莱姆病螺旋体中国分离株外膜蛋白C基因的克隆与序列分析
作者：佟玉品 杨新科 冯方波 汪治清 周国萍
单位：100094 北京军区第二六一医院临床实验科(佟玉品、冯方波、周国萍)；中国预防医学科学院病毒学研究所(杨新科、汪治清)
关键词：疏螺旋体，伯氏；膜蛋白类；基因；克隆，分子；序列分析
中华医学杂志980729 【摘要】 目的 了解引起我国莱姆病的伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)基因变异情况。方法 应用聚合酶链反应从2株莱姆病螺旋体中国分离株BT01和BJ-9011全基因组DNA中将OspC基因调出，并插入质粒pGEM-3ZF(+)中，构建重组质粒pGEM-3ZF(+)-OspC，经Sanger双脱氧末端终止法测序，并将之与国外其它分离株进行同源性比较。结果 除信号肽序列外，2株莱姆病螺旋体分离株BT01和BJ-9011的OspC基因依次为579 bp和576bp，分别编码193和192氨基酸，两者核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为86%和83%，与国外分离株(PBi、PKo及B31)的同源性均较高，其中BJ-9011株与国际标准株B31株之间核苷酸及氨基酸同源性达99%。结论 伯氏疏螺旋体OspC基因在国内2个分离株之间存在一定差异，其与国外分离株之间也存在一定差异。
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Molecular cloning and DNA sequencing of OspC gene of two strains Borrelia burgdorferi isolated in China Tong Yupin, Yang Xinke, Feng Fangbo, et al. Department of Experimental Medicine, 261 Hospital of PLA, Beijing 100094
【Abstract】 Objective To investigate the variation of OspC gene in two Chinese isolates of Borrelia burgdorferi.Methods PCR technique was used to amplify the OspC gene from the whole cellular DNA of isolates BT01 and BJ-9011. The amplified products were inserted into plasmid pGEM-3ZF(+) and sequenced. Results Except the signal peptide, the OspC genes of the two isolates BT01 and BJ-9011 were 579bp and 576bp which encode 193,192 amino acids respectively. The nucleotide and amino acids sequence identity between the two strains was 86% and 83%. High homology exists between these Chinese isolates and several foreign isolates (PBi, PKo, B31), especially in BJ-9011. It had 99% nucleotide and amino acid sequence identitfied with B31. Conclusion Variations in OspC genes are noted between the two Chinese Borrelia burgdorferi isolates and foreign isolates.
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【Key words】 Borrelia burgdorferi Membrane proteins Genes Cloning, molecular Sequence analysis
(Natl Med J China, 1998, 78：551-553)
莱姆病螺旋体外膜蛋白C(OspC)是具有很强的抗原活性，纯化抗原及重组抗原已应用于莱姆病的早期诊断并在动物实验中发现其有免疫保护作用，可望成为疫苗研制的候选蛋白[1，2]。伯氏疏螺旋体株间变异较大，研究中需考虑其株间差异。我们参照国外文献报道的PKo株OspC基因序列，设计合成一对寡核苷酸引物，应用PCR技术从国内2株螺旋体中调出该基因，并进行克隆与序列测定。
材料与方法
1.菌株培养与基因组DNA制备：两株伯氏疏螺旋体BT01为北京西山地区长角血蜱分离株，BJ-9011为一莱姆病患者血液分离株[3，4]。均由本室保存培养，暗视野显微镜下观察其生长情况，离心收集菌体，按常规方法制备基因组DNA。
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2.质粒和菌种：宿主菌大肠杆菌DH5α和JM101株由病毒基因工程国家重点实验室提供。pGEM-3ZF(+)质粒购自美国Promega公司。
