血管紧张素Ⅱ2型受体基因缺失抑制诱导的成纤维细胞凋亡
作者：李文歌 陈香美 叶一舟 傅博 张颖 于力方
单位：100853 北京，中国人民解放军总医院肾科，中国人民解放军肾病中心暨重点实验室
关键词：脱噬作用；血管紧张素Ⅱ；受体，血管紧张素；成纤维细胞
中华医学杂志980803 【摘要】 目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)2型受体(AT2)基因表达与成纤维细胞凋亡的关系。方法 分别从正常(AT2+/+)和AT2受体基因缺失(AT2-/-)胎鼠培养皮肤成纤维细胞，经AngⅡ诱导后，采用RT-PCR检测成纤维细胞AngⅡ的AT1和AT2受体mRNA表达，分别用基因组DNA电泳、TUNEL染色和流式细胞仪等定性和定量方法检测细胞的凋亡改变。结果 经10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L浓度的AngⅡ刺激48小时，成纤维细胞的AT1和AT2受体基因表达均有显著增强，并与浓度呈正相关。经10-6和10-5 mol/L浓度的AngⅡ诱导72小时，AT2+/+成纤维细胞出现了明显的标志着细胞凋亡的基因组DNA片段化，凋亡细胞分别是(12.3±2.7)%和(21.7±6.7)%，而AT2-/-成纤维细胞则未出现明显的细胞凋亡改变。结论 AT2受体基因缺失后，抑制了AngⅡ介导的成纤维细胞凋亡，为进一步揭示AngⅡ的生理和病理作用提供了实验依据。
, 百拇医药
The deletion of AT2 receptor gene antagonizes angiotensinⅡ-induced apoptosis in fibroblasts Li Wenge, Chen Xiangmei, Ye Yizhou, et al. Division of Nephrology, General Hospital of Chinese PLA, Center of Nephrology and Key Laboratory of Chinese PLA, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To study the expression of angiotensinⅡ(AngⅡ) type 2 receptor (AT2) and its effect on the AngⅡ-induced apoptosis in fibroblasts. Methods Skin fibroblasts were cultured from the embryos of the AT2 receptor gene deleted (AT2-/-) and wild-type (AT2+/+) mice at 16 days of gestation. After AngⅡ being stimulated, the expressions of AT1 and AT2 receptor genes were examined by RT-PCR and the apoptotic changes were identified by genomic DNA electrophoresis, TUNEL staining and flow cytometry analysis of DNA contents. And they were compared in these two types of cultured fibroblasts. Results Treated with AngⅡfor 48h at the concentrations of 10-8, 10-7, 10-6 and 10-5 mol/L respectively, the expressions of AT1 and AT2 receptor genes were enhanced in a dose-dependent manner. Induced by AngⅡfor 72h at the concentrations of 10-6 and 10-5mol/L, genomic DNA fragmentation, one of convinced markers of cell apoptosis was found in the AT2+/+ fibroblasts, but not in the AT2-/- fibroblasts. The percentages of Ang-induced apoptosis of the AT2+/+ fibroblasts were (12.3±2.7)% (10-6 mol/L) and (21.7±6.7)% (10-5 mol/L) respectively. Conclusion The AngⅡ-induced apoptosis of fibroblasts was devoid after deletion of AT2 receptor gene.
