食管癌患者O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶基因多态性研究*
作者：王立东 邹建湘 洪钧言 周 琦
单位：
关键词：食管肿瘤/遗传学；多态现象(遗传学)；鸟嘌呤/遗传学；脱氧核糖核酸，肿瘤/遗传学；基因表达调控，肿瘤
华人消化杂志/980704 中国图书资料分类号 R735.102.319
摘要 目的 检测中国食管癌高发区居民和高加索居民AGT(O6-alkylguanine alkyltrasferase)的基因多态改变. 方法 采用PCR-SSCP和DNA测序方法对河南食管癌高发区居民和高加索居民的癌组织和非癌组织进行基因多态分析. 结果 多态变异发生于第5外显子的143位密码子，并导致该位点的异亮氨酸(AGT)被缬氨酸(GTC)取代，且143位密码子与178位密码子的多态改变有一定联系. 对90例中国食管癌高发区居民的食管癌患者的检测发现，2例(2%)存在143/178密码子同时出现多态变异，同一地区的60例正常居民中，无一例检测到该类型多态现象，但28例高加索居民非癌患者中的6例(21%)也携带有这种多态等位基因. 此外，作者还证实河南食管癌高发区人群中存在第84位密码子基因多态变异，最近在日本居民中也发现这种变化. 这种多态变化导致亮氨酸(CTT)变为苯丙氨酸(TTT). 84位密码子的多态变异在中国食管癌患者、中国和高加索非癌患者中的检出率分别为16%，20%和36%，该多态改变与143/178密码子多态改变同时发生的现象只在1例高加索人DNA中被检出.
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结论 AGT多态改变可能与食管癌的发生有关，其多态分布可能存在种族差异.
0 引言
外界环境中的致癌物和致突变物(包括N-亚硝基化合物)，不少属于烷基化合物，烷基化制剂也是一种重要的肿瘤化疗药物. O6-烷基化鸟嘌呤是由烷基化学物诱导产生的重要的DNA突变前损伤产物，如果未能及时修复，在进行DNA复制时，O6-烷基化鸟嘌呤则倾向于同胸腺嘧啶配对，而不同胞嘧啶配对，并导致碱基对GC转换为AT. DNA中O6-烷基化鸟嘌呤的形成和存在对突变发生、肿瘤形成[1]及氯乙基亚硝基脲等化疗药物诱导的细胞毒作用均有重要影响. DNA修复蛋白O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)能特异性地修复DNA中的O6-烷基鸟嘌呤加合物. 人AGT基因包含5个外显子，170多个kb，其编码序列起始于第2外显子，第5外显子的半胱氨酸145为其活性位点[2]. AGT在保护细胞免受烷基化试剂所致的突变和癌变方面起着关键作用. 过度表达AGT的转基因鼠可免患烷基致癌剂诱导的肿瘤[3]，无AGT活性的小鼠对甲基亚硝基脲的致癌效应尤其敏感[4]. AGT亦可影响肿瘤细胞对烷基化疗药物的敏感性[1，5]，尤其是对诸如卡氮介等氯乙基制剂的敏感性[5]. Belanich et al[6]在一项回顾性研究中发现，AGT活性高的脑肿瘤患者，用卡氮芥治疗时，疗效较差，常常短时间内治疗失败、死亡. 我们采用PCR-SSCP和DNA测序，检测和分析了AGT中的基因多态性，以探讨AGT多态现象与肿瘤易感性和烷基制剂毒性的相互关系.
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1 材料和方法
1.1 主要试剂 PCR试剂盒和dNTP购自Gibco/BRL(Grand Island, NY)和Pharmacia(Piscataway, NJ)，Nusieve和Seakem agarose购自FMC(Rockland, ME). TA克隆试剂盒购自Invitrogen(San Diego, CA)， Sequenase Version 2.0试剂盒和35S-dATP来自Amersham(Arlington Heights, IL). 限制性内切酶来自英格兰的Biolabs(Beverley, MA)，蛋白酶K来自Sigma(St.Lacis, MO).
