肝性脑病大白鼠急性分离的海马CA1区锥体细胞K＋、Na＋电流改变
作者：张宗明 吴才宏 周培爱 颜南生 傅卫 庄道斌 阳冬梅 周孝思
单位：100083 北京医科大学第三医院外科(张宗明、颜南生、傅卫、周孝思)；北京大学生物膜与膜生物工程国家重点实验室(吴才宏、周培爱、庄道斌、阳冬梅)
关键词：
中华外科杂志/980827 研究表明，肝性脑病(hepatic encephalopathy,HE)动物模型或人脑内调控离子通道的受体，如中枢型苯二氮卓受体、生长抑素受体，结合特性有改变[1，2]。这些改变有可能引起中枢神经元的电压依赖性离子通道和跨膜Na+、K+电流的改变，进而影响神经细胞的兴奋特性，参与HE的发病。本研究拟探索这种可能性。
1.材料与方法：(1)HE动物模型：取Sprague-Dawley大白鼠32只，鼠龄10～15天，雌雄不限，随机分为2组。HE组：浅乙醚麻醉后开腹，切除肝脏的左、右侧叶和左、右中叶，保留乳头叶和尾状叶。对照组：麻醉、开腹但不切肝。(2)海马CA1区锥体细胞的急性分离：HE鼠进入肝昏迷时2组鼠同时断头取脑。然后分出海马，切成约500 μm厚的脑片，32℃预孵育2小时，酶解(1.5 g/L链霉蛋白酶E，32℃，40 min)，洗脑片，分出CA1区，用直径约为400 μm和150 μm的Pasteur吸管轻轻吹打，移细胞悬液于培养皿内[3]。(3)细胞外液：NaCl 150 mmol/L,KCl 5 mmol/L,CaCl2 2.6 mmol/L, MgCl2 1.1 mmol/L,HEPES 10 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L。用Tris-HCl调pH至7.4。(4)电极内液：KCl 65 mmol/L，KOH 5 mmol/L，KF 80 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，Na2-ATP 2 mmol/L。用Tris-HCl调pH至 7.2。(5)记录K+、Na+电流的全细胞膜片钳法：Na+电流：保持电位(HP)恒为-100mV，试验电位(TP)由-100 mV开始，每次刺激递增(Step)0mV，直到TP=+90 mV；刺激波宽80 ms，刺激频率1 Hz。瞬时外向型钾电流(IA)钳制方案：HP=-50 mV，TP的A段一律为-110 mV，TP的B段由-50 mV～+20 mV，Step=10 mV，刺激波宽320 ms，刺激频率1 Hz。迟发整流型钾电流(IK)钳制方案：TP的A段一律为-50 mV，其余参数同IA钳制方案。实验在20～24℃室温下进行。
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2.结果:16只实验鼠术后逐渐出现萎靡、嗜睡、运动减少、共济失调、对疼痛刺激失去反应，术后13.34±2.93小时(±s，下同)出现昏迷。据Bosman标准[1]判为V级肝性脑病。
两组鼠急性分离的海马CA1区锥体细胞的Na+电流对电压作图均呈抛物线形，多在TP为-70 mV时开始激活，电流强度随TP升高而增强，TP为-30 mV时最强；超过-30 mV后，随TP升高电流反而逐渐减弱。TP=+70 mV时多已失活。TP在-50～+50 mV之间所诱发的HE组Na+电流都较对照组显著减弱(P<0.05)。以TP=-30 mV的电流强度为例，HE组(1.84±1.13 nA,n=59,n为锥体细胞数，下同)较对照组(3.32±1.60 nA，n=30)显著减弱(P<0.01)。
在上述钳制条件下，两组鼠的IA和IK电流均随TP的升高而增强，两组间差异均无显著意义。以TP=+20 mV的电流强度为例，HE组(n=35)和对照组(n=30)的IA分别为0.903±0.474 nA和1.125±0.431 nA(P>0.05)。IK分别为0.418±0.514 nA和0.491±0.204 nA(P>0.05)。
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3.讨论：Na+电流在神经细胞动作电位产生和传播中的作用十分重要。本研究表明急性分离的HE鼠海马CA1区锥体细胞电压依赖性Na+电流减弱，这必将使中枢神经元动作电位的产生和传播出现障碍甚至阻滞。从而，有可能诱发和(或)加剧HE的发生和发展。
