修复关节软骨大面积缺损的实验研究
作者：杨贵勇 卢世璧 张伯勋 王继芳
单位：100853 北京，中国人民解放军总医院骨科
关键词：软骨，关节；筋膜；组织培养
中华外科杂志/980815 【摘要】 目的 比较和评价筋膜软骨细胞和骨膜、关节软骨移植修复关节软骨大面积缺损的能力和生物特性。 方法 用冻存和新鲜的异体筋膜上培养的软骨细胞、骨膜和关节软骨移植修复大面积关节软骨缺损，通过大体标本、光学显微镜、扫描和透射电镜、放射自显影、微量元素和柱层析氨基酸定量测定、一氧化氮含量测定等多种观察方法进行评价。 结果 新鲜和冻存的筋膜软骨细胞移植在结构、形成新的软骨组织能力、代谢活性方面均优于游离软骨细胞移植；新鲜的自体骨膜和软骨移植同样可获得较好的结果。 结论 软骨细胞可以在筋膜上正常生长，筋膜可以作为软骨细胞移植的较为理想的载体。
Repair of articular cartilage defect with a large area:an experimental study Yang Guiyong,Lu Shibi,Zhang Boxun,et al.Department of Orthopedic Surgery,General Hospital of Peoples Liberation Army,Beijing 100853.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To compare and evaluate potentialities and biological characteristics of grafts of chondrocytes cultured on fascia,periosteum and articular cartilage in repairing large defects of articular cartilage. Method The large defects of articular cartilage were repaired with grafts of freeze-stored and fresh chondrocytes cultured on fascia,periosteum and articular cartilage,which were evaluated by a number of observation methods. Result The fresh and freeze-stored fascial chondrocytes were superior to free grafts of chondrocytes in potentiality of formation of new cartilaginous tissue,structure and metabolism of newly formed tissue.Relatively good results were also obtained similarly by using fresh autografts of periosteum and cartilage. Conclusion Chondrocytes can be cultured normally on fascia, which can be regarded as an ideal carrier of chondrocytes.
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【Key words】 Cartilage,articular Fascia Tissue culture
修复关节软骨缺损的实验研究和临床应用已经取得许多有意义的成果[1～6]。但是，软骨细胞在筋膜支架培养和低温保存下修复软骨缺损中的效果如何?冻存的关节软骨和骨膜组织修复软骨缺损能力有什么差别?尚未见报道。我们对此进行了实验研究，现报告如下。
材料和方法
1.实验动物和分组：新西兰白兔44只，体重1.5～2.5kg，雌雄不限。动物分组及实验关节数见附表。
2.筋膜软骨细胞的制备和低温保存：无菌条件下取兔皮下深筋膜，用盖玻片或透明塑料纸贴附筋膜、剪下，放入宽口培养瓶中。将传代后的幼兔软骨细胞悬液移入放有筋膜的培养瓶中培养。2～3天后，移入冻存管中，加入1M DMSO培养液，降温速度