3.主要试剂：EcoRⅠ和BamHⅠ等内切酶为美国New England Biolabs 公司产品，T4 DNA连接酶、蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、dNTP、X-gal、异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)等为美国Promega公司产品，其它主要生化试剂为美国Promega公司、Sigma公司产品或国产分析纯。
4.引物设计：PCR引物参照文献[5]的PKo株OspC基因序列自行设计，上游引物：5′-GCGAATTCATGTGTAATAATTCAGGGA 3′，下游引物：5′-GCGGATCCTTAAGGTTTTTTTGGA 3′，由中国科学院微生物学研究所合成。上下游引物分别含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，扩增片段为除信号肽外的OspC基因，长度约为579 bp。
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5.2株螺旋体OspC基因PCR扩增及重组质粒的构建：参照文献[6]分别以2株螺旋体基因组DNA为模板进行PCR，用透析袋电洗脱法回收PCR产物，用EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶切，同时将质粒pGEM-3ZF(+)以同样酶进行双酶切，回收后用T4 DNA 连接酶连接，转化大肠杆菌JM101，初步经蓝/白斑筛选阳性的克隆用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切鉴定。
6.DNA 序列测定：将酶切证实的重组质粒转化大肠杆菌DH5α。采用Sanger双脱氧末端终止法和pGEM-3ZF(+)克隆-模板系统，由军事医学科学院生物工程研究所在美国ABI产373A型自动测序仪上进行，同一片段进行正反两方向测序。
结 果
一、螺旋体OspC基因扩增及重组质粒鉴定
设计引物对2株国内螺旋体均能扩增出580 bp左右的扩增带，插入pGEM-3ZF(+)质粒后均能用EcoRⅠ和BamHⅠ切下与扩增带相同大小的片段，且重组质粒应用PCR方法均能扩增出580 bp左右的扩增带(图1)。
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M.λDNA/EcoRI+HindⅢ; 1.BT01-PCR；2.BJ-9011-PCR；3.pGEM-3ZF
(+)BT01/EcoRI+HindⅢ; 4. pGEM-3ZF(+)-BJ-9011/EcoRI
+HindⅢ；5.pGEM-3ZF(+)/EcoRI+HindⅢ
图1 2株莱姆病螺旋体OspC-PCR与重组质粒的酶切鉴定
二、2株螺旋体OspC基因序列核苷酸、氨基酸分析及其与国外株同源性比较
经序列测定，除信号肽序列下，BT01株OspC基因为579 bp，编码193氨基酸，核苷酸同源性与Pko最大，为86%，与Pko株氨基酸同源性为83%，与B31株为86%。BJ-9011株OspC基因为576 bp，编码192氨基酸，与B31株核苷酸同源性及氨基酸同源性皆为99%，其序列中只有2个碱基变异，一个位于第147 bp处，读码框架为TCC (B31为TCT)，编码丝氨酸(S)与 B31株一致。另一个位于第443 bp，读码框架为ATT，编码异亮氨酸(I)，而B31为ACT，编码苏氨酸(T)。2株螺旋体之间核苷酸同源性为83%，氨基酸同源性为86%(图2，3)。
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图2 克隆的莱姆病螺旋体中国株BJ-9011OspC基因
部分核苷酸序列分析
图3 克隆的莱姆病螺旋体中国株BT01 OspC基因
部分核苷酸序列分析
讨 论
OspC为一种莱姆病免疫诊断及免疫预防很有前景的蛋白，国外已经对多株伯氏疏螺旋体OspC基因成功地进行克隆并表达了重组蛋白。我们在引物设计时参照PKo株将编码信号肽的57个碱基舍去，实际扩增580 bp左右的OspC基因，结果2株国内螺旋体分离株均能成功地调出该基因，不仅如此，本PCR反应体系可以检测出10 fg的螺旋体DNA，又可为莱姆病诊断提供一敏感检测方法。
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本实验表明，2株国内伯氏疏螺旋体OspC基因与国外其它株同源性较高，尤其是BJ-9011株，与国际标准株B31株除信号肽外皆为576 bp核苷酸，编码192个氨基酸，两者之间只有2个碱基差异，也只导致一个氨基酸变化，这与本实验室以前报道BJ-9011株与B31株有相似的免疫反应性及SDS-PAGE电泳图谱吻合[4]，提示两者属于同一基因型。而BT01株与PKO株核苷酸同源性最大，为86%，其前192个碱基同源性达96%；氨基酸同源性前49位氨基酸为100%，全序列为83%。BT01株与BJ-9011株核苷酸和氨基酸同源性分别为86%及83%。
本研究表明，国内2株螺旋体之间及其与国外株之间均存在一定差异，该基因的成功克隆及序列测定，为今后OspC基因表达、重组蛋白制备及在国内开展莱姆病免疫诊断及疫苗研究奠定了基础。
参考文献
1 Preac-Mursic V, Wilske B, Patsouris E, et al. Active immunization with pC protion of Barrelia burgdorferi protects gerbils against Borrelia burgdorferi infection. Infection, 1992, 20：342-349.
