缺氧缺血大鼠脑细胞凋亡的研究
作者：蒋犁 汤云珍 黄晓明 俞咏华 陈平圣 胡向阳 邵小松 易文龙
单位：210009 南京铁道医学院附属医院儿科(蒋犁、汤云珍、俞咏华、邵小松、易文龙)；南京铁道医学院科学研究所分子生物学研究室(黄晓明、胡向阳)，病理学教研室(陈平圣)
关键词：脑缺氧；脑缺血；脱噬作用；大鼠
中华医学杂志980802 【摘要】 目的 探讨脑细胞凋亡在缺氧缺血脑病(HIE)发病机理中的作用。方法 用HE染色、电镜、原位末端标记(Tunel)手段，分别对缺氧3小时后缺血1、4、18、24、40及72小时和7天组大鼠的脑组织中凋亡细胞的形态、出现时间及密度进行观察和比较。结果 光、电镜下显示实验侧脑皮质、海马及丘脑神经元皱缩、染色质凝集并出现凋亡小体；Tunel方法证实有裂解DNA存在；缺氧缺血后18小时皮质凋亡最明显。结论 在HIE大鼠，脑细胞凋亡出现不但早于坏死，而且与坏死存在着诱导剂量相关性。
, 百拇医药
Brain cell apoptosis after cerebral hypoxia-ischemia in neonatal rat Jiang Li, Tang Yunzhen, Huang Xiaoming, et al. Department of Pediatrics, Nanjing Railway Medical college, Nanjing 210009
【Abstract】 Objective To investigate action of apoptosis in mechanisms of neonatal hypoxia-ischemia(HIE). Methods Using HE staining, electronmicroscope, and terminal deoxynuleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) technique, we observed the histological features, time course and density of apoptotic cells and compared the ipsilateral hemisphere after permanent ischemia 1, 4, 18, 24, 40, 72h, 7 days after 3h hypoxia with that of sham-group. Results Neurons in the cortex, hippocampus, thalamus exhibited cells shrink, chromatin condensation, apoptosis bodys under microscope, as demonstrated by in situ labeling of DNA breaks. The peak for apoptosis was shown at 18h in the cortex. Conclusion In the HIE, apoptosis appears earlier than necrosis, and both of the different cell death forms may exist induced dose relativity.
, 百拇医药
【Key words】 Cerebral anoxia Cerebral ischemia Apoptosis Rats
(Natl Med J China, 1998, 78：567-569)
传统观点认为，新生儿缺氧缺血脑病(HIE)是由于急性脑水肿、坏死所致。本研究旨在建立HIE的动物模型，观察脑损伤中脑细胞死亡的另一种形式——细胞凋亡，为探讨HIE的发病机理提供依据。
材料和方法
一、材料
模型制备：新生7天的SD大鼠72只，随机分为9组，其中2组分别为对照组和假手术组(仅游离出颈动脉，不做结扎)，其余7组按 Rice等[1]方法行左颈动脉结扎术后置于8%氧气中3小时后，分别于结扎后1、4、18、24、40和72小时及7天(对照和假手术组同于18小时)，经心脏插管，生理盐水冲洗，后灌入4 %多聚甲醛，灌毕即取左脑，外固定。
, 百拇医药
二、方法
1.光镜检查：取丘脑中1/3平面行冠状切片，片厚5 μm，石蜡包埋，HE染色，光镜检查。
2.超微结构观察：在光镜检查的取材部位，取皮质、海马、丘脑组织，常规固定、包埋、切片、染色，透视电镜下观察、摄片。
3.原位末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)标记法(Tunel)[2]：切片做HE染色光镜观察后，邻近处的石蜡切片定为标记靶组织，并取对照组相对应组织作为阴性对照。采用德国Boenriger Mannheimgs公司试剂,具体流程：组织切片常规脱蜡后，滴加20 μg/ml蛋白酶K，双蒸水漂洗。将样片浸入TdT缓冲液(30 mmol/L Trizma基础液，pH 7.2，140 mmol/L碳酸氢钠二甲胂酸盐，1 mmol/L COCl2) 。再孵育于Tunel反应液(50 μl TdT缓冲液8.3U，TdT 1 nmol地高辛基体11-dUTP)。用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后，滴加碱性磷酸酶，再用PBS漂洗。将样片置于碱性磷酸酶显色底物(NBT/BCIP)液中避光显色，后双蒸水终止反应。核固红复染，封固，显微镜观察照相。同时做Tunel法染色对照试验， Tunel反应液中不加TdT酶。
