丹参单体IH764-3抗肝纤维化作用的实验研究
作者：陈岳祥 李石 范列英 孔宪涛 杨纯正 于宝玲
单位：200003 上海，第二军医大学长征医院消化科(陈岳祥、李石)，实验科(范列英、孔宪涛)；中国医学科学院血液病研究所(杨纯正、于宝玲)
关键词：
中华医学杂志980830 本实验在大鼠四氯化碳(CCl4)肝纤维化模型上,观察丹参有效单体IH764-3的抗肝纤维化作用,并以体外培养的大鼠肝贮脂细胞为靶细胞,研究IH764-3对其增殖和胶原合成的影响，旨在为临床防治肝纤维化提供依据。
一、材料和方法
1.主要试剂：IH764-3由中国医学科学院血液病研究所提供；CCl4为宜兴市第二化工厂产品；Mops、异硫氰酸胍为Waston公司产品；地高辛标记及检测试剂盒为德国Boehringer-Mannheim公司产品；Ⅱ型胶原酶、Pronase E、Stractan为美国Sigma公司产品；前胶原α2(Ⅰ)、α2(Ⅲ) cDNA由美国Prockop博士惠赠；3 H-胸腺嘧啶(3H-TdR )、3H-脯氨酸(3H-Pro)分别购自上海和北京原子能研究所。
, http://www.100md.com
2.IH764-3对大鼠肝纤维化的影响
取雌性SD大鼠(由本校实验动物中心提供)，随机分为3组：正常组(14只)、CCl4组(22只)、IH764-3组(16只)。采用CCl4制备肝纤维化模型[1]。IH764-3组在造模开始即每日给予IH764-3 40mg/kg体重皮下注射,CCl4组给予等量生理盐水,正常组不给处理。各组于造模6周后取5只大鼠断头处死,其余动物于造模12周后处死,取血分离血清,测定肝功能、透明质酸(HA)和层粘连素(LN);取肝右叶测定羟脯氨酸、Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA,取肝左叶作病理检查。
3.IH764-3对大鼠肝贮脂细胞增殖及胶原合成的影响
取雄性SD大鼠(400～450 g)，按文献[2]分离、培养大鼠贮脂细胞。将培养2周的细胞以1×105/ml接种于96孔培养板,培养24小时,分成2组。第1组加IH764-3，使终浓度分别为5、20、80、320、1 280 μmol/L,24小时后加3 H-TdR或3H-Pro,继续培养24小时。第2组分别在培养结束前48、24、4h加IH764-3(终浓度为320 μmol/L)，24小时加3 H-TdR或3 H-Pro。对照组加不含药物的培养基。培养结束后用多头细胞收集器收集细胞,自动液闪计数仪(法国Beckman公司)计数。
, 百拇医药
表1 实验结束时各组大鼠肝功能变化(
±s) 组别
鼠数
ALT(U/L)
白蛋白(g/L)
总胆红素(μmol/L)
正常组
8
134± 86
28.9±1.2
7.7±2.0
CCl4组
, http://www.100md.com
12
601±197**
21.1±3.0**
14.8±3.8*
IH764-3组
7
440± 78△
23.6±1.6△
11.4±3.7△
与正常组比较* P<0.05，**P<0.01，与CCl4组比较△ P<0.05
, 百拇医药
表2 实验结束时各组大鼠血清透明质酸、层粘连素的变化(
±s) 组别
鼠数
透明质酸
(μg/L)
层粘连素
(μg/L)
正常组
8
24±9
26±20
CCl4组
, 百拇医药
11
90±31**
148±82**
IH764-3组
9
39±37△△
61±48△
与正常组比较**P<0.01，与CCl4组比较△ P<0.05，△△P<0.01
表3 IH764-3对贮脂细胞3H-TdR和3H-Pro掺入的影响(
±s) IH764-3浓度
, 百拇医药
(μmol/L)
3H-TdR掺入
3H-Pro掺入
cpm
抑制率(%)
cpm
抑制率(%)
0
1996±19
10474±1399
5
1834±165
, 百拇医药
8.1
9709±2318
7.3
20
1634±154
18.1*
7845±793
25.1
80
1515±110
24.1**
6075±807
, 百拇医药
42.0**
320
930±52
53.4**
3991±1701