, 百拇医药
【Key words】 Apoptosis AngiotensinⅡ Receptors, angiotensin Fibroblasts
(Natl Med J China, 1998, 78：570-573)
血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的受体包括1型(AT1)和2型(AT2)两种。AT2受体自1994年克隆出后，其功能至今仍不完全清楚[1]。早期的研究发现，在哺乳类动物的胚胎组织中存在着丰富的AT2受体mRNA，出生后则迅速降低，到成熟时除在脑、肾上腺和卵巢组织中有较低水平的mRNA外，其它组织器官均检测不到[2，3]，由此许多学者认为，AT2受体可能与组织器官的发育有关。1996年Yamada等[4，5]首次报道了AngⅡ通过AT2受体能够诱发PC12W和R3T3细胞系凋亡，初步揭示了AT2受体的功能。。本研究中，我们分别从正常和AT2受体基因缺失胎鼠培养了皮肤成纤维细胞，探讨了AT2受体基因表达与成纤维细胞凋亡的关系。
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材料与方法
一、材料
AT2受体基因缺失(以AT2-/-表示)小鼠和用于产生AT2受体基因缺失的正常小鼠(以AT2+/+表示，C57BL/6系)均由美国Vanderbilt大学生化系In agami教授馈赠[6]。
二、方法
1.胎鼠皮肤成纤维细胞的培养[7]：10周龄的AT2-/-雄性和雌性小鼠交配，雌鼠怀孕16天时取胎鼠皮肤剪碎，磷酸盐缓冲液(pH 7.4)冲洗后，用Ⅴ型胶原酶消化5～8分钟，加入含10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2孵箱内培养，约2天时细胞开始长出，4～5天时传代，取第3代细胞进行实验。用同样的方法培养AT2+/+胎鼠的皮肤成纤维细胞。两种成纤维细胞经α-平滑肌肌动蛋白α-smooth muscle actin)和波形蛋白(vimentin)抗体鉴定，纯度分别约为97%和96%。
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2.成纤维细胞AT1和AT2受体mRNA表达：AT2+/+和AT2-/-两种成纤维细胞经10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L四种浓度的AngⅡ刺激48小时后，用RNAzolBTM液分别提取总RNA，取10 μg总RNA进行逆转录(GIBCO试剂盒)，取1 μl逆转录产物进行聚合酶链反应(PCR)。AT1受体的引物序列是：正义5′-GCATCATCTTTGTGGTGGG-3′和反义5′-GAAGAAAAGCACAATCGCC-3′，扩增片段长度为603bp，变性温度是94 ℃，1分钟，退火温度为60℃，1分钟，延伸温度是72℃，1.5分钟，30个循环；AT2受体的引物序列是：正义5′-GCTGAGTAAGCTGATTTATG-3′和反义5′-TTAAGACACAAAGGTGTCCA-3′，扩增片段长度为1.2 kb，变性温度是94℃，1分钟，退火温度是58℃，1分钟，延伸温度是72 ℃，2分钟，35个循环。以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的PCR作为内参照(扩增片段长度为620 bp)。
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3.成纤维细胞凋亡的诱导：取AT2+/+和AT2-/-两种成纤维细胞，按1×106细胞/瓶分别种植于25cm2细胞培养瓶，待细胞长至融合状态后，分别加入含有10-7、10-6和10-5mol/L AngⅡ(美国Sigma公司)的1%FCS RPMI 1640培养基，诱导72小时后收集细胞检测。
4.细胞基因组DNA的提取和电泳：将收集的成纤维细胞用常规酚-氯仿的方法提取DNA，经RNAase消化后，取20 μg DNA在1%琼脂糖凝胶中电泳，观察染色质DNA是否出现梯形结构。
5.细胞凋亡的流式细胞仪检测：收集经AngⅡ刺激的两种成纤维细胞，分别调整为1×106，悬浮于PBS(pH7.4)中，胎酚蓝染色细胞拒染率分别约为90%～95%和91%～95%，70%乙醇固定12小时后，离心，经RNAase消化后用50 μg/ml的碘化丙啶染色30分钟，在流式细胞仪上按前、侧散光分离细胞群，判断处于A0期(凋亡细胞)的细胞比例。
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6.细胞凋亡的原位末端标记(TUNEL)检测：将成纤维细胞用4%多聚甲醛PBS(pH 7.4)室温下固定30分钟，用原位末端标记检测凋亡试剂盒(德国宝灵曼公司)检测凋亡的成纤维细胞。
