bcl-2反义寡核苷酸诱导小细胞肺癌细胞凋亡
作者：王洁 王曾礼 朱元珏 郭子健
单位：610041 成都，华西医科大学附属第一医院呼吸内科[王洁(现在北京医科大学临床肿瘤医院)，王曾礼]，中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院呼吸科(朱元珏、郭子健)
关键词：
中华医学杂志980806 bcl-2是一类与细胞凋亡相关的癌基因，其过度表达所致细胞凋亡受抑制是肿瘤发生的重要基础，并增加肿瘤细胞对放疗和化疗的抵抗性。本试验以脂质体为载体，对bcl-2 mRNA翻译起始部位的反义寡核苷酸导入小细胞肺癌(SCLC)细胞，探讨其对SCLC细胞bcl-2蛋白表达、凋亡及化疗敏感性的作用。
一、材料与方法
1.细胞培养：SCLC细胞株来自北京协和医院病理科。复苏后以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37 ℃、5% CO2条件下培养，每2～3天传代一次，取对数生长期细胞种入60 mm细胞培养皿，初始密度5×106/ml，培养24小时，使细胞至少60%融合。
, 百拇医药
2.SP免疫细胞化学染色：按常规方法进行。
3.bcl-2反义、正义、无义寡核苷酸及引物：序列参见文献1。bcl-2、β-actin引物扩增产物分别为318 bp、400 bp。
4.脂质体Lipofectin(GIBCOBRL)-反义寡核苷酸转染SCLC细胞：将细胞分为5组，即反义、正义、无义寡核苷酸、反义寡核苷酸+Vp-16作用组及空白对照组(等体积消毒水代替寡核苷酸)。转染方法按试剂盒说明书进行。反义寡核苷酸浓度分别为5、10、15、20 μmol/L。转染 24小时后继续试验。
5.流式细胞术(FCM)DNA与Ig双标标本制备：按北京医科大学人民医院血液研究所方法进行。
6.转染后细胞RNA提取及RT-PCR：收集细胞，采用经典的异硫氰酸胍法提取RNA[2]。RT-PCR[1]以β-actin为内参照，以PBR 322 MSPI质粒DNA 2 μl作分子量标记。阳性带经密度扫描及 数据处理获得bcl-2 mRNA相对量。
, 百拇医药
7.转染后细胞DNA抽提及电泳：按中国医学科学院基础医学研究所生化研究室方法进行。以未加寡核苷酸及VP-16的细胞为阴性对照。
8.统计学分析：t检验。
二、结果
1.FCM检测bcl-2反义寡核苷酸对bcl-2表达的影响：SCLC细胞bcl-2表达主要位于胞浆，其阳性率为(91.2+0.12)%；反义寡核苷酸及反义寡核苷酸+Vp-16转染24小时，bcl-2阳性率分别为(49.2+0.24)%、(40.6+0.16)%，与对照组(91.8±0.22)%、(89.8±0.27)%比较差异有显著意义(P=0.05，P=0.05)；不同浓度反义寡核苷酸作用SCLC细胞bcl-2蛋白表达见表1。
表1 不同寡核苷酸对
bcl-2蛋白的表达(%，
±s) 组别
, 百拇医药
bcl-2蛋白表达
5
10
15
20
正义OND
91.4
±0.24
90.2
±0.27
90.2
±0.13
88.7
, 百拇医药
±0.23
反义OND
86.9
±0.33
72.4
±0.32
68.5
±0.25
49.2
±0.24
反义OND
+VP-16
82.6
, 百拇医药
±0.13
60.2
±0.16
51.9
±0.19
40.6
±0.16
无义OND
91.2
±0.26
90.6
±0.22
87.1
, 百拇医药
±0.31
83.6
±v0.17
注：5、10、15、20 μmol/L为ODN(寡核苷酸)浓度
2.bcl-2反义寡核苷酸对SCLC细胞凋亡的影响：bcl-2反义寡核苷酸作用所致的凋亡细胞见表2，因其合成价格昂贵，试验仅重复一次，故难以作统计学分析，但以所测数据看，Vp-16与反义寡核苷酸联合所致的凋亡细胞高于二者单用以及对照组，正义及无义寡核苷酸作用后的凋亡细胞数接近对照组。
表2 不同寡核苷酸对SCLC细胞
凋亡的影响(%) 组别
凋亡细胞
, 百拇医药
5
10
15
20
对照
11.8
20.3
20.9
22.8
正义OND
13.2
18.7
23.9
, 百拇医药
27.4
反义OND
20.3
31.5
39.2
46.5
反义OND
+VP-16
28.6
47.4
60.9
81.8
无义OND
, 百拇医药
12.6
20.2
23.4
25.6
注：5、10、15、20 μmol/L为ODN(寡核苷酸)的浓度
3.DNA电泳：20μmol/L反义寡核苷酸作用24小时即出现DNA“梯”现象，正义、无义、对照组则无。5、 10、 15 μmol/L反义寡核苷酸作用24小时亦未诱导出“梯”现象。
4.bcl-2 mRNA表达变化：20μmol/L bcl-2正义、无义、反义寡核苷酸作用24小时，经RT-PCR扩增后密度扫描，bcl-2 mRNA的相对表达量分别为0.845、0.821、0.863，与对照(0.868)相近，其中正义及无义寡核苷酸作用后bcl-2 mRNA与蛋白表达水平基本一致，而反义寡核苷酸组蛋白表达水平明显低于bcl-2 mRNA。