, 百拇医药
图1 实验组大鼠脑皮质(HIE后18小时)，可见核膜周围形成特征性环状致密染色质()，在细胞外的凋亡小体(↑) Tunel ×400 图2 对照组大鼠脑皮质，未见明显的阳性细胞 Tunel ×200 图3 实验组大鼠脑海马(HIE后24小时)，可见神经元大部分核染色阳性，核固缩 Tunel ×200
4.观察指标：用测微网计数阳性细胞数，40×目镜，6个视野，对平均1.0 mm2内凋亡细胞数，进行批间比较，Sas-6.04软件进行处理。
结 果
一、光镜下观察
缺氧缺血1小时实验侧神经细胞以轻度水肿为主。18小时皮质、海马回、丘脑组织中细胞出现凋亡典型的3种变性形态[3]：细胞皱缩；细胞核固缩，周围有空泡形成；可见核碎片，单个圆形凋亡小体。24小时后神经细胞损伤渐以核溶解、膜破裂及坏死为主。72小时脑组织中可见界限清楚的坏死灶，伴随神经细胞死亡，部分组织增生活跃。
, 百拇医药
缺氧缺血后1小时在皮质部位即出现凋亡细胞，为11.1±1.8个/mm2，4小时最明显为21.8±1.7个/mm2；凋亡的高峰时间约为18小时，凋亡细胞数为44±4个/mm2；24小时下降到38±3个/mm2，40小时下降到13.5±1.2个/mm2，7天已趋于正常，为1.5±0.8个/mm2。对照组为0.8±0.4个/mm2。两两比较：除1小时与40小时组P>0.05外，余各组之间均P<0.001。
二、电镜下观察
4～24小时组实验侧神经细胞在电镜下显现凋亡特征，以18小时为著：核膜皱缩、泡状突起，染色质致密，胞浆空泡明显，内质网肿胀。24小时后神经细胞形态渐以坏死为主。
三、原位TdT缺口末端标记
, 百拇医药
各组实验侧均可以观察到凋亡细胞——DNA片段末端标记的阳性细胞(图1～3)，1小时皮质部位阳性细胞为14.6±2.3个/mm2，4小时为34±4个/mm2，18小时阳性细胞呈深紫色，且范围广为61±6个/mm2，24小时为51±6个/mm2。对照组阳性信号不明显，为0.8±0.4个/mm2。两两比较，各组之间均P<0.01。Tunel法与HE染色在HIE大鼠脑细胞凋亡时间、流程上方向一致(图4)。
图4 两种方法在相同时间点的脑皮质凋亡细胞数比较
讨 论
过去认为脑缺血后神经细胞死亡形式是坏死。自1993年来有报道，成熟动物脑缺血后发生细胞凋亡，缺血性脑损伤脑细胞死亡存在坏死和凋亡两种形式[4，5]。本实验所用的Tunel方法较一般方法敏感，因为其检测出的凋亡细胞早于形态学凋亡改变和凋亡小体形成。
, 百拇医药
我们通过对缺氧缺血脑损伤新生大鼠模型的观察，证实了在HIE中存在凋亡现象。并发现缺氧3小时后缺血1小时即可有细胞核膜起泡、染色质凝集现象。随着缺血时间延长，凋亡细胞逐渐增多，出现细胞固缩、凋亡小体等凋亡中晚期形态特征，18小时达高峰，24小时后脑细胞形态逐以坏死为主，40～72小时坏死严重，72小时～7天坏死恢复期，凋亡表现逐渐减轻和消失。提示，在HIE脑损伤中神经细胞死亡不是简单的坏死，而存在复杂的凋亡过程；时间曲线显示出凋亡出现在缺氧缺血脑损伤的24小时内，早于脑细胞明显坏死之前。表明，在HIE时存在凋亡和坏死两种不同的细胞死亡的方式，存在着诱导剂量相关性。
参考文献
1 Hill IE, Macmanus JP, Rasquinha L, et al. DNA fragmentation indicative of apoptosis following unilateral cerebral hypoxia ischemia in the neonatal rat. Brain Res, 1995, 676：398-403.
, 百拇医药
2 Wijsman JH, Jonker RR, Keijzer R, et al. A new method to detect apoptosis in paraff insections: in situ end labeling of fragmented DNA.J Histochem Cytochem, 1993, 41：7-12.
3 Charriaut Marlangue C, Margaill L, Represa A, et al. Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab, 1996, 16：186-194.
4 MacManus JP, Hill IE, Huang ZG, et al. DNA damage consistent with apoptosis in transient focal ischemic neocortex. Neuro report, 1994, 5：493-496.
5 Sei Y, Von Lubitz KJ, Basile AS, et al. Internucleosomal DNA fragmentation in gerbil hippocampus following forebrain ischemia. Neurosci Lett, 1994, 171：179-182.