7.细胞内游离Ca2+浓度测定：AT2+/+和AT2-/-两种成纤维细胞按5×103细胞/孔种植于96孔细胞培养板，12小时移去培养基，加入无血清RPMI 1640培养基，培养12小时，加入10-5mol/L浓度的AngⅡ分别刺激12、24和48小时，冲洗后，加入Fluo-3(浓度为20μmol/L)和F127(占总体积5%)染色40分钟，经RPMI 1640培养基冲洗后，用激光共聚焦显微镜测定细胞内游离Ca2+浓度。
三、统计学处理
本研究中数据资料均用
±s表示，两组间差异比较采用t检验。
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结 果
一、AngⅡ诱导的AT1和AT2受体mRNA的表达
在不同浓度的AngⅡ刺激下，AT2+/+和AT2-/-两种成纤维细胞的AT1受体mRNA水平均有明显升高，并与浓度呈正相关。在10-7、10-6和10-5 mol/L浓度的AngⅡ刺激下，AT2+/+成纤维细胞的AT2受体mRNA水平有显著升高，尤以10-5 mol/L浓度刺激升高的最为明显。上述结果表明，在一定浓度的AngⅡ刺激下，成纤维细胞AT1和AT2受体的基因表达均有明显升高，并与AngⅡ的刺激浓度有一定的相关性(图1a和1b)。
图1a AT2+/+成纤维细胞Ang Ⅱ受体mRNA
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表达的RT-PCR结果
二、DNA电泳结果
注：1、marker(1.0 kb)；2、1%FCS组；3、10-8mol/L
AngⅡ刺激组；4、10-7mol/L Ang Ⅱ刺激组；
5、10-6mol/L AngⅡ刺激组；6、10-5mol/L AngⅡ刺激组
图1b AT2-/-成纤维细胞AngⅡ受体mRNA
表达的RT-PCR结果
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在10-6和10-5 mol/L浓度的AngⅡ诱导下，AT2+/+成纤维细胞的DNA电泳出现了标志着细胞凋亡的“梯形结构”，在低于10-6 mol/L浓度(10-7 mol/L)的AngⅡ刺激下，细胞染色质DNA则未出现明显的改变。而AT2-/-成纤维细胞，在10-7、10-6和10-5 mol/L三种浓度的AngⅡ刺激下，均未发生上述细胞凋亡的改变(图2)。
注：1.marker AT2+/+成纤维细胞：2、10% FCS组；3、1% FCS组；4、1% FCS+10-7mol/L AngⅡ诱导组；5、1% FCS+10-6mol/L AngⅡ诱导组；6、1% FCS+10-5mol/L AngⅡ诱导组
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AT2-/-成纤维细胞：7、10% FCS组；8、1% FCS组；9、1% FCS+10-7mol/L AngⅡ诱导组；10、1% FCS+10-6mol/L Ang Ⅱ诱导组；11、1% FCS+10-5mol/L AngⅡ诱导组图2 成纤维细胞DNA电泳结果 三、流式细胞仪检测结果
利用流式细胞仪对AngⅡ10-7、10-6和10-5 mol/L三种浓度诱导的成纤维细胞凋亡情况分别进行了检测，结果见附表。
附表 成纤维细胞凋亡的流式细胞仪检测结果(%，
±s) Ang Ⅱ浓度
(mol/L)
, http://www.100md.com 成纤维细胞凋亡
AT2+/+
AT2-/-
未刺激组
3.8±1.0
3.7±0.7
10-7
4.0±0.5
3.8±0.8
10-6
12.3±2.7*
4.5±1.1
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10-5
21.7±6.7*
4.4±1.7
与未刺激组比较* P<0.01
四、细胞凋亡的原位末端标记检测结果
用原位末端标记方法检测经10-5mol/L浓度的AngⅡ诱导的成纤维细胞，在AT2-/-成纤维细胞中罕见凋亡细胞，而在AT2+/+成纤维细胞中则可见众多的凋亡细胞(图3)。
五、成纤维细胞内游离Ca2+浓度
经10-5mol/L浓度的AngⅡ刺激12、24和48小时，AT2+/+和AT2-/-两种成纤维细胞内游离Ca2+浓度较未刺激组均有显著升高，但两种成纤维细胞间比较则无明显差异(图4)。
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讨 论
在小鼠的组织脏器中，AT2受体mRNA水平的高峰期为14～19天孕龄的胎鼠，出生后则迅速下降[8]，因此我们选择了从16天孕龄的胎鼠培养皮肤成纤维细胞，用以探讨AT2受体基因表达与细胞凋亡的关系。
为了选择AngⅡ合适的诱导浓度，我们首先观察了AngⅡ刺激浓度与成纤维细胞AT1和AT2受体基因表达的关系，发现经10-7、10-6和10-5 mol/L三种
图3 成纤维细胞凋亡TUNEL检测结果
