic patients in remission and relapse. Proc Natl Acad Sci USA, 1974, 71：4336-4340.
8 Brown P O,Bowerman B,Varmus H E,et al. Correct integration of retroviral DNA in vitro.Cell,1987, 49：347-356.
9 Tochikura T,Iwahashi M, Matsumoto T,et al. Effect of human serum anti-HTLV-1 antibodies on viral antigen induction in vitro cultured peripheral lymphocytes from adult T-cell leukemia patients and healthy virus carries. Int J Cancer, 1985, 36：1-7.
本课题为国家自然科学基金资助项目
(收稿：1997-07-22 修回：1998-03-10), 百拇医药
单位：310009 杭州，浙江医科大学附属第二医院血液科(徐荣臻、王世、赵小英、徐潍生、李翠琴、王炜琴、张克奇)；浙江农业大学中心实验室(高其康)
关键词：白血病，粒细胞，急性；病因学；逆转录病毒科感染
中华医学杂志980708 【摘要】 目的 探索人类急性髓系白血病(AML)逆转录病毒病因学的可能性。方法 应用细胞培养，D-IGSS，逆转录酶测定，XC细胞合胞体试验以及电镜技术对白血病细胞和正常造血细胞进行逆转录病毒相关抗原(RVAAg)，逆转录酶活性，病毒致细胞病变效应(CPE)及病毒颗粒进行检测与分析。结果 32例AML患者培养前后白血病细胞样本RVAAg阳性检出率分别为50.0%和87.5%。其中14例RVAAg阳性样本同时表达逆转录酶活性且XC细胞合胞体试验阳性。电镜观察证实，75%AML细胞样本中可见典型的C型逆转录病毒颗粒。20例正常对照细胞培养前后样本的RVAAg，逆转录酶活性，合胞体试验及电镜观察结果均为阴性。结论 AML患者的白血病细胞中含有完整的逆转录病毒基因组。在体外经适当的诱导后能以完整病毒颗粒通过芽生方式释放到细胞外。
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Investigation of retroviral infection in human acute myeloid leukemia Xu Rongzhen, Gao Qikang, Wang Shijiong，et al. Department of Hematology, 2nd Affiliated Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310009
【Abstract】 Objective To explore the potentiality of retroviral etiology in human acute myeloid leukemia(AML). Methods Cell culture techniques, direct immunogold silver staining(D-IGSS), reverse transcriptase(RT)assay, XC syncytium assay，and electron microscopy were employed to evaluate retrovirus associated antigens(RVAAgs), RT activities, CPE， and virus particles of both leukemic cells and normal hematopoietic cells. Results RVAAgs were detected by D-IGSS in 50.0% of fresh AML cell samples and 87.5% of cultured AML samples. RT assay showed that RVAAg-positive samples from 14 cases simultaneously expressed RT activities, and XC syncytium assay also revealed positive results. Electron microscopy demonstrated typical type C retrovirus particles at various maturation in 75% of cultured leukemic cell samples. In contrast, neither RVAAgs and RT activity nor syncytium and virus particles were detected in normal controls. Conclusions AML cells harbor the entire genome(s) of retrovirus(es), which could release into extracellular spaces in intact particles via budding from the target cells stimulated in vitro by appropriate RV inducing agents. The exact relationship between these viruses and AML etiology is uncertain and needs further study.
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【Key words】 Human acute myeloid leukemia Etiology Retroviridae infection
(Natl Med J China, 1998, 78：504-507)