(收稿：1997-11-10 修回：1998-02-23), http://www.100md.com
单位：210009 南京铁道医学院附属医院儿科(蒋犁、汤云珍、俞咏华、邵小松、易文龙)；南京铁道医学院科学研究所分子生物学研究室(黄晓明、胡向阳)，病理学教研室(陈平圣)
关键词：脑缺氧；脑缺血；脱噬作用；大鼠
中华医学杂志980802 【摘要】 目的 探讨脑细胞凋亡在缺氧缺血脑病(HIE)发病机理中的作用。方法 用HE染色、电镜、原位末端标记(Tunel)手段，分别对缺氧3小时后缺血1、4、18、24、40及72小时和7天组大鼠的脑组织中凋亡细胞的形态、出现时间及密度进行观察和比较。结果 光、电镜下显示实验侧脑皮质、海马及丘脑神经元皱缩、染色质凝集并出现凋亡小体；Tunel方法证实有裂解DNA存在；缺氧缺血后18小时皮质凋亡最明显。结论 在HIE大鼠，脑细胞凋亡出现不但早于坏死，而且与坏死存在着诱导剂量相关性。
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Brain cell apoptosis after cerebral hypoxia-ischemia in neonatal rat Jiang Li, Tang Yunzhen, Huang Xiaoming, et al. Department of Pediatrics, Nanjing Railway Medical college, Nanjing 210009
【Abstract】 Objective To investigate action of apoptosis in mechanisms of neonatal hypoxia-ischemia(HIE). Methods Using HE staining, electronmicroscope, and terminal deoxynuleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) technique, we observed the histological features, time course and density of apoptotic cells and compared the ipsilateral hemisphere after permanent ischemia 1, 4, 18, 24, 40, 72h, 7 days after 3h hypoxia with that of sham-group. Results Neurons in the cortex, hippocampus, thalamus exhibited cells shrink, chromatin condensation, apoptosis bodys under microscope, as demonstrated by in situ labeling of DNA breaks. The peak for apoptosis was shown at 18h in the cortex. Conclusion In the HIE, apoptosis appears earlier than necrosis, and both of the different cell death forms may exist induced dose relativity.
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【Key words】 Cerebral anoxia Cerebral ischemia Apoptosis Rats
(Natl Med J China, 1998, 78：567-569)
传统观点认为，新生儿缺氧缺血脑病(HIE)是由于急性脑水肿、坏死所致。本研究旨在建立HIE的动物模型，观察脑损伤中脑细胞死亡的另一种形式——细胞凋亡，为探讨HIE的发病机理提供依据。
材料和方法
一、材料
模型制备：新生7天的SD大鼠72只，随机分为9组，其中2组分别为对照组和假手术组(仅游离出颈动脉，不做结扎)，其余7组按 Rice等[1]方法行左颈动脉结扎术后置于8%氧气中3小时后，分别于结扎后1、4、18、24、40和72小时及7天(对照和假手术组同于18小时)，经心脏插管，生理盐水冲洗，后灌入4 %多聚甲醛，灌毕即取左脑，外固定。
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二、方法
1.光镜检查：取丘脑中1/3平面行冠状切片，片厚5 μm，石蜡包埋，HE染色，光镜检查。
2.超微结构观察：在光镜检查的取材部位，取皮质、海马、丘脑组织，常规固定、包埋、切片、染色，透视电镜下观察、摄片。
3.原位末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)标记法(Tunel)[2]：切片做HE染色光镜观察后，邻近处的石蜡切片定为标记靶组织，并取对照组相对应组织作为阴性对照。采用德国Boenriger Mannheimgs公司试剂,具体流程：组织切片常规脱蜡后，滴加20 μg/ml蛋白酶K，双蒸水漂洗。将样片浸入TdT缓冲液(30 mmol/L Trizma基础液，pH 7.2，140 mmol/L碳酸氢钠二甲胂酸盐，1 mmol/L COCl2) 。再孵育于Tunel反应液(50 μl TdT缓冲液8.3U，TdT 1 nmol地高辛基体11-dUTP)。用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后，滴加碱性磷酸酶，再用PBS漂洗。将样片置于碱性磷酸酶显色底物(NBT/BCIP)液中避光显色，后双蒸水终止反应。核固红复染，封固，显微镜观察照相。同时做Tunel法染色对照试验， Tunel反应液中不加TdT酶。