, 百拇医药
三、讨论
在证明SCLC细胞有高水平的bcl-2蛋白表达的基础上[3]，利用脂质体为载体，将20个碱基长度的反义寡核苷酸bcl-2作用于SCLC，结果显示其能特异性地抑制SCLC细胞增殖，并诱导细胞凋亡。20 μmol/L反义寡核苷酸作用24小时，凋亡细胞为46.5%，而正义及无义寡核苷酸则无诱导SCLC 细胞凋亡作用。bcl-2反义寡核苷酸+Vp-16组凋亡细胞较单纯的bcl-2反义寡核苷酸组增多，表明bcl-2反义寡核苷酸除能通过抑制bcl-2表达以诱导SCLC细胞凋亡外，尚可增强SCLC细胞对Vp-16的敏感性，与Keith等[1]在白血病中的观察相似。
bcl-2 mRNA反义寡核苷酸作用SCLC，通过抑制bcl-2 mRNA翻译，能有效抑制蛋白表达，且具有作用时间与浓度依赖性。未发现正义及无义寡核苷酸有此作用。bcl-2 mRNA的相对表达量与对照组以及正义、无义寡核苷酸作用组基本一致，但bcl-2蛋白表达降低，证实反义寡核苷酸并非在bcl-2 mRNA的形成与修饰水平，而在其翻译水平起作用。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Keith FJ, Bradburg DA, Zhu YM, et al. Inhibition of bcl-2 with antisense oligonucleotids induces apoptosis and increase sensitivity of AML blasts to Ara-C. Leukemia. 1995; 9：131-138
2 Chomczynski P, Nicoletta S. Single stop method of RNA isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-phenol-chloroform traction. Anal Biochem. 1987; 162：156-158.
3 王洁，王曾礼，陈明易.肺癌细胞凋亡及其相关基因与临床预后关系的初步研究.中华结核和呼吸杂志.1997；20：141-144.
本课题为国家自然科学基金资助项目(39570329)
(收稿：1997-10-31 修回：1998-04-18), http://www.100md.com
单位：610041 成都，华西医科大学附属第一医院呼吸内科[王洁(现在北京医科大学临床肿瘤医院)，王曾礼]，中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院呼吸科(朱元珏、郭子健)
关键词：
中华医学杂志980806 bcl-2是一类与细胞凋亡相关的癌基因，其过度表达所致细胞凋亡受抑制是肿瘤发生的重要基础，并增加肿瘤细胞对放疗和化疗的抵抗性。本试验以脂质体为载体，对bcl-2 mRNA翻译起始部位的反义寡核苷酸导入小细胞肺癌(SCLC)细胞，探讨其对SCLC细胞bcl-2蛋白表达、凋亡及化疗敏感性的作用。
一、材料与方法
1.细胞培养：SCLC细胞株来自北京协和医院病理科。复苏后以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37 ℃、5% CO2条件下培养，每2～3天传代一次，取对数生长期细胞种入60 mm细胞培养皿，初始密度5×106/ml，培养24小时，使细胞至少60%融合。
, 百拇医药
2.SP免疫细胞化学染色：按常规方法进行。
3.bcl-2反义、正义、无义寡核苷酸及引物：序列参见文献1。bcl-2、β-actin引物扩增产物分别为318 bp、400 bp。
4.脂质体Lipofectin(GIBCOBRL)-反义寡核苷酸转染SCLC细胞：将细胞分为5组，即反义、正义、无义寡核苷酸、反义寡核苷酸+Vp-16作用组及空白对照组(等体积消毒水代替寡核苷酸)。转染方法按试剂盒说明书进行。反义寡核苷酸浓度分别为5、10、15、20 μmol/L。转染 24小时后继续试验。
5.流式细胞术(FCM)DNA与Ig双标标本制备：按北京医科大学人民医院血液研究所方法进行。
6.转染后细胞RNA提取及RT-PCR：收集细胞，采用经典的异硫氰酸胍法提取RNA[2]。RT-PCR[1]以β-actin为内参照，以PBR 322 MSPI质粒DNA 2 μl作分子量标记。阳性带经密度扫描及 数据处理获得bcl-2 mRNA相对量。
, 百拇医药
7.转染后细胞DNA抽提及电泳：按中国医学科学院基础医学研究所生化研究室方法进行。以未加寡核苷酸及VP-16的细胞为阴性对照。
8.统计学分析：t检验。
二、结果