一些自发性哺乳类动物白血病早已被证实是由逆转录病毒(RV)感染引起[1]。80年代初，成人T淋巴细胞白血病也已确认由逆转录病毒成人T淋巴细胞白血病病毒(HTLV-1)感染所致[2]。然而，与人类普通白血病有关的病毒至今仍未得到证实。近年来已初步证实，急性白血病患者的白血病细胞中含有可诱导的逆转录病毒相关抗原与逆转录酶，而相应正常造血细胞则阴性[3]。为了进一步明确急性髓系白血病(AML)是否与逆转录病毒感染有关，本研究采用新的培养体系与逆转录病毒诱导剂对32例AML患者的白血病细胞进行体外培养与逆转录病毒诱导，对AML细胞中可能存在的逆转录病毒进行系统分析，以期为AML病毒病因学提供直接证据。
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对象与方法
一 、对象
1.AML组：AML患者32例，男18例，女14例，平均年龄38.3岁。所有病例均按FAB分型标准诊断，其中M01例，M12例，M2 4例，M3 5例，M4 7例，M512例，M71例。
2.对照组：为20名健康供者。男12名，女8名，平均年龄40.16岁。
二、方法
1.细胞培养：无菌取AML患者外周血或骨髓液或正常健康人外周血2～5 ml，肝素抗凝，用Ficoll-Hypaque介质(ρ=1.077±0.002g/ml)进行密度梯度离心分离白血病细胞或正常人外周血单个核细胞(PBMNCs)。经RPMI-1640培养液(补加20%热灭活56℃，30分钟特级新生小牛血清和1%青链霉素)洗涤2次后，用完全培养液将细胞密度调至(1～2)×106/ml，补加造血细胞生成因子(HGFs)：rhIL-2(100 U/ml)，rhIL-3(100 U/ml)，rhIL-6(100 U/ml)，rhGM-CSF(100 U/ml)，rhbFGF(100 ng/ml)及诱导剂至所需浓度，放入玻璃细胞培养瓶中，置37℃细胞培养箱恒温培养7天。培养期间每天用倒置显微镜观察与记录细胞生长情况，并根据需要及时更换培养液，HGFs和诱导剂。
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2.逆转录病毒相关抗原测定：应用直接免疫金银染色法(D-IGSS)[3]。
3.病毒逆转录酶活性(RTA)测定：采用非同位素法，详细方法参见文献[4，5]。
4.合胞体形成试验：参照文献[6]，略加修改。XC细胞购于上海医科大学病理生理教研室(来自美国加州大学)，用含10%小牛血清RPMI-1640培养液培养，每隔3天传代一次。取待测细胞样本经紫外线照射10 秒钟后加入待用XC细胞培养瓶内，同时补加Polybrene(4 μg/mL，美国Sigma公司)置37℃细胞培养箱混合培养48～72小时，然后，用甲醇固定，Wright-Giemsa 染色，光学显微镜下观察合胞体(多核巨细胞)形成情况。XC细胞自身不产生合胞体。
5.透射电子显微镜观察：培养前后的细胞样本进行常规戊二醛，锇酸双固定，环氧树脂包埋，超薄切片，铀铅双染色，用JEM-1200EX电镜仔细观察与拍摄病毒及相关结构照片。
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6.病毒颗粒分离纯化与鉴定：应用低温(4℃)超速蔗糖密度梯度离心(100 000g，18小时)，具体方法参见文献[7]。
7.免疫金探针制备：参照文献[3]。
结 果
一、 逆转录病毒相关抗原(RVAAg)表达
在AML组中，培养细胞样本RVAAg检出率和阳性细胞百分率均值分别为50.0%(16/32)和12.0%，而培养后分别为87.5%(28/32)和52.8%。经统计学分析，培养前后RVAAg阳性检出率和阳性细胞百分率均值差异均有非常显著意义。20名健康者PBMNCs培养前后均未检出RVAAg。
二、病毒性逆转录酶活性测定
14例AML患者及10名正常对照者培养前后RVAAg阳性细胞样本逆转录酶活性测定结果见图1，RVAAg阳性AML样本不仅同时表达逆转录酶活性，而且AML细胞RVAAg表达水平与逆转录酶活性呈显著正相关(γ=0.90)，而10名正常对照PBMNCs样本未测出逆转录酶活性。
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图1 AML细胞培养后RVAAg含量和RT活性增加倍数相关性分析
三、XC细胞合胞体形成试验结果
为证实RVAAg和逆转录酶阳性样本是否含有感染性与致病性的病毒颗粒，对其中12例RVAAg和逆转录酶均阳性的AML细胞样本进行XC细胞合胞体形成试验。结果12例样本均可见典型的合胞体。20名正常PBMNCs合胞体形成试验阴性。
四、 透射电镜观察结果
在未经培养的20例AML样本，仅1例可见典型的逆转录病毒颗粒(RVP)，且数量少，单个散在分布。经体外7天培养与诱导后，其中15例AML样本中观察到RVP。分布于胞内空泡中或胞外间隙。大多数RVP以成熟或不成熟形式存在，也可见处于不同发育阶段的芽生。RVP呈球形，平均直径约100 nm。成熟的病毒粒子呈双层囊膜结构，内含一个位于中心位置的球形电子致密核心，而未成熟的RVP则无致密核心。部分样本的病毒颗粒的电镜照片见图2～6。根据这些形态学特征结合以下鉴定结果，RVP属于C型逆转录病毒。而正常对照未见类似病毒颗粒。
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五、病毒颗粒的分离纯化与鉴定结果
对部分AML细胞培养物进行逆转录病毒分离，纯化与初步鉴定结果为在蔗糖密度梯度超速离心中
图2 白血病细胞胞浆空泡内可见成堆的不同成熟期的病毒颗粒 图3 为图2的局部放大，箭头所指为正在出芽的病毒颗粒
图4 胞浆空泡内可见一典型的晚期芽生病毒颗粒，病毒囊膜与拟核之间隐约可见一层细小间隙 图5 细胞外成熟的病毒颗
粒，病毒囊膜与拟核之间可见一层细小间隙 图6 细胞外正在出芽的病毒颗粒
病毒颗粒主要集中在1.15～1.18 g/ml区带，逆转录酶阳性。纯化的病毒能利用自身模板与引物合成cDNA(结果另文报道)。电镜负染技术显示，纯化的病毒颗粒形态与细胞超薄切片中观察到的一致。
, 百拇医药
讨 论
