枯否细胞对内毒素吞噬能力的实验研究
作者：秦孝建 袁建成 周立新 肖光夏
单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院烧伤研究所
关键词：
中华外科杂志/980830 我们研究枯否细胞(KC)对内毒素(LPS)的清除能力及其本身的生物特性变化，以证实KC细胞在防治肠源性内毒素血症中的作用。
1.材料与方法：Wistar大鼠，雌雄不限，体重230±30 g，随机分为(1)烧伤组：30%烫伤。(2)正常对照组：不烫伤。
用胶原酶灌注法分离出肝细胞及KC细胞，并培养于RP-MI 1640培养液内，4小时后吸弃非贴壁细胞，洗脱附壁细胞，清洗，计数。RP-MI 1640培养液加10%小牛血清、青霉素105 U/L、链霉素100 mg/L、羟乙基哌基乙磺酸15 mmol。
, http://www.100md.com
调整细胞浓度，接种于24孔培养板，每孔1 ml,1×106个/ml。37℃，5%CO2培养箱孵育4小时，去除悬浮细胞，更换新鲜培养基。加各种处理因素继续培养至相应时限，无菌条件吸取上清，离心，过滤分装。分组：(1)正常KC细胞组(Ⅰ组)；(2)烧伤KC细胞组(Ⅱ组)；(3)活化枯否细胞组(Ⅲ组)(正常KC加入酵母多糖500 ng/孔)。
各实验组分组加入内毒素100 μg～10 pg，培养1～24小时后取上清，待测。测定内毒素、肿瘤坏死因子(TNF)、乳酸脱氢酶(LDH)。
2.结果：正常KC细胞吞噬内毒素能力明显强于烧伤组KC。其在3小时后就明显表现出来。在6小时达到吞噬最高峰，其后的LPS未见有明显下降。经酵母糖活化后，KC细胞的吞噬能力有所加强，表现为：(1)吞噬高峰提前到3小时；(2)上清LPS水平下降幅度至ng/ml水平。各组KC细胞培养上清中在各LPS浓度均可检测到TNF活性，6小时到达峰值。约在24小时后有所下降，各内毒素浓度与TNF分泌高峰在6小时，烧伤组各时相点虽然高于正常组，但差异无显著意义。
, 百拇医药
酵母多糖KC组分泌的TNF水平各时相明显高于正常组及烧伤组，且分泌高峰在3小时。
各KC组对乳酸脱氢酶(LDH)的释放均表现出明显的相关性，即LPS量越高则LDH释放量越大。同一剂量LPS培养时间越长，LDH的释放量越多。此外还发现，TNF分泌水平越高，LDH释放量也就越高。
3.讨论：KC细胞的重要功能是过滤清除由门静脉来的外源性物质，这个功能在防止由肠道吸收来的LPS进入体循环显得特别重要。我们的结果显示，正常和活化的KC具有非常大的吞噬LPS的能力，可将微克水平的LPS清除到毫微克水平，下降了近千倍。而烧伤后KC吞噬LPS的能力则明显减弱。虽然目前尚不清楚烧伤后KC吞噬下降的确切机制，但已有文献报道，与烧伤后KC的吞噬过度、表面受体的变化、PGE2的分泌有密切关系[1]。有趣的是，KC均将LPS由μg/ml水平吞噬到ng/ml水平，此范围可波动在1 μg～100 μg之间，似乎与内毒素的波动关系不明显，与预先加入的内毒素浓度无关。且吞噬高峰均在6小时，提高促进KC吞噬主要是LPS的浓度。
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尽管KC细胞在全身性内毒素血症中具有保护作用，但许多研究表明，KC细胞也参与了LPS有关的病理生理学改变。因为活化的KC细胞能分泌多种细胞毒性介质[2，3]。我们的结果显示，酵母多糖活化的KC，其对LPS吞噬能力较正常KC明显增强，但是TNF分泌能力也大幅提高。相反，烧伤后KC吞噬能力抑制，与活化的KC相比，其吞噬LPS明显下降且TNF分泌也显著降低。Arthur等[4]用棒状杆菌以增加KC的活性，却发现LPS致肝细胞毒性也明显增加，而用甲基棕榈酸抑制KC的功能，对LPS的肝细胞毒性也有保护作用[5]。结合我们的结果提示，试图通过活化KC来提高其对LPS吞噬能力的策略往往造成其毒性介质分泌的增加，从而加重肝脏或者机体本身损伤。因此如何维持KC的功能对于防止肠源内毒素血症乃至MOF均具有重要的临床意义。
LDH是反映细胞损伤的一种标志酶。我们的结果显示大剂量的LPS长时间的培养，以及大量分泌的TNF均可造成KC本身的损伤，提示在强调LPS诱导KC分泌介质造成机体损伤的病理过程时，LPS的直接损伤作用仍不容忽视[6]，而在LPS及炎症介质的双重作用下，机体的损伤会更加严重，预后往往不好[7]。
, 百拇医药
参考文献
1Ogte CK,Wu JZ,Salliwood BS,et al.The increased release of PGE2 by kupffer cells from burned guinea pigs.J Burn Care Rehabilition,1990,11:287-294.