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附表 动物分组及实验关节数(个) 组 别
新 鲜
冻 存
合 计
关节软骨移植
成兔软骨组
12
6
18
幼兔软骨组
0
6
6
, 百拇医药
软骨细胞移植
筋膜细胞组
10
10
20
游离细胞组
8
0
8
骨膜移植
自体骨膜组
12
0
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12
异体骨膜组
12
12
24
注：本实验所用幼兔为解放军军事医学科学院动物中心提供的出生5天以内的幼兔 为4℃/min，降至-80℃时，将冻存组织和细胞放入液氮中保存。1个月时，在40℃水浴中快速复温。细胞存活率为93.4%。
3.关节软骨和骨膜组织的获取和低温保存：软骨分别取自幼兔和成兔关节软骨，幼兔软骨直径为3 mm～5 mm，成兔软骨大小为4 mm ×8 mm ×1 mm。骨膜取自成兔胫骨前内侧骨膜，大小为5 mm ×10 mm。无菌条件取下，立即放入4℃的Hanks 液中保存，在2小时内进行低温保存处理。降温速度、保存时间及复温方法同上。
, 百拇医药
4.动物模型和实验方法：将实验动物用15%赛胺酮0.5 ml肌肉注射麻醉，常规灭菌，铺单。在双侧膝关节相对髌骨的股骨髁中部关节面做4 mm ×8 mm 的全层关节软骨缺损，深度以见到软骨下骨出血为宜，平均深度约为1.5 mm。采用自制的纤维蛋白粘合剂固定移植物。新鲜的异体软骨移植物为成兔的关节软骨，手术中切取后，即刻移植到另一只兔的膝关节软骨缺损处；冻存的异体软骨移植物分为幼兔关节软骨和成兔关节软骨。新鲜和冻存骨膜移植物生发层朝向关节腔。筋膜细胞移植组是将稀释的细胞悬液0.1 ml(108/ml)滴于软骨缺损处，外面覆盖与缺损相同大小的筋膜软骨细胞，细胞面朝下粘贴；游离细胞移植组仅滴生物胶和0.1 ml 细胞悬液，不用筋膜细胞覆盖。动物术后放回笼内自由活动。
5.观察方法：(1)大体观察：各组于术后6、12、24周取整个实验关节进行大体观察。(2)光学显微镜观察：HE染色，Safranin-O染色，甲苯胺蓝染色；S-100蛋白染色；Ⅱ型胶原分子原位杂交，探针为人前胶原Ⅱα1 cDNA片段(北京医科大学运动医学研究所提供)。标记物为异羟基洋地黄毒甙。(3)超微结构观察：扫描和透射电镜。(4)放射自显影观察。(5)微量元素和柱层析氨基酸定量测定。(6)一氧化氮含量测定：化学发光法。
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结 果
1.大体观察：各实验组的关节无畸形及红肿，活动范围正常；关节液清亮，关节内无粘连。
骨膜移植：(1)术后6周，自体骨膜移植组新生组织与关节软骨缺损牢固愈合，与关节面相平，蓝白色，平滑，富弹性；异体骨膜移植组新生组织与关节软骨粘合牢固，略高于关节软骨平面，色稍白，弹性差。(2)术后12周和24周，自体骨膜移植组和异体骨膜移植组新鲜的移植物与正常软骨颜色相同，光滑而富有弹性；冻存的异体骨膜移植物外观仍为淡白色，质软，并见部分吸收后留下的缺损。
关节软骨移植：(1)术后6周，成兔软骨组新鲜移植物连接好，表面光滑，呈粉白色；冻存移植物呈淡白色。(2)12周时，成兔软骨组冻存和新鲜移植物与正常关节软骨无明显区别；幼兔软骨组冻存移植物与成兔软骨组冻存移植物结果相同。
软骨细胞移植：(1)术后6周，筋膜细胞组可见软骨缺损被乳白色薄层组织充填，表面光滑，质软，无弹性；游离细胞组可见不均匀的薄层组织充填，部分关节缺损裸露。(2)术后12周，筋膜细胞组关节缺损已被类似软骨样组织充满，呈蓝白色，表面光滑，质软，弹性差；游离细胞组缺损界限有的变小，可见正常软骨增生，有的变大，正常软骨有吸收，移植物不均匀覆盖缺损表面，质软，弹性差。(3)术后24周，筋膜细胞组关节缺损完全修复，外观与周边正常软骨无差异；游离细胞组仍见缺损存在，中间可见岛状软骨样组织。筋膜细胞冻存和新鲜组形态无明显区别。