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2 Theisen M, Frederiksen B, Lebech A M, et al. Polymorphism in OspC gene of Borrelia burgdorferi and immunoreactivity of OspC protion: implications for taxnomy and for use of OspC protion as a diagnostic antigen. J Clin Microbiol, 1993, 31：2570-2576.
3 张薇芬，周国萍，冯方波，等.北京西山地区莱姆病螺旋体的主要生物媒介调查.中国公共卫生，1993，9：60-62.
4 张薇芬，周国萍，冯方波，等.从一例白癜风患者血液中分离出莱姆病病原体.中华医学检验杂志，1992，15：94-96.
5 Fuchs R, Jauris S, Lottspeich F, et al. Molecular analysis and expression of a Borrelia burgdorferi gene encoding a 22kDa protion (pC) in Escherchia coli. Mol Microbi, 1992, 6：503-509.
6 Sambrook J, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.34-75.
(收稿：1997-09-08 修回：1998-04-10), 百拇医药
单位：100094 北京军区第二六一医院临床实验科(佟玉品、冯方波、周国萍)；中国预防医学科学院病毒学研究所(杨新科、汪治清)
关键词：疏螺旋体，伯氏；膜蛋白类；基因；克隆，分子；序列分析
中华医学杂志980729 【摘要】 目的 了解引起我国莱姆病的伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)基因变异情况。方法 应用聚合酶链反应从2株莱姆病螺旋体中国分离株BT01和BJ-9011全基因组DNA中将OspC基因调出，并插入质粒pGEM-3ZF(+)中，构建重组质粒pGEM-3ZF(+)-OspC，经Sanger双脱氧末端终止法测序，并将之与国外其它分离株进行同源性比较。结果 除信号肽序列外，2株莱姆病螺旋体分离株BT01和BJ-9011的OspC基因依次为579 bp和576bp，分别编码193和192氨基酸，两者核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为86%和83%，与国外分离株(PBi、PKo及B31)的同源性均较高，其中BJ-9011株与国际标准株B31株之间核苷酸及氨基酸同源性达99%。结论 伯氏疏螺旋体OspC基因在国内2个分离株之间存在一定差异，其与国外分离株之间也存在一定差异。
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Molecular cloning and DNA sequencing of OspC gene of two strains Borrelia burgdorferi isolated in China Tong Yupin, Yang Xinke, Feng Fangbo, et al. Department of Experimental Medicine, 261 Hospital of PLA, Beijing 100094
【Abstract】 Objective To investigate the variation of OspC gene in two Chinese isolates of Borrelia burgdorferi.Methods PCR technique was used to amplify the OspC gene from the whole cellular DNA of isolates BT01 and BJ-9011. The amplified products were inserted into plasmid pGEM-3ZF(+) and sequenced. Results Except the signal peptide, the OspC genes of the two isolates BT01 and BJ-9011 were 579bp and 576bp which encode 193,192 amino acids respectively. The nucleotide and amino acids sequence identity between the two strains was 86% and 83%. High homology exists between these Chinese isolates and several foreign isolates (PBi, PKo, B31), especially in BJ-9011. It had 99% nucleotide and amino acid sequence identitfied with B31. Conclusion Variations in OspC genes are noted between the two Chinese Borrelia burgdorferi isolates and foreign isolates.
