细胞因子联合激活骨髓杀伤活性的研究
作者：熊梅 常瑛 刘锦丽
单位：100050 北京友谊医院
关键词：
中华医学杂志980822 为了寻找高效能细胞因子激活的骨髓(ABM)，我们采用CD3单克隆抗体、干扰素-α(IFN-α)联合白细胞介素2(IL-2)激活骨髓，比较不同诱导方式产生的ABM在体外的抗肿瘤活性以及造血重建能力。
一、材料与方法
1.材料：细胞培养箱(美国Heraeus公司产品)，Σ 960酶标仪(英国Neterech Inc公司产品)，96孔细胞培养板(美国Corning公司产品)，RPMI 1640、IMDM(英国GIBCO公司产品)、人重组IL-2(北京中化技术研究所馈赠)，CD3单克隆抗体(军事医学科学院提供)，IFN-α(上海罗氏制药有限公司产品)，异丙醇(南开宇达精细化工研究所提供)。
, 百拇医药
2.骨髓细胞来源：我院胸科手术截取非血液病患者的正常肋骨，共34例。
3.肿瘤细胞株：HL-60细胞由北京医科大学人民医院血液病研究所提供，为早幼粒细胞白血病细胞株，自然杀伤细胞(NK)抵抗型。
4.方法：(1) 骨髓单个核细胞(BMMNC)的分离：挤压肋骨经RPMI 1640稀释，用淋巴细胞分离液(1 800 r/min)分离出BMMNC，记数后备用。(2) 分组：将BMMNC按(0.5～1.0)×106/ml分置于IMDM培养体系中，共设6组，对照组(不含细胞因子)；ABM1(含IL-2、1 000 U/ml)；ABM2(含IL-2、500 U/ml和CD3单克隆抗体40 ng)；ABM3(IL-2、500 U/ml和CD3单克隆抗体40 ng，2天后再次加入CD3单克隆抗体20 ng)；ABM4(IL-2、500 U/ml，2天后加入IFN-α、1 000 U/ml)；ABM5(IL-2、500 U/ml和CD3单克隆抗体40 ng，2天后加入CD3单克隆抗体20 ng及IFN-α、1 000 U/ml)。上述各组均在CO2培养箱内培养3天后收获细胞。(3) ABM杀伤活性的检测：MTT法[1，2]，单一波长490 nm。按下面公式计算ABM的抗肿瘤活性公式：[1-(ODE+T-ODE)/ODT]100%
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ODE+T=效应细胞孔吸光度A值+靶细胞孔吸光度A值
ODE=相应浓度效应细胞孔A值；ODT=相应浓度靶细胞孔A值。(4) 粒细胞巨噬细胞集落生成(CFU-GM)培养[3]：分别进行CFU-GM培养。
5.统计学方法：采用方差分析，应用SAS软件。
二、结果
1.ABM体外抗肿瘤活性：ABM1与ABM2抗肿瘤活性差异无显著意义(P>0.05)；ABM3、ABM4及ABM5抗肿瘤活性明显提高(P<0.05)；其中ABM4活性最高。同时在获得较高的抗肿瘤活性的同时，IL-2的用量可明显减少。
2.不同细胞因子诱导的ABM对CFU-GM的影响：新鲜肋骨骨髓CFU-GM为184±16，对照组体外培养3天CFU-GM为137±15；ABM1 CFU-GM为140±60；ABM2 CFU-GM为132±59；ABM3 CFU-GM为132±57；ABM4 CFU-GM为139±40；ABM5 CFU-GM为134.5±38.7。可以看出，体外培养3天的骨髓与新鲜骨髓CFU-GM差异有显著意义(P<0.05)，而在体系中加入上述细胞因子并不影响各自CFU-GM的形成。
, 百拇医药
三、讨论
1.“激活骨髓”(ABM)[4，5]的提出使清除血液系统恶性肿瘤微小残留病变成为可能。我们应用CD3单克隆抗体、INF-α分别与IL-2联合激活骨髓，在体外产生不同的抗肿瘤活性，认为骨髓细胞确实具有潜在抗肿瘤能力。在IL-2激活骨髓的基础上，联合应用CD3单克隆抗体、IFN-α能显著增强其抗肿瘤活性。在培养体系中加入CD3单克隆抗体1～2天制备的细胞为CD3-AK(非活性状态CD3 AK细胞)，如在体系中持续存在CD3单克隆抗体，则制备出CD3+AK(活性状态CD3 AK细胞)，尽管这两类细胞来自同一前体细胞，但所发挥的抗肿瘤效应明显不同[6]，后者除有直接杀伤效应外，还能分泌多种细胞因子，实验中同时应用CD3单克隆抗体和IFN-α并不能增强抗肿瘤活性，说明提高ABM抗肿瘤活性不是简单细胞因子种类和剂量的叠加，而是通过一个关系复杂的细胞因子网络(cytokine network)产生作用。它们除了具有单独的生物学活 性外，彼此之间还在诱生、受体调节及生物学效应上发挥着相互作用。
, 百拇医药
2.不同的细胞因子、CD3单克隆抗体联合诱导骨髓获得抗肿瘤活性的同时，CFU-GM不受影响，这就为ABM广泛的应用于骨髓移植提供了可能。
参考文献
1 郑永唐，贲昆龙.测定细胞存活和增殖的MTT方法的建立.免疫学杂志，1992，8：266-269.