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2.光学显微镜观察：骨膜移植：(1)术后6周，自体骨膜组和异体骨膜组均显示新鲜移植物与缺损组织间交错生长，细胞肥大、变圆；少部分细胞形成陷窝样结构，同源细胞数量较周边正常软骨少，细胞密度接近正常关节软骨，排列不规则，基质中出现不均匀的粘多糖蛋白，以自体骨膜组最佳。异体骨膜组冻存移植物细胞分化不佳，极少发生软骨细胞样变，糖蛋白染色基本不着色。(2)术后12周和24周，自体骨膜组和异体骨膜组新鲜移植物均形成软骨样结构，糖蛋白染色类似正常软骨。S-100染色阳性，而培养的骨膜细胞S-100染色为阴性。新鲜骨膜移植物分子原位杂交呈阳性反应。异体骨膜组冻存骨膜移植免疫组化染色为阴性(图1)。
图1 冻存骨膜移植12周，少量骨膜转化成软骨样结构 Safranin-O染色×200
关节软骨移植：(1)术后6周，可见软骨移植物连接好，结构规则，细胞形态正常，冻存软骨移植物糖蛋白减少。(2)术后12周和24周，细胞形态仍无明显改变，糖蛋白含量增加，较正常软骨含量低(图2)。
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图2 冻存软骨移植12周，大部分软骨细胞退变，陷窝消失 甲苯胺蓝染色×200
软骨细胞移植：(1)术后6周，筋膜细胞组可见细胞均匀充填于关节缺损处，与周边软骨高度相同，细胞形态浅层没有变化，中间层少部分呈软骨组织样改变；游离细胞细胞组可见关节缺损周边细胞堆积，中央部为纤维组织充填。(2)术后12周和24周，筋膜细胞组，软骨细胞移植物呈软骨组织样结构：细胞大而圆，陷窝形成，细胞密度减低，分布均匀，糖蛋白染色均匀，S-100蛋白染色着色较深；游离细胞组残留的细胞出现软骨样改变，关节缺损为纤维组织覆盖，其间有散在的软骨细胞(图3，4)。
图3 游离软骨细胞移植24周，缺损大部分被纤维组织充填 HE染色×100)
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图4 筋膜软骨细胞移植24周，缺损修复，细胞增殖，软骨结构出现 Safranin-O染色×200
3.电镜观察：新鲜的自体和异体骨膜移植均发生软骨样改变，同源细胞增多，细胞出现透明带，呈椭圆和圆形改变，细胞周围可见糖原颗粒。冻存骨膜细胞仍为幼稚细胞，小而不规则。
新鲜的关节软骨移植细胞结构正常，核膜清楚，细胞器丰富，糖原颗粒较多；冻存软骨移植大部分细胞结构正常，间有少量细胞核膜不清，核质碎裂，胞浆肿胀，细胞器结构消失，呈变性、死亡改变(图5)。
图5 冻存软骨移植12周，可见细胞分裂和相邻细胞器水肿同时存在 透射电镜×3600
筋膜上生长的细胞突起短，呈花瓣状，有的中间微凹，在筋膜的网丝上有粗糙的分泌物，细胞与网丝均有突起相连。细胞增殖是不同步的，可见到正在生长发育、刚刚分裂、已经分裂、开始衰老和死亡的细胞。细胞分裂从胞核开始，染色体浓集、极端生长、核膜内陷到胞质断开。一个同源细胞至少可见20个细胞在一个大的陷窝中，周边可见密集的糖原颗粒(图6，7)。
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图6 筋膜软骨细胞培养2周,软骨细胞在筋膜丝网状间隙生长和增殖，分泌基质 扫描电镜×1000
图7 筋膜软骨细胞移植12周，反映细胞分裂增殖的同源细胞 透射电镜×1650
4.放射自显影：冻存的软骨移植物可见35S标记银粒，标记数量明显减少。筋膜细胞组3H和35S的银粒标记率均很高。新鲜移植的自体和异体骨膜均可见35S掺入标记的银粒，而正常骨膜无35S银粒标记。冻存的骨膜移植物见不到35S银粒标记，3H标记也很少。
5.微量元素测定：钙和磷在骨组织中明显高于软骨组织，而幼兔软骨的钙和磷明显低于正常软骨组织；骨膜中的钙磷明显低于软骨，而新生组织中的钙磷与正常软骨无差异，高于骨膜组织，低于骨组织。
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6.氨基酸测定：正常骨膜与正常关节软骨间的氨基酸含量无显著差异，但骨膜氨基酸含量的均值高于关节软骨；新生组织和正常关节软骨的主要氨基酸含量无显著差异。
7.血浆中一氧化氮含量测定：自体和异体移植组的一氧化氮测定结果均显示差异无显著性意义(F=0.9369,P=0.4490,P>0.05)。
讨 论