1.2 组织样本的处理 原发性食管癌组织来自林州市人民医院1991/1995的部分手术切除标本，用950mL/L酒精固定. 患者的平均年龄为56岁±8岁. 血凝块取自作为对照研究的居住在同一地区的非癌志愿者. 血块制备方法为：将大约50μL血液吸附在一张Whatman滤纸上，干燥后-20℃保存. 对照组平均年龄为51岁±15岁. 高加索人组织样本取自食管和肝脏，它们均是因事故而致死的非癌患者组织，由美国国家疾病研究交流中心提供(Philadelphia, PA).
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1.3 DNA制备 用500μL溶解缓冲液消化(含50mmol/L Tris/HCl， pH 8.5，1mmol/L EDTA，2g/L SDS，200g/L蛋白酶K)肝脏或食管肌肉组织(100mg)，并置于振荡器内55℃过夜. 用isopropanol使消化液中的DNA沉淀，再用700mL/L的酒精冲洗沉淀的DNA大分子，将DNA大分子(50μg～100μg)溶于300μL～500μL TE缓冲液，每次取约10ng～100ng DNA基因作PCR. 血凝块采用相同方法消化，消化后的DNA大分子溶于20μL水内，每次取1μL该溶液作PCR分析.
1.4 PCR扩增 对AGT基因的4个编码外显子(2～5)分别进行PCR扩增，所用引物为Gibco/BRL(Grand Island, NY)合成的非特异PCR引物. 引物序列根据已确定的人AGT基因CDNA和内含子/外显子连接序列设计：5＇-CCTATACDCTTTGTCTTAAAAATTA和5＇-ATACTTACTCAGCTGCAGACG用于第2外显子，预计产物大小为182bp；5＇-CCAGAGGTTTACTAAGCCCC和5＇-TTACCGACCTTGCTGGAAAAC用于第3外显子，预计产物大小为194bp；5＇-GTCCAAATAACATTATCCGAC和5＇-GAACTCACAGGATTGCCTCT用于第4外显子，预计产物大小为183bp；5＇-GACAGTGGCTGCCCCCCTGT和5＇-CCCAGGACACTGCCACTTCCT用于第5外显子，预计产物大小为393bp. PCR反应在Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 2400中进行(Norwalk, CT)，按照说明书提示，加热以启动反应，25μL的PCR反应液中包括20mmol/L Tris-HCl, pH 8.4,50mmol/LKCl, 1.5mmol/L MgCl2, 0.1mmol/L dNTPs和1个单位的Amplitaq. 反应开始前先加热到94℃ 3min，然后在94℃ 3s内循环35次，58℃～64℃(根据不同引物的退火温度确定)30s，72℃ 30s，最后在72℃将反应时间延长至7min. 取5mL反应液置于30g/L Nusieve/Seakem(2∶1)凝胶上电泳，经溴化乙锭染色后PCR产物在UV下是可见的.
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1.5 SSCP分析 取5μL PCR产物与15μL变性缓冲液混合(0.4μL 1mol/L 甲基汞氢氧化物，12.6μL 1.25 x TBE，2μL 150mL/L Ficoll-内含1g/L溴酚兰和1g/L cyanol二甲苯兰)，室温孵育10min，加热至95℃3min，低温保存后置于200g/L TBE polyacrylamide凝胶上，电泳在Thermoflow SSCP Syctem (Novex, San Diego, CA)，300V电压下进行，时间为4h～5h ，电泳过程中用温度调控器(Neslab, Portsmouth, NH)将温度维持在10℃或20℃. 凝胶用溴化乙锭染色，并在UV下观察结果. 为确保SSCP分析所检测到的突变不是由PCR扩增过程中的随机错配所致，对在SSCP分析中显示了移动带的样本，要重新进行包括PCR扩增过程在内的重复试验，并只对那些结果具有再现性的样本进行DNA测序.
1.6 PCR产物的克隆和测序 PCR产物的测序方法有2种，其一是按照以前的描述采用PCR直接测序法[7]；其二是先将PCR产物置入TA克隆载体，再用Amersham Sequenase Version 2.0试剂盒进行测序. 最后用自动测序机(Piscataway, NJ)，对检出有序列改变的DNA样本进行测序，以验证观察到的结果.