2 朱慧芬，张悦，王晓林，等.MTT比色法检测IL-2和杀伤细胞活性的研究.免疫学杂志，1994，10：48-50.
3 王椿，王辩明，李崇鱼，等.重组人造血生长因子对正常造血细胞体外生长的影响.中华血液学杂志，1992，13：81-83.
4 Uckun FM, Kersey JH, Vaclera DA, et al. Autologous bone marrow transplan-tation in high-risk remission T-lineage acute lymphoblastic leukemia using immuntoxins plus 4-Hydroperoxycyclophosphamide for marrow purging. Blood, 1990, 76：1723-1733.
, 百拇医药
5 Agah R, Malloy B, Kerner M, et al. Generation and characterization of IL-2 activated bone marrow cells as a potent graft vs. leukemia effector in transplantation. J Immunol, 1989, 143：3093-3099.
6 Yeon-Sook Y, Myrthel E, Hargrove M, et al. In vivo antitumer activity of anti-CD3-induced activated killer cells. Cancer Res, 1989, 49：4770-4774.
(收稿：1997-12-29 修回：1998-04-28), 百拇医药
单位：100050 北京友谊医院
关键词：
中华医学杂志980822 为了寻找高效能细胞因子激活的骨髓(ABM)，我们采用CD3单克隆抗体、干扰素-α(IFN-α)联合白细胞介素2(IL-2)激活骨髓，比较不同诱导方式产生的ABM在体外的抗肿瘤活性以及造血重建能力。
一、材料与方法
1.材料：细胞培养箱(美国Heraeus公司产品)，Σ 960酶标仪(英国Neterech Inc公司产品)，96孔细胞培养板(美国Corning公司产品)，RPMI 1640、IMDM(英国GIBCO公司产品)、人重组IL-2(北京中化技术研究所馈赠)，CD3单克隆抗体(军事医学科学院提供)，IFN-α(上海罗氏制药有限公司产品)，异丙醇(南开宇达精细化工研究所提供)。
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2.骨髓细胞来源：我院胸科手术截取非血液病患者的正常肋骨，共34例。
3.肿瘤细胞株：HL-60细胞由北京医科大学人民医院血液病研究所提供，为早幼粒细胞白血病细胞株，自然杀伤细胞(NK)抵抗型。
4.方法：(1) 骨髓单个核细胞(BMMNC)的分离：挤压肋骨经RPMI 1640稀释，用淋巴细胞分离液(1 800 r/min)分离出BMMNC，记数后备用。(2) 分组：将BMMNC按(0.5～1.0)×106/ml分置于IMDM培养体系中，共设6组，对照组(不含细胞因子)；ABM1(含IL-2、1 000 U/ml)；ABM2(含IL-2、500 U/ml和CD3单克隆抗体40 ng)；ABM3(IL-2、500 U/ml和CD3单克隆抗体40 ng，2天后再次加入CD3单克隆抗体20 ng)；ABM4(IL-2、500 U/ml，2天后加入IFN-α、1 000 U/ml)；ABM5(IL-2、500 U/ml和CD3单克隆抗体40 ng，2天后加入CD3单克隆抗体20 ng及IFN-α、1 000 U/ml)。上述各组均在CO2培养箱内培养3天后收获细胞。(3) ABM杀伤活性的检测：MTT法[1，2]，单一波长490 nm。按下面公式计算ABM的抗肿瘤活性公式：[1-(ODE+T-ODE)/ODT]100%
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ODE+T=效应细胞孔吸光度A值+靶细胞孔吸光度A值
ODE=相应浓度效应细胞孔A值；ODT=相应浓度靶细胞孔A值。(4) 粒细胞巨噬细胞集落生成(CFU-GM)培养[3]：分别进行CFU-GM培养。