长期以来，关节软骨移植修复大面积关节软骨缺损效果多不满意。分析其原因：(1)新鲜的自体软骨移植受到材料来源的限制，而新鲜异体软骨移植不仅也受到材料来源的限制，而且受到组织保存环境和时限以及材料质量的限制。(2)冻存方法虽可延长组织保存的时限，但保护剂的浓度高和作用时间长也同样可使组织发生损伤。保护剂渗透到软骨下骨需2个小时，如此漫长的时间导致组织损伤达50%～70%。(3)如何调节适当的降温速率，主要是防止冰晶效应及溶质效应。(4)未能解决软骨移植的固定方法[1～5，7]。本实验即试图寻找解决的这一问题的途径：(1)新鲜的移植软骨可以取自体和异体；(2)增大保护剂和冻存的软骨组织接触面积，增加渗透速度，加快热反射，减少冻伤；(3)用生物组织粘合剂粘合，使关节软骨移植物可靠固定；(4)选择适宜的降温速率，提高了冻存组织的存活率。本实验最长观察半年，但电镜显示冻存软骨移植大部分细胞结构正常，间有少量细胞核膜不清，核质碎裂，胞浆肿胀，细胞器结构消失，呈变性、死亡改变。
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已有报道证实，骨膜具有成骨和成软骨的双重能力，在不同的环境条件下，其转化结果不同[7]。本实验结果显示：在骨膜转化成软骨方面，异体新鲜骨膜移植与自体新鲜骨膜移植无明显差异。但冻存骨膜移植转化成软骨能力差。因此，对于冻存的关节软骨和骨膜移植修复关节软骨缺损仍有待于进一步的探讨。
由于软骨细胞游离移植修复关节软骨缺损，受到关节液的冲洗和活动的影响，能存留于修复部位的细胞所剩很少，再者用胶原凝胶和纤维蛋白原复合物、琼脂糖等作为细胞移植的支架能修复的软骨缺损面积很小，一般不超过0.5 cm直经的缺损。这些支撑物不同程度对软骨细胞的生长代谢是有影响的[8，9]。本实验采用同种兔的皮下深筋膜作为支架培养软骨细胞，效果满意。其优点是：筋膜取材方便，来源广泛；筋膜光镜下为透明的膜状物，无血管和细胞结构，电镜下为丝网状、有间隙的结构，利于液体渗透；筋膜自身不进行新陈代谢，因此不产生免疫排斥反应。术后2周取材时已见不到筋膜组织，说明已经自行吸收。
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按照组织工程学的设想，筋膜软骨细胞应该培养成软骨组织，但本实验结果并未获得有一定弹性和硬度的软骨组织，因此未进行生物力学测试。分析原因，可能是培养的组织块大，培养的时间短，筋膜非常薄，不能使筋膜软骨细胞形成具有一定的弹性和硬度的缘故。这方面尚待进一步的研究。
参 考 文 献
1Brown KL,Cruess RL.Bone and cartilage transplantation in orthopaedic surgery. J Bone Joint Surg(Am),1982,64:270-279.
2Meyers MH,Akeson W,Convery FR.Resurfacing of the knee with fresh osteochondral allograft.J Bone Joint Surg(Am),1989,71:704-713.
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3Burwell RG,Friedlaender GE,Mankin HJ.Current perspectives and future directions:the 1983 invitational conference on osteochondral allografts.Clin Orthop,1985,197:141-157.
4Malinin TI,Martinez OV,Brown MK.Banking of massive osteoarticular and intercalary bone allografts 12 years experience.Clin Orthop,1985,197:44-57.
5Tomford WW,Mankin HJ. Investigational approaches to articular cartilage preservation.Clin Orthop,1983,174:22-27.
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6Woessener JF.Introduction to serial reviews:the extracellular matrix.FASEB,1993,735.