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1.7 限制性消化 AGT基因第84密码子的多态改变，使得其第3外显子的SapI和EarI限制位置消失. 为了进行大样本量筛选，作者建立了一种相应的RFLP检测方法，此方法可区分野生型等位基因及其变体. 第5外显子的PCR扩增产物用SapI或EarI消化，37℃过夜，然后置于30g/L Nusieve/Seakem(2∶1)agrose凝胶或60g/L polyacrylamide凝胶上，电泳后凝胶用溴化乙锭染色，并在UV下观察结果.
2 结果
来自AGT基因4个外显子的PCR扩增产物均作低温下SSCP分析(此为常用的突变筛选方法)，电泳时温度控制是影响SSCP敏感性的关键因素，不同DNA片段应尽可能调试在最适温度下进行电泳. 如，作者观察到AGT基因第5外显子的PCR产物的最佳分析温度为20℃，而第3外显子的最佳分析温度为10℃. 第5外显子的SSCP分析显示，8个DNA样品中有相同的电泳带，其中2例来自中国的食管癌患者，6例来自非癌的高加索人，此现象提示这些样本有共同的DNA序列改变. 阳性样本中2条相同的带(未移动者)的共存提示受检对象的突变等位基因是异源的. 从凝胶上将移动和未移动的带刮下，整合到TA克隆载体，并测定其DNA序列. 结果显示移动带克隆产物中有两处错义突变，但非移动带中未检出类似突变. 两处突变一处位于143密码子，另一处位于178密码子，前者使ATC(异亮氨酸)变为GTC(缬氨酸)，后者使AAG(赖氨酸)变为AGG(精氨酸). 所有8例携带有第5外显子多态性改变的样本中，143和178位密码子的突变总是共存于同一克隆，此现象提示两种突变发生于相同等位基因. 对60例非癌的中国居民的DNA进行的SSCP分析显示均未见第5外显子的电泳带移动.
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40例(30例来自中国居民，10例来自高加索人)样本中，AGT基因的第2，第4外显子的PCR-SSCP分析未发现任何移动带，但检出了一条第3外显子的移动带，测序显示该带系第84密码子突变产物，其后果使该处的CTT(亮氨酸)变为TTT(苯丙氨酸)，此发现与Otsuka et al[8]报道的日本居民的AGT多态性改变一致. 由于84位密码子的碱基替代使得第3外显子的SapI和EarI限制位置消失，作者建立了一种相应的限制性片段长度多态性(RFLP)方法，以确定野生型AGT基因的多态等位基因. 当 第3外显子的PCR产物用SapI消化时，切下的野生型等位基因片段含20bp，此时含突变片段的DNA消化无效，仍保留原长度；换用EarI消化时，野生型基因可切下20bp和30bp两片段，而突变基因只产生一50bp片段. 用RFLP和低温SSCP分析AGT基因84位密码子多态性的检出一致率为100%.
用RFLP方法筛选84密码子的多态改变显示，其在中国食管癌患者、非癌患者的中国居民和高加索人中的发生率分别为16%(20/125)，20%(27/137)，36%(28/110). 用SSCP法检测到的143/178密码子的多态性的发生率在中国食管癌患者和非癌的高加索人中的发生率分别为2%(2/90)和21%(6/28)，且此8例143/178密码子的多态等位基因是异源性的，其中一例高加索人同时带有84密码子(同源性的)和143/178密码子(异源性的)多态性改变，所有被分析的正常中国居民中，无一例发生143/178密码子多态改变.
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3 讨论
本研究显示，人AGT基因存在基因多态性变异，这种多态性改变表现为其活性位置与烷基受体半胱氨酸(145密码子)毗邻的143密码子发生错义突变，并使异亮氨酸变为缬氨酸. 这种变化常与另一新发现的178位密码子的多态改变同时存在，后者使赖氨酸(AAG)变为精氨酸(AGG). 143/178密码子的多态分布在中国人和高加索人之间似乎存在种族差异，识别AGT基因中多态现象，对明确其功能意义，阐述其对个体肿瘤易感性和烷化剂毒性的影响机制具有重要意义[8].