图4 两种成纤维细胞胞浆内游离Ca2+
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浓度比较
浓度的AngⅡ刺激后，AT2+/+成纤维细胞的AT1和AT2受体及AT2-/-成纤维细胞的AT1受体mRNA表达有明显增加，并与刺激浓度有一定的相关性。根据这一结果，我们选择了10-7、10-6和10-5 mol/L这三种浓度的AngⅡ来诱导成纤维细胞的凋亡实验，发现在10-6和10-5 mol/L这两种较高浓度的AngⅡ诱导下，AT2+/+成纤维细胞的染色质DNA出现了标志着细胞凋亡的片段化，尤以10-5 mol/L浓度的AngⅡ作用更为明显，而AT2-/-则未出现这种细胞凋亡的改变。应用细胞凋亡原位末端标记检测经AngⅡ诱导的成纤维细胞，进一步证实了上述结果。为了进一步了解AngⅡ诱导AT2+/+和AT2-/-两种成纤维细胞凋亡的情况，我们利用流式细胞仪，对上述三种浓度AngⅡ所诱发的凋亡细胞进行了检测，发现在AT2+/+成纤维细胞，10-6和10-5 mol/L浓度的AngⅡ所诱发的凋亡细胞分别占12.3%和21.7%，比未经AngⅡ刺激的成纤维细胞(约占3.8%)有明显的升高，在AT2-/-成纤维细胞，10-7、10-6和10-5 mol/L三种浓度的AngⅡ所诱发的凋亡细胞与未经AngⅡ刺激的成纤维细胞比较则无明显增加。以上实验结果表明，AT2受体的基因缺失阻断了AngⅡ诱发的成纤维细胞凋亡。
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核酸内切酶是形成凋亡细胞染色质DNA片段化的直接原因，参与细胞凋亡的核酸内切酶可分为二价金属离子(主要是Ca2+、Mg2+，少数是Mn2+)依赖性和非依赖性两类[9]。我们利用激光共聚焦显微镜，检测了AT2+/+和AT2-/-两种成纤维细胞经AngⅡ刺激前后细胞浆内游离Ca2+浓度，发现AngⅡ刺激后两种成纤维细胞胞浆内Ca2+浓度均有明显升高，但两种成纤维细胞间比较则无显著差异，提示AngⅡ诱导的Ca2+浓度增加是通过AT1受体介导的；在AngⅡ通过AT2受体介导的成纤维细胞凋亡中，参与DNA片段化形成的核酸内切酶可能为非Ca2+依赖性的。
在本研究中，我们发现AngⅡ刺激能促进成纤维细胞AT1和AT2受体mRNA表达，并能诱发细胞凋亡，AT2受体的缺失抑制了AngⅡ诱导的细胞凋亡，表明AngⅡ诱导的成纤维细胞凋亡是通过AT2受体介导的，本实验结果为进一步掌握AngⅡ的生理和病理作用提供了实验依据。
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参考文献
1 Ichiki T, Herold Cl, Kambayashi Y, et al. Cloning of the cDNA and genomic DNA of the mouse angiotensin Ⅱ type 2 receptor. Biochem Biophys Acta, 1994, 1189：247-250.
2 Shanmugam S, Sandberg K. Ontogeny of angiotensinⅡ receptors. Cell Biol Int, 1996, 20：169-176.
3 Ichiki T, Inagami T. Expression genomic organization and transcription of the mouse angiotensin Ⅱ type 2 receptor gene. Circ Res, 1995, 76：693-700.
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4 Yamada T, Horiuchi M, Dzau VJ. Angiotensin Ⅱ type 2 receptor mediates programmed cell death. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93：156-160.
5 Horiuchi M, Yamada T, Dzau VJ, et al. Interferon regulatory factor-1 up-regulates angiotensin Ⅱ type 2 receptor and induces apoptosis. J Bio Chem, 1997, 171：11952-11952.
6 Ichiki T, labosky PA, Shiota C, et al. Effects on blood pressure and exploratory behavior of mice lacking angiotensin Ⅱ receptor. Nature, 1995, 377：748-750.