7Salter RB,Rodger RM,Czitrom WD.The fate of allogeneic periosteum transplanted into an osteochondral defect and subjected to continuous passive motion. an experimental investigation in the rabbit.Clin Inves Med,1985,10:40-41.
8Langer R,Vacanti JP.Tissue engineering.Science,1993,260:920-926.
9Freed LE,Marquis JC,Nohria A,et al.Neocartilage formation in vitro and in vivo using cells cultured on synthetic biodegradable polymers.J Biomed Mater Res,1993,27:11-23., http://www.100md.com
单位：100853 北京，中国人民解放军总医院骨科
关键词：软骨，关节；筋膜；组织培养
中华外科杂志/980815 【摘要】 目的 比较和评价筋膜软骨细胞和骨膜、关节软骨移植修复关节软骨大面积缺损的能力和生物特性。 方法 用冻存和新鲜的异体筋膜上培养的软骨细胞、骨膜和关节软骨移植修复大面积关节软骨缺损，通过大体标本、光学显微镜、扫描和透射电镜、放射自显影、微量元素和柱层析氨基酸定量测定、一氧化氮含量测定等多种观察方法进行评价。 结果 新鲜和冻存的筋膜软骨细胞移植在结构、形成新的软骨组织能力、代谢活性方面均优于游离软骨细胞移植；新鲜的自体骨膜和软骨移植同样可获得较好的结果。 结论 软骨细胞可以在筋膜上正常生长，筋膜可以作为软骨细胞移植的较为理想的载体。
Repair of articular cartilage defect with a large area:an experimental study Yang Guiyong,Lu Shibi,Zhang Boxun,et al.Department of Orthopedic Surgery,General Hospital of Peoples Liberation Army,Beijing 100853.
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【Abstract】 Objective To compare and evaluate potentialities and biological characteristics of grafts of chondrocytes cultured on fascia,periosteum and articular cartilage in repairing large defects of articular cartilage. Method The large defects of articular cartilage were repaired with grafts of freeze-stored and fresh chondrocytes cultured on fascia,periosteum and articular cartilage,which were evaluated by a number of observation methods. Result The fresh and freeze-stored fascial chondrocytes were superior to free grafts of chondrocytes in potentiality of formation of new cartilaginous tissue,structure and metabolism of newly formed tissue.Relatively good results were also obtained similarly by using fresh autografts of periosteum and cartilage. Conclusion Chondrocytes can be cultured normally on fascia, which can be regarded as an ideal carrier of chondrocytes.