最先检测到的AGT基因多态现象发现于日本居民[9]，它位于第5外显子的160位密码子(使GGA-甘氨酸变为ACG-精氨酸)，28例死于非肿瘤疾病的老年患者中的3例(10.7%)和12例年青的肿瘤患者中的3例(25%)检出有类似多态现象[9]. 1996年Otsuka et al[8]报道了AGT基因第84位密码子的多态改变(V1)和另一错义突变(V2)，V2变体中65位密码子的碱基C被G取代，导致色氨酸被半胱氨酸取代，在分析的225例日本居民中，V1，V2的发生率分别为16.2%，0.2%，与对照组结肠癌患者中的检出率无显著性差异. 本研究虽证实中国人和高加索人中存在第84位密码子的多态现象，但未检出160和65位密码子的多态改变，这一结果提示此两种多态现象在中国人和高加索人中发生率很低.
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点突变所致的单一氨基酸替换，如果发生在关键区域，可显著改变蛋白的结构和功能. 但迄今提到的各种替代均未涉及143位的异亮氨酸和178位的赖氨酸，此两者均未见出现自发的多态变异[10，11]. 弄清楚AGT基因多态性变异的特征是理解其多态现象意义的关键. 就160位密码子的多态改变而言，从表达变异蛋白的大肠杆菌中制备的天然细胞提取液，在体外修复O6-甲基鸟嘌呤的能力同野生型AGT比，几乎没有差异[9]. 然而，Edara et al[12]报道，纯化的该种AGT蛋白(发生了160密码子多态改变-甘氨酸被替换为精氨酸)，修复甲基化的效率比正常AGT蛋白低2倍，更为显著的是它能使由O6-苯甲基鸟嘌呤导致的AGT抑制作用至少降低20倍. 除分子的立体构象的影响因素之外，更重要的原因可能是精氨酸残基取代甘氨酸残基大大削弱了O6-苯甲基鸟嘌呤与AGT活性位置的结合能力. 而第84位密码子多态现象的功能意义有待进一步探讨.
本研究观察到的143/178密码子的多态现象，对决定AGT的结构和功能具有重要意义，除145位的烷基受体半胱氨酸外，143位的异亮氨酸是同一位置只存在唯一氨基酸残基的部位，且是已知的哺乳动物的AGT活性部位的重要组份，所以，该位置的氨基酸替代对AGT活性有重要影响. 相同等位基因上143/178密码子多态性改变的共存，可能更增强了含有这种双突变的多态蛋白同野生型AGT蛋白的差异，作者目前正致力于对143/178密码子多态性功能意义的研究.
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基因多态性与肿瘤发生的关系目前日益为研究者所重视，某些酶的基因多态性，如与致癌剂的代谢有关的酶，被认为改变了酶蛋白功能，是易患肿瘤的原因之一[13]. AGT基因可在人食管粘膜中表达[14]，本研究对中国食管癌高发区的食管癌患者和非癌居民进行了分析探讨. 该地区中，霉变食物中的烷基N-亚硝基化合物被认为是重要的食管癌发生因素之一[15，16]，并已在当地居民的胃液中检出亚硝胺物质[16]. 目前，由于作者分析的样本量较小，也缺乏对照分析，因而还难以断言AGT基因多态性与食管癌发生有关，但进一步研究AGT基因多态性同个体对环境烷基致癌剂的易感性和对烷基化疗药物的反应性的相互关系，是极其必要并具有重要意义.