分析以往的研究资料，我们认为普通白血病病毒至今未能成功分离与鉴定可能与以下一些因素有关：(1)逆转录病毒感染具有其独特的生物学特征，病毒通常以单拷贝前病毒(provirus)形式稳定地整合于靶细胞的基因组中，并且随靶细胞的分裂增殖而传递给子代细胞[8]；(2)病毒转化细胞效率极高，如大鼠红白血病病毒只需1～10拷贝mRNA即可使靶细胞完全转化；(3)逆转录病毒的增殖与复制需要靶细胞处于增殖与分裂周期[8]，而目前常用细胞培养技术还不能使大部分白血病患者的原代白血病细胞在体外长期大量扩增；(4)病毒颗粒在体外极不稳定，在37℃其半衰期仅为2.5小时；(5)机体被病毒感染后，其免疫系统通常会产生相应的抗体封闭靶细胞上的病毒抗原，并抑制病毒表达与复制，使得新鲜靶细胞上的病毒抗原检出率极低[9]。本研究应用我们新近建立的适合于AML细胞体外长期生长的培养体系和病毒诱导剂对AML 细胞中可能存在的逆转录病毒进行扩增，然后，从以下几个方面对AML细胞中可能存在的逆转录病毒进行仔细检测与分析。(1)根据不同RV 之间存在共同抗原表位特点，利用HTLV-I多克隆抗体结合敏感特异的D-IGSS 技术同时检测AML患者白血病细胞和正常健康人PBMNCS表明，RVAAg仅在AML白血病细胞中表达；(2)对部分RVAAg阳性AML样本和正常对照样本的逆转录酶活性测定结果证实，与RVAAg的表达具有良好的正相关关系，进一步证实AML细胞中检出的抗原为逆转录病毒源性，而不是由于非特性的细胞分子模拟所致；(3)合胞体试验是用于检测逆转录病毒感染的经典方法之一。其原理是，逆转录病毒env基因表达的糖蛋白具有融合靶细胞而形成多核巨细胞的能力，是病毒感染靶细胞特征性致细胞病变效应(CPE)。本研究用XC细胞系作为指示性靶细胞来检测AML细胞中可能感染的逆转录病毒，证实AML细胞样本能与XC细胞形成典型的多核巨细胞即合胞体，而正常对照无类似现象；(4)应用电子显微镜进行细胞超微结构水平寻找病毒颗粒及其相关结构是证实逆转录病毒感染最直接证据方法之一，结果显示AML细胞中含有典型的C型逆转录病毒颗粒，而正常对照样本未见类似病毒颗粒。表明，急性髓系白血病患者白血病细胞中含有完整的逆转录病毒基因组，在适宜的环境下能感染合适的靶细胞，表达各种病毒蛋白如RVAAg、逆转录酶、囊膜糖蛋白等，并且，能组装完整的病毒颗粒释放到细胞外间隙(培养液及小牛血清逆转录病毒检测均阴性，可排除污染可能性)。相应正常造血细胞培养前后逆转录病毒检测结果均阴性，提示AML细胞中发现的逆转录病毒可能是外源性。目前，有关这些病毒与AML病因学之间的确切关系尚不清楚，有待进一步研究与阐明。
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参考文献
1 Vogt PK.Human T-cell leukemia/lymphoma virus-an introduction. In: Vogt PK. eds. Current topics in microbiology and immunology. New York: Springer-Verlag, 1980, 115：1-5.
2 Poiesz B J,Ruscetti F W,Gazdar A F, et al.Detection and isolation of type C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma.Proc Natl Acad Sci USA,1980,77：7415-7419.
, 百拇医药 3 王炜琴，徐荣臻，张克奇，等.人急性白血病HTLV-1相关抗原和逆转录酶活性的初步研究.浙江医学，1997，19：1-3.
4 Porstman T, Merssner K, Glaser R, et al. A sensitive non-isotopic assay specific for HIV-I associated reverse transcriptase. J Virol Methods, 1991, 31：181-188.
5 Urabe T,Sano K,Tanno M,et al. A non-radioisotopic reverse transcriptase assay using biotin-11-deoxyuridine triphosphate on primer-immobilized microtiter plates.J Virol Methods,1992,40：145-154.
, 百拇医药
6 Bastian I,Gardner J,Webb D,et al. Isolation of a human T-lymphotropic virus type I strain from Australian aboriginals. J Virol, 1993, 67：843-851.
7 Mak TW,Manaster J,Howatson, A F,et al.Particles with characteristics of leukoviruses in cultures of marrow cells from leukemic patients in remission and relapse. Proc Natl Acad Sci USA, 1974, 71：4336-4340.
8 Brown P O,Bowerman B,Varmus H E,et al. Correct integration of retroviral DNA in vitro.Cell,1987, 49：347-356.
9 Tochikura T,Iwahashi M, Matsumoto T,et al. Effect of human serum anti-HTLV-1 antibodies on viral antigen induction in vitro cultured peripheral lymphocytes from adult T-cell leukemia patients and healthy virus carries. Int J Cancer, 1985, 36：1-7.
本课题为国家自然科学基金资助项目
(收稿：1997-07-22 修回：1998-03-10), 百拇医药