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7 Hogan B, Beddington R, Costantini F, et al. Mouse embryo fibroblasts as feeder layers. In: Hogan B, Beddington R, Costantini F and Lacy E eds. Manipulating the mouse embryo, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1994, F260.
8 Kakuchi J, Ichiki T, Kiyama S, et al. Developmental expression of renal angiotensin Ⅱ recpeptor genes in the mouse. Kidney Int, 1995, 47：140-147.
9 邓友平，肖培根.核酸内切酶在细胞凋亡中的作用.生物化学和生物物理进展，1997，24：26-31.
(收稿：1997-12-10 修回：1997-04-27), http://www.100md.com
单位：100853 北京，中国人民解放军总医院肾科，中国人民解放军肾病中心暨重点实验室
关键词：脱噬作用；血管紧张素Ⅱ；受体，血管紧张素；成纤维细胞
中华医学杂志980803 【摘要】 目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)2型受体(AT2)基因表达与成纤维细胞凋亡的关系。方法 分别从正常(AT2+/+)和AT2受体基因缺失(AT2-/-)胎鼠培养皮肤成纤维细胞，经AngⅡ诱导后，采用RT-PCR检测成纤维细胞AngⅡ的AT1和AT2受体mRNA表达，分别用基因组DNA电泳、TUNEL染色和流式细胞仪等定性和定量方法检测细胞的凋亡改变。结果 经10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L浓度的AngⅡ刺激48小时，成纤维细胞的AT1和AT2受体基因表达均有显著增强，并与浓度呈正相关。经10-6和10-5 mol/L浓度的AngⅡ诱导72小时，AT2+/+成纤维细胞出现了明显的标志着细胞凋亡的基因组DNA片段化，凋亡细胞分别是(12.3±2.7)%和(21.7±6.7)%，而AT2-/-成纤维细胞则未出现明显的细胞凋亡改变。结论 AT2受体基因缺失后，抑制了AngⅡ介导的成纤维细胞凋亡，为进一步揭示AngⅡ的生理和病理作用提供了实验依据。
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The deletion of AT2 receptor gene antagonizes angiotensinⅡ-induced apoptosis in fibroblasts Li Wenge, Chen Xiangmei, Ye Yizhou, et al. Division of Nephrology, General Hospital of Chinese PLA, Center of Nephrology and Key Laboratory of Chinese PLA, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To study the expression of angiotensinⅡ(AngⅡ) type 2 receptor (AT2) and its effect on the AngⅡ-induced apoptosis in fibroblasts. Methods Skin fibroblasts were cultured from the embryos of the AT2 receptor gene deleted (AT2-/-) and wild-type (AT2+/+) mice at 16 days of gestation. After AngⅡ being stimulated, the expressions of AT1 and AT2 receptor genes were examined by RT-PCR and the apoptotic changes were identified by genomic DNA electrophoresis, TUNEL staining and flow cytometry analysis of DNA contents. And they were compared in these two types of cultured fibroblasts. Results Treated with AngⅡfor 48h at the concentrations of 10-8, 10-7, 10-6 and 10-5 mol/L respectively, the expressions of AT1 and AT2 receptor genes were enhanced in a dose-dependent manner. Induced by AngⅡfor 72h at the concentrations of 10-6 and 10-5mol/L, genomic DNA fragmentation, one of convinced markers of cell apoptosis was found in the AT2+/+ fibroblasts, but not in the AT2-/- fibroblasts. The percentages of Ang-induced apoptosis of the AT2+/+ fibroblasts were (12.3±2.7)% (10-6 mol/L) and (21.7±6.7)% (10-5 mol/L) respectively. Conclusion The AngⅡ-induced apoptosis of fibroblasts was devoid after deletion of AT2 receptor gene.
