星形细胞源肿瘤组织端粒酶活性研究
作者：蔡春友 只达石 于士柱 孙保存
单位：300070 天津医科大学分子生物中心(蔡春友、孙保存)；天津市脑系科中心医院(只达识)；天津市神经病学研究所病理室(于士柱)
关键词：
中华医学杂志980834 星形细胞起源的肿瘤(astrocytic tumor, AT)端粒酶表达情况及其与该类肿瘤恶性等级的关系尚不清楚。为此我们采用聚合酶链反应-酶联免疫吸附实验(PCR-ELISA)对58例不同级别的AT的端粒酶活性进行检测，旨在探讨端粒酶活性与AT恶性程度之间的关系。
一、对象与方法
1.58例AT标本按无菌方法收集，于液氮中速冻，贮存于-80℃备用。所有标本均按WHO分类标准进行组织学分类及恶性度分级。良性及亚良性组(BG)共25例，其中原浆型3例、毛细胞型1例、胖细胞型1例、纤维型20例。恶性组(MG)19例，全部为间变性AT。高恶性组(HMG)14例均为胶质母细胞瘤。另取外伤减压术中切取的正常脑组织10例作为对照。
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2.端粒酶活性检测方法：取冰冻组织制成约1×1 cm大小的切面，切取15 μm厚组织30片，收集于试管中。加入200 μl裂解液充分混匀，冰浴30分钟，以16 000 r/min离心20分钟。收集上清。取裂解上清5 μl，反应混合液25 μl，水20 μl于PCR反应管中充分混匀。于25℃30分钟孵育，经94℃灭活5分钟进入PCR循环：94℃30秒，50℃30秒，72℃90秒，30个循环，72℃延伸10分钟后终止反应。阳性对照为293细胞株裂解上清，阴性对照为经94℃10分钟灭活的组织裂解上清。取5 μlPCR产物加20 μl变性液混匀后室温放置10分钟，加225 μl杂交液混匀后取100 μl于亲和素包被的反应孔中，于37℃振荡2小时，弃去液体用洗液洗3次，加100 μl过氧化物酶标记的抗地高辛抗体于37℃反应30分钟弃去液体，以洗液洗2次，加入100 μl四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine, TMB)显色液室温20分钟，加入100 μl终止液终止反应，于20分钟内以450 nm波长比色。阳性对照吸光度值A450应大于1.5，阴性对照吸光度值A450应小于0.25，待检标本吸光度值A450减阴性对照吸光度值A450大于0.2者视为端粒酶阳性。
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3.采用X2检验和四格表确切概率法进行统计学分析。
二、结果
1.不同级别AT端粒酶活性：在58例AT中，有21例端粒酶阳性占36.2%。BG、MG、HMG组端粒酶阳性率分别为16.0%(4/25)，42.1%(8/19)，64.3%(9/14)。另外10例正常脑组织均未检出有端粒酶活性。通过对上述不同级别AT端粒酶阳性率进行统计学分析，发现BG组与MG组之间端粒酶阳性率差异有显著性意义(P<0.05)。BG组与HMG组比较比较差异更具有显著意义(P<0.01)。而MG和HMG组比较差异无显著意义(P>0.05)。
2.良性与恶性AT端粒酶活性比较：依照4级分类标准，BG组AT属良性，MG和HMG组AT组恶性范围。因此将BG组与MG和HMG组进行比较，发现良性与恶性AT之间端粒酶阳性率差异有显著性意义(P<0.01)。
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三、讨论
本组58例AT端粒酶活性情况分析发现，端粒酶阳性率随肿瘤恶性等级升高而相应增加。提示端粒酶活性是AT的恶性特征之一，可作为AT良恶性评价的重要参考指标。尽管本组58例不同级别AT端粒酶活性有与其恶性进展呈一致性的趋势。但HMG组端粒酶阳性率也只有64.3%。而良性AT组中也有少部分表达了低水平的端粒酶活性。本组间变性星形细胞瘤的端粒酶阳性率为42.1%，高于国外报道的结果，而高恶性组与国外报道一致[1]。但从AT的恶性进展过程来看，本组结果与该类肿瘤恶性进展过程更为一致。有人认为[1]，端粒酶阳性的间变性星形细胞瘤更易转变成胶质母细胞瘤。在本组58例AT中也有一部分恶性及高恶性肿瘤未能检出端粒酶活性。其原因可能是：第一，肿瘤细胞群具有异质性，所取标本未包括肿瘤组织中端粒酶阳性部分；第二，肿瘤发生于特殊部位，使其在很小时已对机体构成危害，尚未发现到端粒酶活化阶段；[2]第三，某些抑癌基因异常诱发的肿瘤极易发生恶性化，尚未发展到端粒酶活化阶段，这类肿瘤仅需少量突变事件既可成为恶性肿瘤[2]；第四，可能存在端粒酶以外的端粒长度维持机制[3]。
, 百拇医药
参考文献
1 Langtord L A, Piatyszek M A, Xu R, et al. Telomerase activity in human brain tumors. Lancet, 1995,346：1267-1268.
2 Morin G B. Telomere integrity and cancer. J. Natl Cancer Res, 1996,88：1095-1096.
3 Strablc, Blackburn E M. Effects of reverse transcriptase inhibitors on telomere length and telomerase activity in two immortalized human cell lines. Mol Cell Biol, 1996,16：53-65.