参考文献
1 Pegg AE. Mammalian O6-alkylguanine-DNA alkytransferase: regulation and importance in response to alkylating carcinogenic and therapeutic agents. Cancer Res, 1990;50(19):6119-6129
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2 Nakatsu Y, Hattori K, Hayakawa H, Shimizu K, Sekiguchi M. Organization and expression of human gene for O6-methylguanine-DNA methyltransferase. Mutat Res, 1993;293(1):119-132
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4 Tsusuki T, Sakumi K, Shiraishi A, Kawate H, Igarashi H, Iwakuma T et al. Targeted disruption of the DNA repair methyltransferase gene renders mice hypersensitive to alkylating agenet. Carcinogenesis(Lond.), 1996;17(12):1215-1220
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12 Edara S, Kanugula S, Goodtzova K, Pegg AE. Resistance of the human O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase containing arginine at codon 160 to inactivation by O6-benzylguanine. Cancer Res, 1996;56(24):5571-5575
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13 Hong JY, Yang CS. Genetic polymorphism of cytochrome P450 as a biomaker of susceptibility to environmental toxicity. Environ Health Perspect, 1997;105(Suppl 4):759-762
14 Wang LD, Zhu D, Zhang C, Mao X, Guoqing W, Mitra S et al. Mutations of O6-methylguanine-DNA methyltransferase gene in esophageal cancer tissues from northern China. Int J Cancer, 1997;71(2):719-723
15 Yang CS. Research on esophageal cancer in China: a review. Cancer Res, 1980;40(8):2633-2644
16 Lu SH, Montesano R, Zhang MS, Feng L, Luo FJ, Chui SX et al. Relevance of N-nitrosamines to esophageal cancer in China[review]. J Cell Physiol, 1986;4(1):51-58
收稿日期 1998-04-18研究原著, 百拇医药
单位：
关键词：食管肿瘤/遗传学；多态现象(遗传学)；鸟嘌呤/遗传学；脱氧核糖核酸，肿瘤/遗传学；基因表达调控，肿瘤
华人消化杂志/980704 中国图书资料分类号 R735.102.319
摘要 目的 检测中国食管癌高发区居民和高加索居民AGT(O6-alkylguanine alkyltrasferase)的基因多态改变. 方法 采用PCR-SSCP和DNA测序方法对河南食管癌高发区居民和高加索居民的癌组织和非癌组织进行基因多态分析. 结果 多态变异发生于第5外显子的143位密码子，并导致该位点的异亮氨酸(AGT)被缬氨酸(GTC)取代，且143位密码子与178位密码子的多态改变有一定联系. 对90例中国食管癌高发区居民的食管癌患者的检测发现，2例(2%)存在143/178密码子同时出现多态变异，同一地区的60例正常居民中，无一例检测到该类型多态现象，但28例高加索居民非癌患者中的6例(21%)也携带有这种多态等位基因. 此外，作者还证实河南食管癌高发区人群中存在第84位密码子基因多态变异，最近在日本居民中也发现这种变化. 这种多态变化导致亮氨酸(CTT)变为苯丙氨酸(TTT). 84位密码子的多态变异在中国食管癌患者、中国和高加索非癌患者中的检出率分别为16%，20%和36%，该多态改变与143/178密码子多态改变同时发生的现象只在1例高加索人DNA中被检出.
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结论 AGT多态改变可能与食管癌的发生有关，其多态分布可能存在种族差异.
0 引言
外界环境中的致癌物和致突变物(包括N-亚硝基化合物)，不少属于烷基化合物，烷基化制剂也是一种重要的肿瘤化疗药物. O6-烷基化鸟嘌呤是由烷基化学物诱导产生的重要的DNA突变前损伤产物，如果未能及时修复，在进行DNA复制时，O6-烷基化鸟嘌呤则倾向于同胸腺嘧啶配对，而不同胞嘧啶配对，并导致碱基对GC转换为AT. DNA中O6-烷基化鸟嘌呤的形成和存在对突变发生、肿瘤形成[1]及氯乙基亚硝基脲等化疗药物诱导的细胞毒作用均有重要影响. DNA修复蛋白O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)能特异性地修复DNA中的O6-烷基鸟嘌呤加合物. 人AGT基因包含5个外显子，170多个kb，其编码序列起始于第2外显子，第5外显子的半胱氨酸145为其活性位点[2]. AGT在保护细胞免受烷基化试剂所致的突变和癌变方面起着关键作用. 过度表达AGT的转基因鼠可免患烷基致癌剂诱导的肿瘤[3]，无AGT活性的小鼠对甲基亚硝基脲的致癌效应尤其敏感[4]. AGT亦可影响肿瘤细胞对烷基化疗药物的敏感性[1，5]，尤其是对诸如卡氮介等氯乙基制剂的敏感性[5]. Belanich et al[6]在一项回顾性研究中发现，AGT活性高的脑肿瘤患者，用卡氮芥治疗时，疗效较差，常常短时间内治疗失败、死亡. 我们采用PCR-SSCP和DNA测序，检测和分析了AGT中的基因多态性，以探讨AGT多态现象与肿瘤易感性和烷基制剂毒性的相互关系.