, 百拇医药
【Key words】 Borrelia burgdorferi Membrane proteins Genes Cloning, molecular Sequence analysis
(Natl Med J China, 1998, 78：551-553)
莱姆病螺旋体外膜蛋白C(OspC)是具有很强的抗原活性，纯化抗原及重组抗原已应用于莱姆病的早期诊断并在动物实验中发现其有免疫保护作用，可望成为疫苗研制的候选蛋白[1，2]。伯氏疏螺旋体株间变异较大，研究中需考虑其株间差异。我们参照国外文献报道的PKo株OspC基因序列，设计合成一对寡核苷酸引物，应用PCR技术从国内2株螺旋体中调出该基因，并进行克隆与序列测定。
材料与方法
1.菌株培养与基因组DNA制备：两株伯氏疏螺旋体BT01为北京西山地区长角血蜱分离株，BJ-9011为一莱姆病患者血液分离株[3，4]。均由本室保存培养，暗视野显微镜下观察其生长情况，离心收集菌体，按常规方法制备基因组DNA。
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2.质粒和菌种：宿主菌大肠杆菌DH5α和JM101株由病毒基因工程国家重点实验室提供。pGEM-3ZF(+)质粒购自美国Promega公司。
3.主要试剂：EcoRⅠ和BamHⅠ等内切酶为美国New England Biolabs 公司产品，T4 DNA连接酶、蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、dNTP、X-gal、异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)等为美国Promega公司产品，其它主要生化试剂为美国Promega公司、Sigma公司产品或国产分析纯。
4.引物设计：PCR引物参照文献[5]的PKo株OspC基因序列自行设计，上游引物：5′-GCGAATTCATGTGTAATAATTCAGGGA 3′，下游引物：5′-GCGGATCCTTAAGGTTTTTTTGGA 3′，由中国科学院微生物学研究所合成。上下游引物分别含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，扩增片段为除信号肽外的OspC基因，长度约为579 bp。
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5.2株螺旋体OspC基因PCR扩增及重组质粒的构建：参照文献[6]分别以2株螺旋体基因组DNA为模板进行PCR，用透析袋电洗脱法回收PCR产物，用EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶切，同时将质粒pGEM-3ZF(+)以同样酶进行双酶切，回收后用T4 DNA 连接酶连接，转化大肠杆菌JM101，初步经蓝/白斑筛选阳性的克隆用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切鉴定。
6.DNA 序列测定：将酶切证实的重组质粒转化大肠杆菌DH5α。采用Sanger双脱氧末端终止法和pGEM-3ZF(+)克隆-模板系统，由军事医学科学院生物工程研究所在美国ABI产373A型自动测序仪上进行，同一片段进行正反两方向测序。
结 果
一、螺旋体OspC基因扩增及重组质粒鉴定
设计引物对2株国内螺旋体均能扩增出580 bp左右的扩增带，插入pGEM-3ZF(+)质粒后均能用EcoRⅠ和BamHⅠ切下与扩增带相同大小的片段，且重组质粒应用PCR方法均能扩增出580 bp左右的扩增带(图1)。
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M.λDNA/EcoRI+HindⅢ; 1.BT01-PCR；2.BJ-9011-PCR；3.pGEM-3ZF
(+)BT01/EcoRI+HindⅢ; 4. pGEM-3ZF(+)-BJ-9011/EcoRI
+HindⅢ；5.pGEM-3ZF(+)/EcoRI+HindⅢ
图1 2株莱姆病螺旋体OspC-PCR与重组质粒的酶切鉴定
二、2株螺旋体OspC基因序列核苷酸、氨基酸分析及其与国外株同源性比较