HE鼠海马CA1区锥体细胞Na+电流减弱的原因可能有三：(1)生长抑素的同效物质Sandostatin使急性分离的大白鼠海马CA1区锥体细胞Na+电流的强度减弱(另文报道)，而HE鼠脑内生长抑素受体结合位点数量增加[2]，将使生长抑素的抑制作用增强。(2)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)是一种兴奋性氨基酸，通过它与其相应受体作用可增强急性分离的大白鼠海马CA1区锥体细胞电压依赖性Na+电流强度，但在HE大鼠中此作用显著低于正常大鼠(另文报道)。(3)γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳动物脑内主要的抑制性神经介质，能增强急性分离的HE大鼠海马CA1区锥体细胞的内向电流。此作用对HE大鼠比正常大鼠显著增强(另文报道)。其结果将使神经元静息膜电位升高，当静息膜电位高过Na+通道的激活电位时，将导致Na+通道失活。
, 百拇医药
本研究未发现急性分离的大白鼠海马CA1区锥体细胞可能存在的K+电流改变。对此尚有待于进一步研究证实。
参考文献
1Bosman DK,Van-den-buijs CA,De-haan JG,et al.The effects of benzodiazepine-receptor antagonists and partial inverse agonists on acute hepatic encephalopathy in the rats. Gastroenterology,1991,101:772.
2Zhang ZM, Qiu FZ.An experimental study on somatostatin receptors in the brains of hepatic encephalopathy rats. J Tongji Medical University,1994,14:129.
3张宗明，吴才宏，阳冬梅，等.大白鼠海马CA1区锥体细胞的急性分离及其电生理学特性.北京医科大学学报，1997，29：5.
本课题受国家自然科学基金和中国博士后科学基金资助, 百拇医药
单位：100083 北京医科大学第三医院外科(张宗明、颜南生、傅卫、周孝思)；北京大学生物膜与膜生物工程国家重点实验室(吴才宏、周培爱、庄道斌、阳冬梅)
关键词：
中华外科杂志/980827 研究表明，肝性脑病(hepatic encephalopathy,HE)动物模型或人脑内调控离子通道的受体，如中枢型苯二氮卓受体、生长抑素受体，结合特性有改变[1，2]。这些改变有可能引起中枢神经元的电压依赖性离子通道和跨膜Na+、K+电流的改变，进而影响神经细胞的兴奋特性，参与HE的发病。本研究拟探索这种可能性。
1.材料与方法：(1)HE动物模型：取Sprague-Dawley大白鼠32只，鼠龄10～15天，雌雄不限，随机分为2组。HE组：浅乙醚麻醉后开腹，切除肝脏的左、右侧叶和左、右中叶，保留乳头叶和尾状叶。对照组：麻醉、开腹但不切肝。(2)海马CA1区锥体细胞的急性分离：HE鼠进入肝昏迷时2组鼠同时断头取脑。然后分出海马，切成约500 μm厚的脑片，32℃预孵育2小时，酶解(1.5 g/L链霉蛋白酶E，32℃，40 min)，洗脑片，分出CA1区，用直径约为400 μm和150 μm的Pasteur吸管轻轻吹打，移细胞悬液于培养皿内[3]。(3)细胞外液：NaCl 150 mmol/L,KCl 5 mmol/L,CaCl2 2.6 mmol/L, MgCl2 1.1 mmol/L,HEPES 10 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L。用Tris-HCl调pH至7.4。(4)电极内液：KCl 65 mmol/L，KOH 5 mmol/L，KF 80 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，Na2-ATP 2 mmol/L。用Tris-HCl调pH至 7.2。(5)记录K+、Na+电流的全细胞膜片钳法：Na+电流：保持电位(HP)恒为-100mV，试验电位(TP)由-100 mV开始，每次刺激递增(Step)0mV，直到TP=+90 mV；刺激波宽80 ms，刺激频率1 Hz。瞬时外向型钾电流(IA)钳制方案：HP=-50 mV，TP的A段一律为-110 mV，TP的B段由-50 mV～+20 mV，Step=10 mV，刺激波宽320 ms，刺激频率1 Hz。迟发整流型钾电流(IK)钳制方案：TP的A段一律为-50 mV，其余参数同IA钳制方案。实验在20～24℃室温下进行。