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1 材料和方法
1.1 主要试剂 PCR试剂盒和dNTP购自Gibco/BRL(Grand Island, NY)和Pharmacia(Piscataway, NJ)，Nusieve和Seakem agarose购自FMC(Rockland, ME). TA克隆试剂盒购自Invitrogen(San Diego, CA)， Sequenase Version 2.0试剂盒和35S-dATP来自Amersham(Arlington Heights, IL). 限制性内切酶来自英格兰的Biolabs(Beverley, MA)，蛋白酶K来自Sigma(St.Lacis, MO).
1.2 组织样本的处理 原发性食管癌组织来自林州市人民医院1991/1995的部分手术切除标本，用950mL/L酒精固定. 患者的平均年龄为56岁±8岁. 血凝块取自作为对照研究的居住在同一地区的非癌志愿者. 血块制备方法为：将大约50μL血液吸附在一张Whatman滤纸上，干燥后-20℃保存. 对照组平均年龄为51岁±15岁. 高加索人组织样本取自食管和肝脏，它们均是因事故而致死的非癌患者组织，由美国国家疾病研究交流中心提供(Philadelphia, PA).
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1.3 DNA制备 用500μL溶解缓冲液消化(含50mmol/L Tris/HCl， pH 8.5，1mmol/L EDTA，2g/L SDS，200g/L蛋白酶K)肝脏或食管肌肉组织(100mg)，并置于振荡器内55℃过夜. 用isopropanol使消化液中的DNA沉淀，再用700mL/L的酒精冲洗沉淀的DNA大分子，将DNA大分子(50μg～100μg)溶于300μL～500μL TE缓冲液，每次取约10ng～100ng DNA基因作PCR. 血凝块采用相同方法消化，消化后的DNA大分子溶于20μL水内，每次取1μL该溶液作PCR分析.
1.4 PCR扩增 对AGT基因的4个编码外显子(2～5)分别进行PCR扩增，所用引物为Gibco/BRL(Grand Island, NY)合成的非特异PCR引物. 引物序列根据已确定的人AGT基因CDNA和内含子/外显子连接序列设计：5＇-CCTATACDCTTTGTCTTAAAAATTA和5＇-ATACTTACTCAGCTGCAGACG用于第2外显子，预计产物大小为182bp；5＇-CCAGAGGTTTACTAAGCCCC和5＇-TTACCGACCTTGCTGGAAAAC用于第3外显子，预计产物大小为194bp；5＇-GTCCAAATAACATTATCCGAC和5＇-GAACTCACAGGATTGCCTCT用于第4外显子，预计产物大小为183bp；5＇-GACAGTGGCTGCCCCCCTGT和5＇-CCCAGGACACTGCCACTTCCT用于第5外显子，预计产物大小为393bp. PCR反应在Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 2400中进行(Norwalk, CT)，按照说明书提示，加热以启动反应，25μL的PCR反应液中包括20mmol/L Tris-HCl, pH 8.4,50mmol/LKCl, 1.5mmol/L MgCl2, 0.1mmol/L dNTPs和1个单位的Amplitaq. 反应开始前先加热到94℃ 3min，然后在94℃ 3s内循环35次，58℃～64℃(根据不同引物的退火温度确定)30s，72℃ 30s，最后在72℃将反应时间延长至7min. 取5mL反应液置于30g/L Nusieve/Seakem(2∶1)凝胶上电泳，经溴化乙锭染色后PCR产物在UV下是可见的.
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1.5 SSCP分析 取5μL PCR产物与15μL变性缓冲液混合(0.4μL 1mol/L 甲基汞氢氧化物，12.6μL 1.25 x TBE，2μL 150mL/L Ficoll-内含1g/L溴酚兰和1g/L cyanol二甲苯兰)，室温孵育10min，加热至95℃3min，低温保存后置于200g/L TBE polyacrylamide凝胶上，电泳在Thermoflow SSCP Syctem (Novex, San Diego, CA)，300V电压下进行，时间为4h～5h ，电泳过程中用温度调控器(Neslab, Portsmouth, NH)将温度维持在10℃或20℃. 凝胶用溴化乙锭染色，并在UV下观察结果. 为确保SSCP分析所检测到的突变不是由PCR扩增过程中的随机错配所致，对在SSCP分析中显示了移动带的样本，要重新进行包括PCR扩增过程在内的重复试验，并只对那些结果具有再现性的样本进行DNA测序.