61.9**
1280
316±63
84.2**
3205±115
69.4**
, 百拇医药
与对照组比较* P<0.05，** P<0.01
表4 IH764-3作用时间对贮脂细胞3H-TdR和3H-Pro掺入的影响△ (
±s) 作用时间
(h)
3H-TdR掺入
3H-Pro掺入
s-1
抑制率(%)
s-1
, 百拇医药
抑制率(%)
0
1996±19
10 474±1399
4
1535±298
23.1
9 322±1694
11.0
24
1000±146
49.9**
, 百拇医药
6 148±2342
41.3*
48
712±202
64.3**
4 420±1587**
57.8
与对照组比较* P<0.05，** P<0.01，△ IH764-3浓度为320 μmol/L
二、结果
1.IH764-3对肝功能的影响(表1)
, 百拇医药
2.IH764-3对血清HA和LN的影响(表2)
3.IH764-3对肝羟脯氨酸的影响：于造模6周、12周后,CCl4组肝羟脯氨酸分别为457±134和1340±389 μg/g湿重组织，较正常组显著升高；IH764-3组分别为265±91和667±228 μg/g湿重组织，后者较CCl4组降低50.2%(P<0.01)。
4.IH764-3对肝Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的影响：Northern杂交显示,CCl4组大鼠12周肝Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA分别较正常组增加5.6、4.4倍；IH764-3组分别增加4.2、2.8倍，其增加程度较CCl4组轻。
5.肝脏病理改变：注射CCl4 12周,CCl4组83.3%(10/12)肝表面布满细小结节,镜下见典型假小叶,纤维间隔宽；IH764-3组肝病变程度较轻,仅22.2%(2/9)肝表面不光滑,有细小结节,镜下见纤维组织增生,但多数呈不完全分隔,且纤维间隔细窄。用图象分析仪扫描VG染色切片并计算胶原纤维分布面积百分比,结果IH764-3组的胶原纤维分布面积百分比小于CCl4组[造模12周时：(9.9±2.6)%对(29.2±8.2)%，P<0.01]，与镜下所见结果一致。
, 百拇医药
6.IH764-3对体外培养的肝贮脂细胞增殖及胶原合成的影响：IH764-3对贮脂细胞的3H-TdR和3H-Pro掺入均有显著抑制作用,并随浓度增加或时间延长而增强(表3、4)，表明其对贮脂细胞增殖和胶原合成有显著抑制效应,并呈时间、剂量依赖性关系。
三、讨论
肝纤维化的治疗目前临床上仍缺少理想方法。本实验发现丹参单体IH764-3可显著减轻大鼠CCl4肝纤维化程度，能明显降低肝羟脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA含量，降低血清HA、LN水平，改善肝功能，组织学检查也显示其具有抗肝纤维化作用。
本实验亦观察到IH764-3对大鼠贮脂细胞的增殖及胶原合成有时间、剂量依赖的抑制效应。由于贮脂细胞是肝损伤时细胞外基质的主要产生细胞,因此,这可能是它体内抗肝纤维化作用的主要途径。胶原生物合成中,脯氨酰-4-羟化酶为胶原分子三螺旋状结构形成和稳定所必需,抑制该酶活性能减少胶原合成。体外研究发现,IH764-3可有效抑制脯氨酰的酶促羟化反应[3]，这可能是其抗肝纤维化作用的又一机制。近年研究表明，脂质过氧化在肝纤维化发生过程中起重要作用,超氧阴离子、乙醛、丙二醛等均可刺激成纤维细胞或贮脂细胞胶原mRNA的表达和胶原的产生。我们发现IH764-3可显著降低肝丙二醛含量,提示它可通过抑制脂质过氧化对肝纤维化起保护作用。
参考文献
1 陈岳祥，黄裕新，王庆莉，等.抗TNFα单抗对实验性大鼠肝纤维化的影响.中华消化杂志，1997，17：358-359.
2 陈岳祥，李石，范列英，等.牛磺酸抑制大鼠贮脂细胞增殖及前胶原基因表达.中华肝脏病学杂志，1997，5：150-152.
3 杨纯正，刘瑞林，刘健，等.IH764-3对胶原生物合成中脯氨酰羟化的作用.中国医学科学院学报，1993，15：364-368.