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2.结果:16只实验鼠术后逐渐出现萎靡、嗜睡、运动减少、共济失调、对疼痛刺激失去反应，术后13.34±2.93小时(±s，下同)出现昏迷。据Bosman标准[1]判为V级肝性脑病。
两组鼠急性分离的海马CA1区锥体细胞的Na+电流对电压作图均呈抛物线形，多在TP为-70 mV时开始激活，电流强度随TP升高而增强，TP为-30 mV时最强；超过-30 mV后，随TP升高电流反而逐渐减弱。TP=+70 mV时多已失活。TP在-50～+50 mV之间所诱发的HE组Na+电流都较对照组显著减弱(P<0.05)。以TP=-30 mV的电流强度为例，HE组(1.84±1.13 nA,n=59,n为锥体细胞数，下同)较对照组(3.32±1.60 nA，n=30)显著减弱(P<0.01)。
在上述钳制条件下，两组鼠的IA和IK电流均随TP的升高而增强，两组间差异均无显著意义。以TP=+20 mV的电流强度为例，HE组(n=35)和对照组(n=30)的IA分别为0.903±0.474 nA和1.125±0.431 nA(P>0.05)。IK分别为0.418±0.514 nA和0.491±0.204 nA(P>0.05)。
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3.讨论：Na+电流在神经细胞动作电位产生和传播中的作用十分重要。本研究表明急性分离的HE鼠海马CA1区锥体细胞电压依赖性Na+电流减弱，这必将使中枢神经元动作电位的产生和传播出现障碍甚至阻滞。从而，有可能诱发和(或)加剧HE的发生和发展。
HE鼠海马CA1区锥体细胞Na+电流减弱的原因可能有三：(1)生长抑素的同效物质Sandostatin使急性分离的大白鼠海马CA1区锥体细胞Na+电流的强度减弱(另文报道)，而HE鼠脑内生长抑素受体结合位点数量增加[2]，将使生长抑素的抑制作用增强。(2)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)是一种兴奋性氨基酸，通过它与其相应受体作用可增强急性分离的大白鼠海马CA1区锥体细胞电压依赖性Na+电流强度，但在HE大鼠中此作用显著低于正常大鼠(另文报道)。(3)γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳动物脑内主要的抑制性神经介质，能增强急性分离的HE大鼠海马CA1区锥体细胞的内向电流。此作用对HE大鼠比正常大鼠显著增强(另文报道)。其结果将使神经元静息膜电位升高，当静息膜电位高过Na+通道的激活电位时，将导致Na+通道失活。
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本研究未发现急性分离的大白鼠海马CA1区锥体细胞可能存在的K+电流改变。对此尚有待于进一步研究证实。
参考文献
1Bosman DK,Van-den-buijs CA,De-haan JG,et al.The effects of benzodiazepine-receptor antagonists and partial inverse agonists on acute hepatic encephalopathy in the rats. Gastroenterology,1991,101:772.
2Zhang ZM, Qiu FZ.An experimental study on somatostatin receptors in the brains of hepatic encephalopathy rats. J Tongji Medical University,1994,14:129.
3张宗明，吴才宏，阳冬梅，等.大白鼠海马CA1区锥体细胞的急性分离及其电生理学特性.北京医科大学学报，1997，29：5.
本课题受国家自然科学基金和中国博士后科学基金资助, 百拇医药