1.6 PCR产物的克隆和测序 PCR产物的测序方法有2种，其一是按照以前的描述采用PCR直接测序法[7]；其二是先将PCR产物置入TA克隆载体，再用Amersham Sequenase Version 2.0试剂盒进行测序. 最后用自动测序机(Piscataway, NJ)，对检出有序列改变的DNA样本进行测序，以验证观察到的结果.
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1.7 限制性消化 AGT基因第84密码子的多态改变，使得其第3外显子的SapI和EarI限制位置消失. 为了进行大样本量筛选，作者建立了一种相应的RFLP检测方法，此方法可区分野生型等位基因及其变体. 第5外显子的PCR扩增产物用SapI或EarI消化，37℃过夜，然后置于30g/L Nusieve/Seakem(2∶1)agrose凝胶或60g/L polyacrylamide凝胶上，电泳后凝胶用溴化乙锭染色，并在UV下观察结果.
2 结果
来自AGT基因4个外显子的PCR扩增产物均作低温下SSCP分析(此为常用的突变筛选方法)，电泳时温度控制是影响SSCP敏感性的关键因素，不同DNA片段应尽可能调试在最适温度下进行电泳. 如，作者观察到AGT基因第5外显子的PCR产物的最佳分析温度为20℃，而第3外显子的最佳分析温度为10℃. 第5外显子的SSCP分析显示，8个DNA样品中有相同的电泳带，其中2例来自中国的食管癌患者，6例来自非癌的高加索人，此现象提示这些样本有共同的DNA序列改变. 阳性样本中2条相同的带(未移动者)的共存提示受检对象的突变等位基因是异源的. 从凝胶上将移动和未移动的带刮下，整合到TA克隆载体，并测定其DNA序列. 结果显示移动带克隆产物中有两处错义突变，但非移动带中未检出类似突变. 两处突变一处位于143密码子，另一处位于178密码子，前者使ATC(异亮氨酸)变为GTC(缬氨酸)，后者使AAG(赖氨酸)变为AGG(精氨酸). 所有8例携带有第5外显子多态性改变的样本中，143和178位密码子的突变总是共存于同一克隆，此现象提示两种突变发生于相同等位基因. 对60例非癌的中国居民的DNA进行的SSCP分析显示均未见第5外显子的电泳带移动.
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40例(30例来自中国居民，10例来自高加索人)样本中，AGT基因的第2，第4外显子的PCR-SSCP分析未发现任何移动带，但检出了一条第3外显子的移动带，测序显示该带系第84密码子突变产物，其后果使该处的CTT(亮氨酸)变为TTT(苯丙氨酸)，此发现与Otsuka et al[8]报道的日本居民的AGT多态性改变一致. 由于84位密码子的碱基替代使得第3外显子的SapI和EarI限制位置消失，作者建立了一种相应的限制性片段长度多态性(RFLP)方法，以确定野生型AGT基因的多态等位基因. 当 第3外显子的PCR产物用SapI消化时，切下的野生型等位基因片段含20bp，此时含突变片段的DNA消化无效，仍保留原长度；换用EarI消化时，野生型基因可切下20bp和30bp两片段，而突变基因只产生一50bp片段. 用RFLP和低温SSCP分析AGT基因84位密码子多态性的检出一致率为100%.
用RFLP方法筛选84密码子的多态改变显示，其在中国食管癌患者、非癌患者的中国居民和高加索人中的发生率分别为16%(20/125)，20%(27/137)，36%(28/110). 用SSCP法检测到的143/178密码子的多态性的发生率在中国食管癌患者和非癌的高加索人中的发生率分别为2%(2/90)和21%(6/28)，且此8例143/178密码子的多态等位基因是异源性的，其中一例高加索人同时带有84密码子(同源性的)和143/178密码子(异源性的)多态性改变，所有被分析的正常中国居民中，无一例发生143/178密码子多态改变.