2Decker K. Biologically active products of stimulated liver macrophages (kupffer cell).Eur J Biocen,1990,192:245-267.
3Bautista AP,Schuler A,Spolaricis Z,et al.TNF-α stimulated generatin by perfused rat liver and kupffer cells.Am J Physiol,1991,261:881-895.
, 百拇医药
4Arthur MJP,Kowalski-Sauhders P, Wright R.Corynebacterium paromelicited hepatic marophages domonstrate enhanced respiratory burns activity comparaed with esdent kupffer cells in rat.Gastroenterol,1996,91:174-181.
5Arhur MJP,Bentley IS,Tanner AR,et al.Oxygen-derived free radicats promote hapatic injury in the rat.Gastroenterology,1985,89:1114-1122.
6Bossuyt V,Dezanger RB,Wisse E.Cellular and subcellular distribution of LPS injury in rat liver and its inactivation by bilesalts.J Hepato,1988,325:337.
7Bigatello LM,Broitman SA,Fattori L,et al.Endotoxemia and mortality in cirrhotic patients. Am J Gastroenterol,1987,82:11-51.
本课题受国家自然科学基金资助, http://www.100md.com
单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院烧伤研究所
关键词：
中华外科杂志/980830 我们研究枯否细胞(KC)对内毒素(LPS)的清除能力及其本身的生物特性变化，以证实KC细胞在防治肠源性内毒素血症中的作用。
1.材料与方法：Wistar大鼠，雌雄不限，体重230±30 g，随机分为(1)烧伤组：30%烫伤。(2)正常对照组：不烫伤。
用胶原酶灌注法分离出肝细胞及KC细胞，并培养于RP-MI 1640培养液内，4小时后吸弃非贴壁细胞，洗脱附壁细胞，清洗，计数。RP-MI 1640培养液加10%小牛血清、青霉素105 U/L、链霉素100 mg/L、羟乙基哌基乙磺酸15 mmol。
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调整细胞浓度，接种于24孔培养板，每孔1 ml,1×106个/ml。37℃，5%CO2培养箱孵育4小时，去除悬浮细胞，更换新鲜培养基。加各种处理因素继续培养至相应时限，无菌条件吸取上清，离心，过滤分装。分组：(1)正常KC细胞组(Ⅰ组)；(2)烧伤KC细胞组(Ⅱ组)；(3)活化枯否细胞组(Ⅲ组)(正常KC加入酵母多糖500 ng/孔)。
各实验组分组加入内毒素100 μg～10 pg，培养1～24小时后取上清，待测。测定内毒素、肿瘤坏死因子(TNF)、乳酸脱氢酶(LDH)。
2.结果：正常KC细胞吞噬内毒素能力明显强于烧伤组KC。其在3小时后就明显表现出来。在6小时达到吞噬最高峰，其后的LPS未见有明显下降。经酵母糖活化后，KC细胞的吞噬能力有所加强，表现为：(1)吞噬高峰提前到3小时；(2)上清LPS水平下降幅度至ng/ml水平。各组KC细胞培养上清中在各LPS浓度均可检测到TNF活性，6小时到达峰值。约在24小时后有所下降，各内毒素浓度与TNF分泌高峰在6小时，烧伤组各时相点虽然高于正常组，但差异无显著意义。
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酵母多糖KC组分泌的TNF水平各时相明显高于正常组及烧伤组，且分泌高峰在3小时。
各KC组对乳酸脱氢酶(LDH)的释放均表现出明显的相关性，即LPS量越高则LDH释放量越大。同一剂量LPS培养时间越长，LDH的释放量越多。此外还发现，TNF分泌水平越高，LDH释放量也就越高。