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修复关节软骨缺损的实验研究和临床应用已经取得许多有意义的成果[1～6]。但是，软骨细胞在筋膜支架培养和低温保存下修复软骨缺损中的效果如何?冻存的关节软骨和骨膜组织修复软骨缺损能力有什么差别?尚未见报道。我们对此进行了实验研究，现报告如下。
材料和方法
1.实验动物和分组：新西兰白兔44只，体重1.5～2.5kg，雌雄不限。动物分组及实验关节数见附表。
2.筋膜软骨细胞的制备和低温保存：无菌条件下取兔皮下深筋膜，用盖玻片或透明塑料纸贴附筋膜、剪下，放入宽口培养瓶中。将传代后的幼兔软骨细胞悬液移入放有筋膜的培养瓶中培养。2～3天后，移入冻存管中，加入1M DMSO培养液，降温速度
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附表 动物分组及实验关节数(个) 组 别
新 鲜
冻 存
合 计
关节软骨移植
成兔软骨组
12
6
18
幼兔软骨组
0
6
6
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软骨细胞移植
筋膜细胞组
10
10
20
游离细胞组
8
0
8
骨膜移植
自体骨膜组
12
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异体骨膜组
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注：本实验所用幼兔为解放军军事医学科学院动物中心提供的出生5天以内的幼兔 为4℃/min，降至-80℃时，将冻存组织和细胞放入液氮中保存。1个月时，在40℃水浴中快速复温。细胞存活率为93.4%。
3.关节软骨和骨膜组织的获取和低温保存：软骨分别取自幼兔和成兔关节软骨，幼兔软骨直径为3 mm～5 mm，成兔软骨大小为4 mm ×8 mm ×1 mm。骨膜取自成兔胫骨前内侧骨膜，大小为5 mm ×10 mm。无菌条件取下，立即放入4℃的Hanks 液中保存，在2小时内进行低温保存处理。降温速度、保存时间及复温方法同上。
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4.动物模型和实验方法：将实验动物用15%赛胺酮0.5 ml肌肉注射麻醉，常规灭菌，铺单。在双侧膝关节相对髌骨的股骨髁中部关节面做4 mm ×8 mm 的全层关节软骨缺损，深度以见到软骨下骨出血为宜，平均深度约为1.5 mm。采用自制的纤维蛋白粘合剂固定移植物。新鲜的异体软骨移植物为成兔的关节软骨，手术中切取后，即刻移植到另一只兔的膝关节软骨缺损处；冻存的异体软骨移植物分为幼兔关节软骨和成兔关节软骨。新鲜和冻存骨膜移植物生发层朝向关节腔。筋膜细胞移植组是将稀释的细胞悬液0.1 ml(108/ml)滴于软骨缺损处，外面覆盖与缺损相同大小的筋膜软骨细胞，细胞面朝下粘贴；游离细胞移植组仅滴生物胶和0.1 ml 细胞悬液，不用筋膜细胞覆盖。动物术后放回笼内自由活动。
5.观察方法：(1)大体观察：各组于术后6、12、24周取整个实验关节进行大体观察。(2)光学显微镜观察：HE染色，Safranin-O染色，甲苯胺蓝染色；S-100蛋白染色；Ⅱ型胶原分子原位杂交，探针为人前胶原Ⅱα1 cDNA片段(北京医科大学运动医学研究所提供)。标记物为异羟基洋地黄毒甙。(3)超微结构观察：扫描和透射电镜。(4)放射自显影观察。(5)微量元素和柱层析氨基酸定量测定。(6)一氧化氮含量测定：化学发光法。
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结 果
1.大体观察：各实验组的关节无畸形及红肿，活动范围正常；关节液清亮，关节内无粘连。
骨膜移植：(1)术后6周，自体骨膜移植组新生组织与关节软骨缺损牢固愈合，与关节面相平，蓝白色，平滑，富弹性；异体骨膜移植组新生组织与关节软骨粘合牢固，略高于关节软骨平面，色稍白，弹性差。(2)术后12周和24周，自体骨膜移植组和异体骨膜移植组新鲜的移植物与正常软骨颜色相同，光滑而富有弹性；冻存的异体骨膜移植物外观仍为淡白色，质软，并见部分吸收后留下的缺损。
关节软骨移植：(1)术后6周，成兔软骨组新鲜移植物连接好，表面光滑，呈粉白色；冻存移植物呈淡白色。(2)12周时，成兔软骨组冻存和新鲜移植物与正常关节软骨无明显区别；幼兔软骨组冻存移植物与成兔软骨组冻存移植物结果相同。