(收稿：1998-01-19 修回：1998-05-27), 百拇医药
单位：300070 天津医科大学分子生物中心(蔡春友、孙保存)；天津市脑系科中心医院(只达识)；天津市神经病学研究所病理室(于士柱)
关键词：
中华医学杂志980834 星形细胞起源的肿瘤(astrocytic tumor, AT)端粒酶表达情况及其与该类肿瘤恶性等级的关系尚不清楚。为此我们采用聚合酶链反应-酶联免疫吸附实验(PCR-ELISA)对58例不同级别的AT的端粒酶活性进行检测，旨在探讨端粒酶活性与AT恶性程度之间的关系。
一、对象与方法
1.58例AT标本按无菌方法收集，于液氮中速冻，贮存于-80℃备用。所有标本均按WHO分类标准进行组织学分类及恶性度分级。良性及亚良性组(BG)共25例，其中原浆型3例、毛细胞型1例、胖细胞型1例、纤维型20例。恶性组(MG)19例，全部为间变性AT。高恶性组(HMG)14例均为胶质母细胞瘤。另取外伤减压术中切取的正常脑组织10例作为对照。
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2.端粒酶活性检测方法：取冰冻组织制成约1×1 cm大小的切面，切取15 μm厚组织30片，收集于试管中。加入200 μl裂解液充分混匀，冰浴30分钟，以16 000 r/min离心20分钟。收集上清。取裂解上清5 μl，反应混合液25 μl，水20 μl于PCR反应管中充分混匀。于25℃30分钟孵育，经94℃灭活5分钟进入PCR循环：94℃30秒，50℃30秒，72℃90秒，30个循环，72℃延伸10分钟后终止反应。阳性对照为293细胞株裂解上清，阴性对照为经94℃10分钟灭活的组织裂解上清。取5 μlPCR产物加20 μl变性液混匀后室温放置10分钟，加225 μl杂交液混匀后取100 μl于亲和素包被的反应孔中，于37℃振荡2小时，弃去液体用洗液洗3次，加100 μl过氧化物酶标记的抗地高辛抗体于37℃反应30分钟弃去液体，以洗液洗2次，加入100 μl四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine, TMB)显色液室温20分钟，加入100 μl终止液终止反应，于20分钟内以450 nm波长比色。阳性对照吸光度值A450应大于1.5，阴性对照吸光度值A450应小于0.25，待检标本吸光度值A450减阴性对照吸光度值A450大于0.2者视为端粒酶阳性。
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3.采用X2检验和四格表确切概率法进行统计学分析。
二、结果
1.不同级别AT端粒酶活性：在58例AT中，有21例端粒酶阳性占36.2%。BG、MG、HMG组端粒酶阳性率分别为16.0%(4/25)，42.1%(8/19)，64.3%(9/14)。另外10例正常脑组织均未检出有端粒酶活性。通过对上述不同级别AT端粒酶阳性率进行统计学分析，发现BG组与MG组之间端粒酶阳性率差异有显著性意义(P<0.05)。BG组与HMG组比较比较差异更具有显著意义(P<0.01)。而MG和HMG组比较差异无显著意义(P>0.05)。
2.良性与恶性AT端粒酶活性比较：依照4级分类标准，BG组AT属良性，MG和HMG组AT组恶性范围。因此将BG组与MG和HMG组进行比较，发现良性与恶性AT之间端粒酶阳性率差异有显著性意义(P<0.01)。
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三、讨论
本组58例AT端粒酶活性情况分析发现，端粒酶阳性率随肿瘤恶性等级升高而相应增加。提示端粒酶活性是AT的恶性特征之一，可作为AT良恶性评价的重要参考指标。尽管本组58例不同级别AT端粒酶活性有与其恶性进展呈一致性的趋势。但HMG组端粒酶阳性率也只有64.3%。而良性AT组中也有少部分表达了低水平的端粒酶活性。本组间变性星形细胞瘤的端粒酶阳性率为42.1%，高于国外报道的结果，而高恶性组与国外报道一致[1]。但从AT的恶性进展过程来看，本组结果与该类肿瘤恶性进展过程更为一致。有人认为[1]，端粒酶阳性的间变性星形细胞瘤更易转变成胶质母细胞瘤。在本组58例AT中也有一部分恶性及高恶性肿瘤未能检出端粒酶活性。其原因可能是：第一，肿瘤细胞群具有异质性，所取标本未包括肿瘤组织中端粒酶阳性部分；第二，肿瘤发生于特殊部位，使其在很小时已对机体构成危害，尚未发现到端粒酶活化阶段；[2]第三，某些抑癌基因异常诱发的肿瘤极易发生恶性化，尚未发展到端粒酶活化阶段，这类肿瘤仅需少量突变事件既可成为恶性肿瘤[2]；第四，可能存在端粒酶以外的端粒长度维持机制[3]。
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参考文献
1 Langtord L A, Piatyszek M A, Xu R, et al. Telomerase activity in human brain tumors. Lancet, 1995,346：1267-1268.
2 Morin G B. Telomere integrity and cancer. J. Natl Cancer Res, 1996,88：1095-1096.
3 Strablc, Blackburn E M. Effects of reverse transcriptase inhibitors on telomere length and telomerase activity in two immortalized human cell lines. Mol Cell Biol, 1996,16：53-65.
(收稿：1998-01-19 修回：1998-05-27), 百拇医药