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【Key words】 Apoptosis AngiotensinⅡ Receptors, angiotensin Fibroblasts
(Natl Med J China, 1998, 78：570-573)
血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的受体包括1型(AT1)和2型(AT2)两种。AT2受体自1994年克隆出后，其功能至今仍不完全清楚[1]。早期的研究发现，在哺乳类动物的胚胎组织中存在着丰富的AT2受体mRNA，出生后则迅速降低，到成熟时除在脑、肾上腺和卵巢组织中有较低水平的mRNA外，其它组织器官均检测不到[2，3]，由此许多学者认为，AT2受体可能与组织器官的发育有关。1996年Yamada等[4，5]首次报道了AngⅡ通过AT2受体能够诱发PC12W和R3T3细胞系凋亡，初步揭示了AT2受体的功能。。本研究中，我们分别从正常和AT2受体基因缺失胎鼠培养了皮肤成纤维细胞，探讨了AT2受体基因表达与成纤维细胞凋亡的关系。
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材料与方法
一、材料
AT2受体基因缺失(以AT2-/-表示)小鼠和用于产生AT2受体基因缺失的正常小鼠(以AT2+/+表示，C57BL/6系)均由美国Vanderbilt大学生化系In agami教授馈赠[6]。
二、方法
1.胎鼠皮肤成纤维细胞的培养[7]：10周龄的AT2-/-雄性和雌性小鼠交配，雌鼠怀孕16天时取胎鼠皮肤剪碎，磷酸盐缓冲液(pH 7.4)冲洗后，用Ⅴ型胶原酶消化5～8分钟，加入含10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2孵箱内培养，约2天时细胞开始长出，4～5天时传代，取第3代细胞进行实验。用同样的方法培养AT2+/+胎鼠的皮肤成纤维细胞。两种成纤维细胞经α-平滑肌肌动蛋白α-smooth muscle actin)和波形蛋白(vimentin)抗体鉴定，纯度分别约为97%和96%。
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2.成纤维细胞AT1和AT2受体mRNA表达：AT2+/+和AT2-/-两种成纤维细胞经10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L四种浓度的AngⅡ刺激48小时后，用RNAzolBTM液分别提取总RNA，取10 μg总RNA进行逆转录(GIBCO试剂盒)，取1 μl逆转录产物进行聚合酶链反应(PCR)。AT1受体的引物序列是：正义5′-GCATCATCTTTGTGGTGGG-3′和反义5′-GAAGAAAAGCACAATCGCC-3′，扩增片段长度为603bp，变性温度是94 ℃，1分钟，退火温度为60℃，1分钟，延伸温度是72℃，1.5分钟，30个循环；AT2受体的引物序列是：正义5′-GCTGAGTAAGCTGATTTATG-3′和反义5′-TTAAGACACAAAGGTGTCCA-3′，扩增片段长度为1.2 kb，变性温度是94℃，1分钟，退火温度是58℃，1分钟，延伸温度是72 ℃，2分钟，35个循环。以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的PCR作为内参照(扩增片段长度为620 bp)。
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3.成纤维细胞凋亡的诱导：取AT2+/+和AT2-/-两种成纤维细胞，按1×106细胞/瓶分别种植于25cm2细胞培养瓶，待细胞长至融合状态后，分别加入含有10-7、10-6和10-5mol/L AngⅡ(美国Sigma公司)的1%FCS RPMI 1640培养基，诱导72小时后收集细胞检测。
4.细胞基因组DNA的提取和电泳：将收集的成纤维细胞用常规酚-氯仿的方法提取DNA，经RNAase消化后，取20 μg DNA在1%琼脂糖凝胶中电泳，观察染色质DNA是否出现梯形结构。
5.细胞凋亡的流式细胞仪检测：收集经AngⅡ刺激的两种成纤维细胞，分别调整为1×106，悬浮于PBS(pH7.4)中，胎酚蓝染色细胞拒染率分别约为90%～95%和91%～95%，70%乙醇固定12小时后，离心，经RNAase消化后用50 μg/ml的碘化丙啶染色30分钟，在流式细胞仪上按前、侧散光分离细胞群，判断处于A0期(凋亡细胞)的细胞比例。