软骨细胞移植：(1)术后6周，筋膜细胞组可见软骨缺损被乳白色薄层组织充填，表面光滑，质软，无弹性；游离细胞组可见不均匀的薄层组织充填，部分关节缺损裸露。(2)术后12周，筋膜细胞组关节缺损已被类似软骨样组织充满，呈蓝白色，表面光滑，质软，弹性差；游离细胞组缺损界限有的变小，可见正常软骨增生，有的变大，正常软骨有吸收，移植物不均匀覆盖缺损表面，质软，弹性差。(3)术后24周，筋膜细胞组关节缺损完全修复，外观与周边正常软骨无差异；游离细胞组仍见缺损存在，中间可见岛状软骨样组织。筋膜细胞冻存和新鲜组形态无明显区别。
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2.光学显微镜观察：骨膜移植：(1)术后6周，自体骨膜组和异体骨膜组均显示新鲜移植物与缺损组织间交错生长，细胞肥大、变圆；少部分细胞形成陷窝样结构，同源细胞数量较周边正常软骨少，细胞密度接近正常关节软骨，排列不规则，基质中出现不均匀的粘多糖蛋白，以自体骨膜组最佳。异体骨膜组冻存移植物细胞分化不佳，极少发生软骨细胞样变，糖蛋白染色基本不着色。(2)术后12周和24周，自体骨膜组和异体骨膜组新鲜移植物均形成软骨样结构，糖蛋白染色类似正常软骨。S-100染色阳性，而培养的骨膜细胞S-100染色为阴性。新鲜骨膜移植物分子原位杂交呈阳性反应。异体骨膜组冻存骨膜移植免疫组化染色为阴性(图1)。
图1 冻存骨膜移植12周，少量骨膜转化成软骨样结构 Safranin-O染色×200
关节软骨移植：(1)术后6周，可见软骨移植物连接好，结构规则，细胞形态正常，冻存软骨移植物糖蛋白减少。(2)术后12周和24周，细胞形态仍无明显改变，糖蛋白含量增加，较正常软骨含量低(图2)。
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图2 冻存软骨移植12周，大部分软骨细胞退变，陷窝消失 甲苯胺蓝染色×200
软骨细胞移植：(1)术后6周，筋膜细胞组可见细胞均匀充填于关节缺损处，与周边软骨高度相同，细胞形态浅层没有变化，中间层少部分呈软骨组织样改变；游离细胞细胞组可见关节缺损周边细胞堆积，中央部为纤维组织充填。(2)术后12周和24周，筋膜细胞组，软骨细胞移植物呈软骨组织样结构：细胞大而圆，陷窝形成，细胞密度减低，分布均匀，糖蛋白染色均匀，S-100蛋白染色着色较深；游离细胞组残留的细胞出现软骨样改变，关节缺损为纤维组织覆盖，其间有散在的软骨细胞(图3，4)。
图3 游离软骨细胞移植24周，缺损大部分被纤维组织充填 HE染色×100)
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图4 筋膜软骨细胞移植24周，缺损修复，细胞增殖，软骨结构出现 Safranin-O染色×200
3.电镜观察：新鲜的自体和异体骨膜移植均发生软骨样改变，同源细胞增多，细胞出现透明带，呈椭圆和圆形改变，细胞周围可见糖原颗粒。冻存骨膜细胞仍为幼稚细胞，小而不规则。
新鲜的关节软骨移植细胞结构正常，核膜清楚，细胞器丰富，糖原颗粒较多；冻存软骨移植大部分细胞结构正常，间有少量细胞核膜不清，核质碎裂，胞浆肿胀，细胞器结构消失，呈变性、死亡改变(图5)。
图5 冻存软骨移植12周，可见细胞分裂和相邻细胞器水肿同时存在 透射电镜×3600
筋膜上生长的细胞突起短，呈花瓣状，有的中间微凹，在筋膜的网丝上有粗糙的分泌物，细胞与网丝均有突起相连。细胞增殖是不同步的，可见到正在生长发育、刚刚分裂、已经分裂、开始衰老和死亡的细胞。细胞分裂从胞核开始，染色体浓集、极端生长、核膜内陷到胞质断开。一个同源细胞至少可见20个细胞在一个大的陷窝中，周边可见密集的糖原颗粒(图6，7)。
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图6 筋膜软骨细胞培养2周,软骨细胞在筋膜丝网状间隙生长和增殖，分泌基质 扫描电镜×1000
图7 筋膜软骨细胞移植12周，反映细胞分裂增殖的同源细胞 透射电镜×1650
4.放射自显影：冻存的软骨移植物可见35S标记银粒，标记数量明显减少。筋膜细胞组3H和35S的银粒标记率均很高。新鲜移植的自体和异体骨膜均可见35S掺入标记的银粒，而正常骨膜无35S银粒标记。冻存的骨膜移植物见不到35S银粒标记，3H标记也很少。
5.微量元素测定：钙和磷在骨组织中明显高于软骨组织，而幼兔软骨的钙和磷明显低于正常软骨组织；骨膜中的钙磷明显低于软骨，而新生组织中的钙磷与正常软骨无差异，高于骨膜组织，低于骨组织。