经序列测定，除信号肽序列下，BT01株OspC基因为579 bp，编码193氨基酸，核苷酸同源性与Pko最大，为86%，与Pko株氨基酸同源性为83%，与B31株为86%。BJ-9011株OspC基因为576 bp，编码192氨基酸，与B31株核苷酸同源性及氨基酸同源性皆为99%，其序列中只有2个碱基变异，一个位于第147 bp处，读码框架为TCC (B31为TCT)，编码丝氨酸(S)与 B31株一致。另一个位于第443 bp，读码框架为ATT，编码异亮氨酸(I)，而B31为ACT，编码苏氨酸(T)。2株螺旋体之间核苷酸同源性为83%，氨基酸同源性为86%(图2，3)。
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图2 克隆的莱姆病螺旋体中国株BJ-9011OspC基因
部分核苷酸序列分析
图3 克隆的莱姆病螺旋体中国株BT01 OspC基因
部分核苷酸序列分析
讨 论
OspC为一种莱姆病免疫诊断及免疫预防很有前景的蛋白，国外已经对多株伯氏疏螺旋体OspC基因成功地进行克隆并表达了重组蛋白。我们在引物设计时参照PKo株将编码信号肽的57个碱基舍去，实际扩增580 bp左右的OspC基因，结果2株国内螺旋体分离株均能成功地调出该基因，不仅如此，本PCR反应体系可以检测出10 fg的螺旋体DNA，又可为莱姆病诊断提供一敏感检测方法。
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本实验表明，2株国内伯氏疏螺旋体OspC基因与国外其它株同源性较高，尤其是BJ-9011株，与国际标准株B31株除信号肽外皆为576 bp核苷酸，编码192个氨基酸，两者之间只有2个碱基差异，也只导致一个氨基酸变化，这与本实验室以前报道BJ-9011株与B31株有相似的免疫反应性及SDS-PAGE电泳图谱吻合[4]，提示两者属于同一基因型。而BT01株与PKO株核苷酸同源性最大，为86%，其前192个碱基同源性达96%；氨基酸同源性前49位氨基酸为100%，全序列为83%。BT01株与BJ-9011株核苷酸和氨基酸同源性分别为86%及83%。
本研究表明，国内2株螺旋体之间及其与国外株之间均存在一定差异，该基因的成功克隆及序列测定，为今后OspC基因表达、重组蛋白制备及在国内开展莱姆病免疫诊断及疫苗研究奠定了基础。
参考文献
1 Preac-Mursic V, Wilske B, Patsouris E, et al. Active immunization with pC protion of Barrelia burgdorferi protects gerbils against Borrelia burgdorferi infection. Infection, 1992, 20：342-349.
, http://www.100md.com
2 Theisen M, Frederiksen B, Lebech A M, et al. Polymorphism in OspC gene of Borrelia burgdorferi and immunoreactivity of OspC protion: implications for taxnomy and for use of OspC protion as a diagnostic antigen. J Clin Microbiol, 1993, 31：2570-2576.
3 张薇芬，周国萍，冯方波，等.北京西山地区莱姆病螺旋体的主要生物媒介调查.中国公共卫生，1993，9：60-62.
4 张薇芬，周国萍，冯方波，等.从一例白癜风患者血液中分离出莱姆病病原体.中华医学检验杂志，1992，15：94-96.
5 Fuchs R, Jauris S, Lottspeich F, et al. Molecular analysis and expression of a Borrelia burgdorferi gene encoding a 22kDa protion (pC) in Escherchia coli. Mol Microbi, 1992, 6：503-509.
6 Sambrook J, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.34-75.
(收稿：1997-09-08 修回：1998-04-10), 百拇医药