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6.细胞凋亡的原位末端标记(TUNEL)检测：将成纤维细胞用4%多聚甲醛PBS(pH 7.4)室温下固定30分钟，用原位末端标记检测凋亡试剂盒(德国宝灵曼公司)检测凋亡的成纤维细胞。
7.细胞内游离Ca2+浓度测定：AT2+/+和AT2-/-两种成纤维细胞按5×103细胞/孔种植于96孔细胞培养板，12小时移去培养基，加入无血清RPMI 1640培养基，培养12小时，加入10-5mol/L浓度的AngⅡ分别刺激12、24和48小时，冲洗后，加入Fluo-3(浓度为20μmol/L)和F127(占总体积5%)染色40分钟，经RPMI 1640培养基冲洗后，用激光共聚焦显微镜测定细胞内游离Ca2+浓度。
三、统计学处理
本研究中数据资料均用
±s表示，两组间差异比较采用t检验。, http://www.100md.com
结 果
一、AngⅡ诱导的AT1和AT2受体mRNA的表达
在不同浓度的AngⅡ刺激下，AT2+/+和AT2-/-两种成纤维细胞的AT1受体mRNA水平均有明显升高，并与浓度呈正相关。在10-7、10-6和10-5 mol/L浓度的AngⅡ刺激下，AT2+/+成纤维细胞的AT2受体mRNA水平有显著升高，尤以10-5 mol/L浓度刺激升高的最为明显。上述结果表明，在一定浓度的AngⅡ刺激下，成纤维细胞AT1和AT2受体的基因表达均有明显升高，并与AngⅡ的刺激浓度有一定的相关性(图1a和1b)。
图1a AT2+/+成纤维细胞Ang Ⅱ受体mRNA
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表达的RT-PCR结果
二、DNA电泳结果
注：1、marker(1.0 kb)；2、1%FCS组；3、10-8mol/L
AngⅡ刺激组；4、10-7mol/L Ang Ⅱ刺激组；
5、10-6mol/L AngⅡ刺激组；6、10-5mol/L AngⅡ刺激组
图1b AT2-/-成纤维细胞AngⅡ受体mRNA
表达的RT-PCR结果
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在10-6和10-5 mol/L浓度的AngⅡ诱导下，AT2+/+成纤维细胞的DNA电泳出现了标志着细胞凋亡的“梯形结构”，在低于10-6 mol/L浓度(10-7 mol/L)的AngⅡ刺激下，细胞染色质DNA则未出现明显的改变。而AT2-/-成纤维细胞，在10-7、10-6和10-5 mol/L三种浓度的AngⅡ刺激下，均未发生上述细胞凋亡的改变(图2)。
注：1.marker AT2+/+成纤维细胞：2、10% FCS组；3、1% FCS组；4、1% FCS+10-7mol/L AngⅡ诱导组；5、1% FCS+10-6mol/L AngⅡ诱导组；6、1% FCS+10-5mol/L AngⅡ诱导组
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AT2-/-成纤维细胞：7、10% FCS组；8、1% FCS组；9、1% FCS+10-7mol/L AngⅡ诱导组；10、1% FCS+10-6mol/L Ang Ⅱ诱导组；11、1% FCS+10-5mol/L AngⅡ诱导组图2 成纤维细胞DNA电泳结果 三、流式细胞仪检测结果
利用流式细胞仪对AngⅡ10-7、10-6和10-5 mol/L三种浓度诱导的成纤维细胞凋亡情况分别进行了检测，结果见附表。
附表 成纤维细胞凋亡的流式细胞仪检测结果(%，
±s) Ang Ⅱ浓度(mol/L)
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AT2+/+
AT2-/-
未刺激组
3.8±1.0
3.7±0.7
10-7
4.0±0.5
3.8±0.8
10-6
12.3±2.7*
4.5±1.1
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21.7±6.7*
4.4±1.7
与未刺激组比较* P<0.01
四、细胞凋亡的原位末端标记检测结果
用原位末端标记方法检测经10-5mol/L浓度的AngⅡ诱导的成纤维细胞，在AT2-/-成纤维细胞中罕见凋亡细胞，而在AT2+/+成纤维细胞中则可见众多的凋亡细胞(图3)。
五、成纤维细胞内游离Ca2+浓度
经10-5mol/L浓度的AngⅡ刺激12、24和48小时，AT2+/+和AT2-/-两种成纤维细胞内游离Ca2+浓度较未刺激组均有显著升高，但两种成纤维细胞间比较则无明显差异(图4)。
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讨 论