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图1 实验组大鼠脑皮质(HIE后18小时)，可见核膜周围形成特征性环状致密染色质()，在细胞外的凋亡小体(↑) Tunel ×400 图2 对照组大鼠脑皮质，未见明显的阳性细胞 Tunel ×200 图3 实验组大鼠脑海马(HIE后24小时)，可见神经元大部分核染色阳性，核固缩 Tunel ×200
4.观察指标：用测微网计数阳性细胞数，40×目镜，6个视野，对平均1.0 mm2内凋亡细胞数，进行批间比较，Sas-6.04软件进行处理。
结 果
一、光镜下观察
缺氧缺血1小时实验侧神经细胞以轻度水肿为主。18小时皮质、海马回、丘脑组织中细胞出现凋亡典型的3种变性形态[3]：细胞皱缩；细胞核固缩，周围有空泡形成；可见核碎片，单个圆形凋亡小体。24小时后神经细胞损伤渐以核溶解、膜破裂及坏死为主。72小时脑组织中可见界限清楚的坏死灶，伴随神经细胞死亡，部分组织增生活跃。
, 百拇医药
缺氧缺血后1小时在皮质部位即出现凋亡细胞，为11.1±1.8个/mm2，4小时最明显为21.8±1.7个/mm2；凋亡的高峰时间约为18小时，凋亡细胞数为44±4个/mm2；24小时下降到38±3个/mm2，40小时下降到13.5±1.2个/mm2，7天已趋于正常，为1.5±0.8个/mm2。对照组为0.8±0.4个/mm2。两两比较：除1小时与40小时组P>0.05外，余各组之间均P<0.001。
二、电镜下观察
4～24小时组实验侧神经细胞在电镜下显现凋亡特征，以18小时为著：核膜皱缩、泡状突起，染色质致密，胞浆空泡明显，内质网肿胀。24小时后神经细胞形态渐以坏死为主。
三、原位TdT缺口末端标记
, 百拇医药
各组实验侧均可以观察到凋亡细胞——DNA片段末端标记的阳性细胞(图1～3)，1小时皮质部位阳性细胞为14.6±2.3个/mm2，4小时为34±4个/mm2，18小时阳性细胞呈深紫色，且范围广为61±6个/mm2，24小时为51±6个/mm2。对照组阳性信号不明显，为0.8±0.4个/mm2。两两比较，各组之间均P<0.01。Tunel法与HE染色在HIE大鼠脑细胞凋亡时间、流程上方向一致(图4)。
图4 两种方法在相同时间点的脑皮质凋亡细胞数比较
讨 论
过去认为脑缺血后神经细胞死亡形式是坏死。自1993年来有报道，成熟动物脑缺血后发生细胞凋亡，缺血性脑损伤脑细胞死亡存在坏死和凋亡两种形式[4，5]。本实验所用的Tunel方法较一般方法敏感，因为其检测出的凋亡细胞早于形态学凋亡改变和凋亡小体形成。
, 百拇医药
我们通过对缺氧缺血脑损伤新生大鼠模型的观察，证实了在HIE中存在凋亡现象。并发现缺氧3小时后缺血1小时即可有细胞核膜起泡、染色质凝集现象。随着缺血时间延长，凋亡细胞逐渐增多，出现细胞固缩、凋亡小体等凋亡中晚期形态特征，18小时达高峰，24小时后脑细胞形态逐以坏死为主，40～72小时坏死严重，72小时～7天坏死恢复期，凋亡表现逐渐减轻和消失。提示，在HIE脑损伤中神经细胞死亡不是简单的坏死，而存在复杂的凋亡过程；时间曲线显示出凋亡出现在缺氧缺血脑损伤的24小时内，早于脑细胞明显坏死之前。表明，在HIE时存在凋亡和坏死两种不同的细胞死亡的方式，存在着诱导剂量相关性。
参考文献
1 Hill IE, Macmanus JP, Rasquinha L, et al. DNA fragmentation indicative of apoptosis following unilateral cerebral hypoxia ischemia in the neonatal rat. Brain Res, 1995, 676：398-403.
, 百拇医药
2 Wijsman JH, Jonker RR, Keijzer R, et al. A new method to detect apoptosis in paraff insections: in situ end labeling of fragmented DNA.J Histochem Cytochem, 1993, 41：7-12.
3 Charriaut Marlangue C, Margaill L, Represa A, et al. Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab, 1996, 16：186-194.
4 MacManus JP, Hill IE, Huang ZG, et al. DNA damage consistent with apoptosis in transient focal ischemic neocortex. Neuro report, 1994, 5：493-496.
5 Sei Y, Von Lubitz KJ, Basile AS, et al. Internucleosomal DNA fragmentation in gerbil hippocampus following forebrain ischemia. Neurosci Lett, 1994, 171：179-182.
(收稿：1997-11-10 修回：1998-02-23), http://www.100md.com