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3 讨论
本研究显示，人AGT基因存在基因多态性变异，这种多态性改变表现为其活性位置与烷基受体半胱氨酸(145密码子)毗邻的143密码子发生错义突变，并使异亮氨酸变为缬氨酸. 这种变化常与另一新发现的178位密码子的多态改变同时存在，后者使赖氨酸(AAG)变为精氨酸(AGG). 143/178密码子的多态分布在中国人和高加索人之间似乎存在种族差异，识别AGT基因中多态现象，对明确其功能意义，阐述其对个体肿瘤易感性和烷化剂毒性的影响机制具有重要意义[8].
最先检测到的AGT基因多态现象发现于日本居民[9]，它位于第5外显子的160位密码子(使GGA-甘氨酸变为ACG-精氨酸)，28例死于非肿瘤疾病的老年患者中的3例(10.7%)和12例年青的肿瘤患者中的3例(25%)检出有类似多态现象[9]. 1996年Otsuka et al[8]报道了AGT基因第84位密码子的多态改变(V1)和另一错义突变(V2)，V2变体中65位密码子的碱基C被G取代，导致色氨酸被半胱氨酸取代，在分析的225例日本居民中，V1，V2的发生率分别为16.2%，0.2%，与对照组结肠癌患者中的检出率无显著性差异. 本研究虽证实中国人和高加索人中存在第84位密码子的多态现象，但未检出160和65位密码子的多态改变，这一结果提示此两种多态现象在中国人和高加索人中发生率很低.
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点突变所致的单一氨基酸替换，如果发生在关键区域，可显著改变蛋白的结构和功能. 但迄今提到的各种替代均未涉及143位的异亮氨酸和178位的赖氨酸，此两者均未见出现自发的多态变异[10，11]. 弄清楚AGT基因多态性变异的特征是理解其多态现象意义的关键. 就160位密码子的多态改变而言，从表达变异蛋白的大肠杆菌中制备的天然细胞提取液，在体外修复O6-甲基鸟嘌呤的能力同野生型AGT比，几乎没有差异[9]. 然而，Edara et al[12]报道，纯化的该种AGT蛋白(发生了160密码子多态改变-甘氨酸被替换为精氨酸)，修复甲基化的效率比正常AGT蛋白低2倍，更为显著的是它能使由O6-苯甲基鸟嘌呤导致的AGT抑制作用至少降低20倍. 除分子的立体构象的影响因素之外，更重要的原因可能是精氨酸残基取代甘氨酸残基大大削弱了O6-苯甲基鸟嘌呤与AGT活性位置的结合能力. 而第84位密码子多态现象的功能意义有待进一步探讨.
本研究观察到的143/178密码子的多态现象，对决定AGT的结构和功能具有重要意义，除145位的烷基受体半胱氨酸外，143位的异亮氨酸是同一位置只存在唯一氨基酸残基的部位，且是已知的哺乳动物的AGT活性部位的重要组份，所以，该位置的氨基酸替代对AGT活性有重要影响. 相同等位基因上143/178密码子多态性改变的共存，可能更增强了含有这种双突变的多态蛋白同野生型AGT蛋白的差异，作者目前正致力于对143/178密码子多态性功能意义的研究.
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基因多态性与肿瘤发生的关系目前日益为研究者所重视，某些酶的基因多态性，如与致癌剂的代谢有关的酶，被认为改变了酶蛋白功能，是易患肿瘤的原因之一[13]. AGT基因可在人食管粘膜中表达[14]，本研究对中国食管癌高发区的食管癌患者和非癌居民进行了分析探讨. 该地区中，霉变食物中的烷基N-亚硝基化合物被认为是重要的食管癌发生因素之一[15，16]，并已在当地居民的胃液中检出亚硝胺物质[16]. 目前，由于作者分析的样本量较小，也缺乏对照分析，因而还难以断言AGT基因多态性与食管癌发生有关，但进一步研究AGT基因多态性同个体对环境烷基致癌剂的易感性和对烷基化疗药物的反应性的相互关系，是极其必要并具有重要意义.
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收稿日期 1998-04-18研究原著, 百拇医药