在小鼠的组织脏器中，AT2受体mRNA水平的高峰期为14～19天孕龄的胎鼠，出生后则迅速下降[8]，因此我们选择了从16天孕龄的胎鼠培养皮肤成纤维细胞，用以探讨AT2受体基因表达与细胞凋亡的关系。
为了选择AngⅡ合适的诱导浓度，我们首先观察了AngⅡ刺激浓度与成纤维细胞AT1和AT2受体基因表达的关系，发现经10-7、10-6和10-5 mol/L三种
图3 成纤维细胞凋亡TUNEL检测结果
图4 两种成纤维细胞胞浆内游离Ca2+
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浓度比较
浓度的AngⅡ刺激后，AT2+/+成纤维细胞的AT1和AT2受体及AT2-/-成纤维细胞的AT1受体mRNA表达有明显增加，并与刺激浓度有一定的相关性。根据这一结果，我们选择了10-7、10-6和10-5 mol/L这三种浓度的AngⅡ来诱导成纤维细胞的凋亡实验，发现在10-6和10-5 mol/L这两种较高浓度的AngⅡ诱导下，AT2+/+成纤维细胞的染色质DNA出现了标志着细胞凋亡的片段化，尤以10-5 mol/L浓度的AngⅡ作用更为明显，而AT2-/-则未出现这种细胞凋亡的改变。应用细胞凋亡原位末端标记检测经AngⅡ诱导的成纤维细胞，进一步证实了上述结果。为了进一步了解AngⅡ诱导AT2+/+和AT2-/-两种成纤维细胞凋亡的情况，我们利用流式细胞仪，对上述三种浓度AngⅡ所诱发的凋亡细胞进行了检测，发现在AT2+/+成纤维细胞，10-6和10-5 mol/L浓度的AngⅡ所诱发的凋亡细胞分别占12.3%和21.7%，比未经AngⅡ刺激的成纤维细胞(约占3.8%)有明显的升高，在AT2-/-成纤维细胞，10-7、10-6和10-5 mol/L三种浓度的AngⅡ所诱发的凋亡细胞与未经AngⅡ刺激的成纤维细胞比较则无明显增加。以上实验结果表明，AT2受体的基因缺失阻断了AngⅡ诱发的成纤维细胞凋亡。
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核酸内切酶是形成凋亡细胞染色质DNA片段化的直接原因，参与细胞凋亡的核酸内切酶可分为二价金属离子(主要是Ca2+、Mg2+，少数是Mn2+)依赖性和非依赖性两类[9]。我们利用激光共聚焦显微镜，检测了AT2+/+和AT2-/-两种成纤维细胞经AngⅡ刺激前后细胞浆内游离Ca2+浓度，发现AngⅡ刺激后两种成纤维细胞胞浆内Ca2+浓度均有明显升高，但两种成纤维细胞间比较则无显著差异，提示AngⅡ诱导的Ca2+浓度增加是通过AT1受体介导的；在AngⅡ通过AT2受体介导的成纤维细胞凋亡中，参与DNA片段化形成的核酸内切酶可能为非Ca2+依赖性的。
在本研究中，我们发现AngⅡ刺激能促进成纤维细胞AT1和AT2受体mRNA表达，并能诱发细胞凋亡，AT2受体的缺失抑制了AngⅡ诱导的细胞凋亡，表明AngⅡ诱导的成纤维细胞凋亡是通过AT2受体介导的，本实验结果为进一步掌握AngⅡ的生理和病理作用提供了实验依据。
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参考文献
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5 Horiuchi M, Yamada T, Dzau VJ, et al. Interferon regulatory factor-1 up-regulates angiotensin Ⅱ type 2 receptor and induces apoptosis. J Bio Chem, 1997, 171：11952-11952.
6 Ichiki T, labosky PA, Shiota C, et al. Effects on blood pressure and exploratory behavior of mice lacking angiotensin Ⅱ receptor. Nature, 1995, 377：748-750.
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8 Kakuchi J, Ichiki T, Kiyama S, et al. Developmental expression of renal angiotensin Ⅱ recpeptor genes in the mouse. Kidney Int, 1995, 47：140-147.
9 邓友平，肖培根.核酸内切酶在细胞凋亡中的作用.生物化学和生物物理进展，1997，24：26-31.
(收稿：1997-12-10 修回：1997-04-27), http://www.100md.com