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6.氨基酸测定：正常骨膜与正常关节软骨间的氨基酸含量无显著差异，但骨膜氨基酸含量的均值高于关节软骨；新生组织和正常关节软骨的主要氨基酸含量无显著差异。
7.血浆中一氧化氮含量测定：自体和异体移植组的一氧化氮测定结果均显示差异无显著性意义(F=0.9369,P=0.4490,P>0.05)。
讨 论
长期以来，关节软骨移植修复大面积关节软骨缺损效果多不满意。分析其原因：(1)新鲜的自体软骨移植受到材料来源的限制，而新鲜异体软骨移植不仅也受到材料来源的限制，而且受到组织保存环境和时限以及材料质量的限制。(2)冻存方法虽可延长组织保存的时限，但保护剂的浓度高和作用时间长也同样可使组织发生损伤。保护剂渗透到软骨下骨需2个小时，如此漫长的时间导致组织损伤达50%～70%。(3)如何调节适当的降温速率，主要是防止冰晶效应及溶质效应。(4)未能解决软骨移植的固定方法[1～5，7]。本实验即试图寻找解决的这一问题的途径：(1)新鲜的移植软骨可以取自体和异体；(2)增大保护剂和冻存的软骨组织接触面积，增加渗透速度，加快热反射，减少冻伤；(3)用生物组织粘合剂粘合，使关节软骨移植物可靠固定；(4)选择适宜的降温速率，提高了冻存组织的存活率。本实验最长观察半年，但电镜显示冻存软骨移植大部分细胞结构正常，间有少量细胞核膜不清，核质碎裂，胞浆肿胀，细胞器结构消失，呈变性、死亡改变。
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已有报道证实，骨膜具有成骨和成软骨的双重能力，在不同的环境条件下，其转化结果不同[7]。本实验结果显示：在骨膜转化成软骨方面，异体新鲜骨膜移植与自体新鲜骨膜移植无明显差异。但冻存骨膜移植转化成软骨能力差。因此，对于冻存的关节软骨和骨膜移植修复关节软骨缺损仍有待于进一步的探讨。
由于软骨细胞游离移植修复关节软骨缺损，受到关节液的冲洗和活动的影响，能存留于修复部位的细胞所剩很少，再者用胶原凝胶和纤维蛋白原复合物、琼脂糖等作为细胞移植的支架能修复的软骨缺损面积很小，一般不超过0.5 cm直经的缺损。这些支撑物不同程度对软骨细胞的生长代谢是有影响的[8，9]。本实验采用同种兔的皮下深筋膜作为支架培养软骨细胞，效果满意。其优点是：筋膜取材方便，来源广泛；筋膜光镜下为透明的膜状物，无血管和细胞结构，电镜下为丝网状、有间隙的结构，利于液体渗透；筋膜自身不进行新陈代谢，因此不产生免疫排斥反应。术后2周取材时已见不到筋膜组织，说明已经自行吸收。
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按照组织工程学的设想，筋膜软骨细胞应该培养成软骨组织，但本实验结果并未获得有一定弹性和硬度的软骨组织，因此未进行生物力学测试。分析原因，可能是培养的组织块大，培养的时间短，筋膜非常薄，不能使筋膜软骨细胞形成具有一定的弹性和硬度的缘故。这方面尚待进一步的研究。
参 考 文 献
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3Burwell RG,Friedlaender GE,Mankin HJ.Current perspectives and future directions:the 1983 invitational conference on osteochondral allografts.Clin Orthop,1985,197:141-157.
4Malinin TI,Martinez OV,Brown MK.Banking of massive osteoarticular and intercalary bone allografts 12 years experience.Clin Orthop,1985,197:44-57.
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9Freed LE,Marquis JC,Nohria A,et al.Neocartilage formation in vitro and in vivo using cells cultured on synthetic biodegradable polymers.J Biomed Mater Res,1993,27:11-23., http://www.100md.com