5.统计学方法：采用方差分析，应用SAS软件。
二、结果
1.ABM体外抗肿瘤活性：ABM1与ABM2抗肿瘤活性差异无显著意义(P>0.05)；ABM3、ABM4及ABM5抗肿瘤活性明显提高(P<0.05)；其中ABM4活性最高。同时在获得较高的抗肿瘤活性的同时，IL-2的用量可明显减少。
2.不同细胞因子诱导的ABM对CFU-GM的影响：新鲜肋骨骨髓CFU-GM为184±16，对照组体外培养3天CFU-GM为137±15；ABM1 CFU-GM为140±60；ABM2 CFU-GM为132±59；ABM3 CFU-GM为132±57；ABM4 CFU-GM为139±40；ABM5 CFU-GM为134.5±38.7。可以看出，体外培养3天的骨髓与新鲜骨髓CFU-GM差异有显著意义(P<0.05)，而在体系中加入上述细胞因子并不影响各自CFU-GM的形成。
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三、讨论
1.“激活骨髓”(ABM)[4，5]的提出使清除血液系统恶性肿瘤微小残留病变成为可能。我们应用CD3单克隆抗体、INF-α分别与IL-2联合激活骨髓，在体外产生不同的抗肿瘤活性，认为骨髓细胞确实具有潜在抗肿瘤能力。在IL-2激活骨髓的基础上，联合应用CD3单克隆抗体、IFN-α能显著增强其抗肿瘤活性。在培养体系中加入CD3单克隆抗体1～2天制备的细胞为CD3-AK(非活性状态CD3 AK细胞)，如在体系中持续存在CD3单克隆抗体，则制备出CD3+AK(活性状态CD3 AK细胞)，尽管这两类细胞来自同一前体细胞，但所发挥的抗肿瘤效应明显不同[6]，后者除有直接杀伤效应外，还能分泌多种细胞因子，实验中同时应用CD3单克隆抗体和IFN-α并不能增强抗肿瘤活性，说明提高ABM抗肿瘤活性不是简单细胞因子种类和剂量的叠加，而是通过一个关系复杂的细胞因子网络(cytokine network)产生作用。它们除了具有单独的生物学活 性外，彼此之间还在诱生、受体调节及生物学效应上发挥着相互作用。
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2.不同的细胞因子、CD3单克隆抗体联合诱导骨髓获得抗肿瘤活性的同时，CFU-GM不受影响，这就为ABM广泛的应用于骨髓移植提供了可能。
参考文献
1 郑永唐，贲昆龙.测定细胞存活和增殖的MTT方法的建立.免疫学杂志，1992，8：266-269.
2 朱慧芬，张悦，王晓林，等.MTT比色法检测IL-2和杀伤细胞活性的研究.免疫学杂志，1994，10：48-50.
3 王椿，王辩明，李崇鱼，等.重组人造血生长因子对正常造血细胞体外生长的影响.中华血液学杂志，1992，13：81-83.
4 Uckun FM, Kersey JH, Vaclera DA, et al. Autologous bone marrow transplan-tation in high-risk remission T-lineage acute lymphoblastic leukemia using immuntoxins plus 4-Hydroperoxycyclophosphamide for marrow purging. Blood, 1990, 76：1723-1733.
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5 Agah R, Malloy B, Kerner M, et al. Generation and characterization of IL-2 activated bone marrow cells as a potent graft vs. leukemia effector in transplantation. J Immunol, 1989, 143：3093-3099.
6 Yeon-Sook Y, Myrthel E, Hargrove M, et al. In vivo antitumer activity of anti-CD3-induced activated killer cells. Cancer Res, 1989, 49：4770-4774.
(收稿：1997-12-29 修回：1998-04-28), 百拇医药