3.讨论：KC细胞的重要功能是过滤清除由门静脉来的外源性物质，这个功能在防止由肠道吸收来的LPS进入体循环显得特别重要。我们的结果显示，正常和活化的KC具有非常大的吞噬LPS的能力，可将微克水平的LPS清除到毫微克水平，下降了近千倍。而烧伤后KC吞噬LPS的能力则明显减弱。虽然目前尚不清楚烧伤后KC吞噬下降的确切机制，但已有文献报道，与烧伤后KC的吞噬过度、表面受体的变化、PGE2的分泌有密切关系[1]。有趣的是，KC均将LPS由μg/ml水平吞噬到ng/ml水平，此范围可波动在1 μg～100 μg之间，似乎与内毒素的波动关系不明显，与预先加入的内毒素浓度无关。且吞噬高峰均在6小时，提高促进KC吞噬主要是LPS的浓度。
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尽管KC细胞在全身性内毒素血症中具有保护作用，但许多研究表明，KC细胞也参与了LPS有关的病理生理学改变。因为活化的KC细胞能分泌多种细胞毒性介质[2，3]。我们的结果显示，酵母多糖活化的KC，其对LPS吞噬能力较正常KC明显增强，但是TNF分泌能力也大幅提高。相反，烧伤后KC吞噬能力抑制，与活化的KC相比，其吞噬LPS明显下降且TNF分泌也显著降低。Arthur等[4]用棒状杆菌以增加KC的活性，却发现LPS致肝细胞毒性也明显增加，而用甲基棕榈酸抑制KC的功能，对LPS的肝细胞毒性也有保护作用[5]。结合我们的结果提示，试图通过活化KC来提高其对LPS吞噬能力的策略往往造成其毒性介质分泌的增加，从而加重肝脏或者机体本身损伤。因此如何维持KC的功能对于防止肠源内毒素血症乃至MOF均具有重要的临床意义。
LDH是反映细胞损伤的一种标志酶。我们的结果显示大剂量的LPS长时间的培养，以及大量分泌的TNF均可造成KC本身的损伤，提示在强调LPS诱导KC分泌介质造成机体损伤的病理过程时，LPS的直接损伤作用仍不容忽视[6]，而在LPS及炎症介质的双重作用下，机体的损伤会更加严重，预后往往不好[7]。
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参考文献
1Ogte CK,Wu JZ,Salliwood BS,et al.The increased release of PGE2 by kupffer cells from burned guinea pigs.J Burn Care Rehabilition,1990,11:287-294.
2Decker K. Biologically active products of stimulated liver macrophages (kupffer cell).Eur J Biocen,1990,192:245-267.
3Bautista AP,Schuler A,Spolaricis Z,et al.TNF-α stimulated generatin by perfused rat liver and kupffer cells.Am J Physiol,1991,261:881-895.
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4Arthur MJP,Kowalski-Sauhders P, Wright R.Corynebacterium paromelicited hepatic marophages domonstrate enhanced respiratory burns activity comparaed with esdent kupffer cells in rat.Gastroenterol,1996,91:174-181.
5Arhur MJP,Bentley IS,Tanner AR,et al.Oxygen-derived free radicats promote hapatic injury in the rat.Gastroenterology,1985,89:1114-1122.
6Bossuyt V,Dezanger RB,Wisse E.Cellular and subcellular distribution of LPS injury in rat liver and its inactivation by bilesalts.J Hepato,1988,325:337.
7Bigatello LM,Broitman SA,Fattori L,et al.Endotoxemia and mortality in cirrhotic patients. Am J Gastroenterol,1987,82:11-51.
本课题受国家自然科学基金资助, http://www.100md.com