1.FCM检测bcl-2反义寡核苷酸对bcl-2表达的影响：SCLC细胞bcl-2表达主要位于胞浆，其阳性率为(91.2+0.12)%；反义寡核苷酸及反义寡核苷酸+Vp-16转染24小时，bcl-2阳性率分别为(49.2+0.24)%、(40.6+0.16)%，与对照组(91.8±0.22)%、(89.8±0.27)%比较差异有显著意义(P=0.05，P=0.05)；不同浓度反义寡核苷酸作用SCLC细胞bcl-2蛋白表达见表1。
表1 不同寡核苷酸对
bcl-2蛋白的表达(%，
±s) 组别, 百拇医药
bcl-2蛋白表达
5
10
15
20
正义OND
91.4
±0.24
90.2
±0.27
90.2
±0.13
88.7
, 百拇医药
±0.23
反义OND
86.9
±0.33
72.4
±0.32
68.5
±0.25
49.2
±0.24
反义OND
+VP-16
82.6
, 百拇医药
±0.13
60.2
±0.16
51.9
±0.19
40.6
±0.16
无义OND
91.2
±0.26
90.6
±0.22
87.1
, 百拇医药
±0.31
83.6
±v0.17
注：5、10、15、20 μmol/L为ODN(寡核苷酸)浓度
2.bcl-2反义寡核苷酸对SCLC细胞凋亡的影响：bcl-2反义寡核苷酸作用所致的凋亡细胞见表2，因其合成价格昂贵，试验仅重复一次，故难以作统计学分析，但以所测数据看，Vp-16与反义寡核苷酸联合所致的凋亡细胞高于二者单用以及对照组，正义及无义寡核苷酸作用后的凋亡细胞数接近对照组。
表2 不同寡核苷酸对SCLC细胞
凋亡的影响(%) 组别
凋亡细胞
, 百拇医药
5
10
15
20
对照
11.8
20.3
20.9
22.8
正义OND
13.2
18.7
23.9
, 百拇医药
27.4
反义OND
20.3
31.5
39.2
46.5
反义OND
+VP-16
28.6
47.4
60.9
81.8
无义OND
, 百拇医药
12.6
20.2
23.4
25.6
注：5、10、15、20 μmol/L为ODN(寡核苷酸)的浓度
3.DNA电泳：20μmol/L反义寡核苷酸作用24小时即出现DNA“梯”现象，正义、无义、对照组则无。5、 10、 15 μmol/L反义寡核苷酸作用24小时亦未诱导出“梯”现象。
4.bcl-2 mRNA表达变化：20μmol/L bcl-2正义、无义、反义寡核苷酸作用24小时，经RT-PCR扩增后密度扫描，bcl-2 mRNA的相对表达量分别为0.845、0.821、0.863，与对照(0.868)相近，其中正义及无义寡核苷酸作用后bcl-2 mRNA与蛋白表达水平基本一致，而反义寡核苷酸组蛋白表达水平明显低于bcl-2 mRNA。
, 百拇医药
三、讨论
在证明SCLC细胞有高水平的bcl-2蛋白表达的基础上[3]，利用脂质体为载体，将20个碱基长度的反义寡核苷酸bcl-2作用于SCLC，结果显示其能特异性地抑制SCLC细胞增殖，并诱导细胞凋亡。20 μmol/L反义寡核苷酸作用24小时，凋亡细胞为46.5%，而正义及无义寡核苷酸则无诱导SCLC 细胞凋亡作用。bcl-2反义寡核苷酸+Vp-16组凋亡细胞较单纯的bcl-2反义寡核苷酸组增多，表明bcl-2反义寡核苷酸除能通过抑制bcl-2表达以诱导SCLC细胞凋亡外，尚可增强SCLC细胞对Vp-16的敏感性，与Keith等[1]在白血病中的观察相似。
bcl-2 mRNA反义寡核苷酸作用SCLC，通过抑制bcl-2 mRNA翻译，能有效抑制蛋白表达，且具有作用时间与浓度依赖性。未发现正义及无义寡核苷酸有此作用。bcl-2 mRNA的相对表达量与对照组以及正义、无义寡核苷酸作用组基本一致，但bcl-2蛋白表达降低，证实反义寡核苷酸并非在bcl-2 mRNA的形成与修饰水平，而在其翻译水平起作用。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Keith FJ, Bradburg DA, Zhu YM, et al. Inhibition of bcl-2 with antisense oligonucleotids induces apoptosis and increase sensitivity of AML blasts to Ara-C. Leukemia. 1995; 9：131-138
2 Chomczynski P, Nicoletta S. Single stop method of RNA isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-phenol-chloroform traction. Anal Biochem. 1987; 162：156-158.
3 王洁，王曾礼，陈明易.肺癌细胞凋亡及其相关基因与临床预后关系的初步研究.中华结核和呼吸杂志.1997；20：141-144.
本课题为国家自然科学基金资助项目(39570329)
(收稿：1997-10-31 修回：1998-04-18), http://www.100md.com