(收稿：1997-11-24 修回：1998-04-28), http://www.100md.com
单位：200003 上海，第二军医大学长征医院消化科(陈岳祥、李石)，实验科(范列英、孔宪涛)；中国医学科学院血液病研究所(杨纯正、于宝玲)
关键词：
中华医学杂志980830 本实验在大鼠四氯化碳(CCl4)肝纤维化模型上,观察丹参有效单体IH764-3的抗肝纤维化作用,并以体外培养的大鼠肝贮脂细胞为靶细胞,研究IH764-3对其增殖和胶原合成的影响，旨在为临床防治肝纤维化提供依据。
一、材料和方法
1.主要试剂：IH764-3由中国医学科学院血液病研究所提供；CCl4为宜兴市第二化工厂产品；Mops、异硫氰酸胍为Waston公司产品；地高辛标记及检测试剂盒为德国Boehringer-Mannheim公司产品；Ⅱ型胶原酶、Pronase E、Stractan为美国Sigma公司产品；前胶原α2(Ⅰ)、α2(Ⅲ) cDNA由美国Prockop博士惠赠；3 H-胸腺嘧啶(3H-TdR )、3H-脯氨酸(3H-Pro)分别购自上海和北京原子能研究所。
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2.IH764-3对大鼠肝纤维化的影响
取雌性SD大鼠(由本校实验动物中心提供)，随机分为3组：正常组(14只)、CCl4组(22只)、IH764-3组(16只)。采用CCl4制备肝纤维化模型[1]。IH764-3组在造模开始即每日给予IH764-3 40mg/kg体重皮下注射,CCl4组给予等量生理盐水,正常组不给处理。各组于造模6周后取5只大鼠断头处死,其余动物于造模12周后处死,取血分离血清,测定肝功能、透明质酸(HA)和层粘连素(LN);取肝右叶测定羟脯氨酸、Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA,取肝左叶作病理检查。
3.IH764-3对大鼠肝贮脂细胞增殖及胶原合成的影响
取雄性SD大鼠(400～450 g)，按文献[2]分离、培养大鼠贮脂细胞。将培养2周的细胞以1×105/ml接种于96孔培养板,培养24小时,分成2组。第1组加IH764-3，使终浓度分别为5、20、80、320、1 280 μmol/L,24小时后加3 H-TdR或3H-Pro,继续培养24小时。第2组分别在培养结束前48、24、4h加IH764-3(终浓度为320 μmol/L)，24小时加3 H-TdR或3 H-Pro。对照组加不含药物的培养基。培养结束后用多头细胞收集器收集细胞,自动液闪计数仪(法国Beckman公司)计数。
, 百拇医药
表1 实验结束时各组大鼠肝功能变化(
±s) 组别鼠数
ALT(U/L)
白蛋白(g/L)
总胆红素(μmol/L)
正常组
8
134± 86
28.9±1.2
7.7±2.0
CCl4组
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12
601±197**
21.1±3.0**
14.8±3.8*
IH764-3组
7
440± 78△
23.6±1.6△
11.4±3.7△
与正常组比较* P<0.05，**P<0.01，与CCl4组比较△ P<0.05
, 百拇医药
表2 实验结束时各组大鼠血清透明质酸、层粘连素的变化(
±s) 组别鼠数
透明质酸
(μg/L)
层粘连素
(μg/L)
正常组
8
24±9
26±20
CCl4组
, 百拇医药
11
90±31**
148±82**
IH764-3组
9
39±37△△
61±48△
与正常组比较**P<0.01，与CCl4组比较△ P<0.05，△△P<0.01
表3 IH764-3对贮脂细胞3H-TdR和3H-Pro掺入的影响(
±s) IH764-3浓度, 百拇医药
(μmol/L)
3H-TdR掺入
3H-Pro掺入
cpm
抑制率(%)
cpm
抑制率(%)
0
1996±19
10474±1399
5
1834±165
, 百拇医药
8.1
9709±2318
7.3
20
1634±154
18.1*
7845±793
25.1
80
1515±110
24.1**
6075±807
, 百拇医药
42.0**
320
930±52
53.4**
3991±1701
61.9**
1280
316±63
84.2**
3205±115
69.4**
, 百拇医药
与对照组比较* P<0.05，** P<0.01
表4 IH764-3作用时间对贮脂细胞3H-TdR和3H-Pro掺入的影响△ (
±s) 作用时间(h)
3H-TdR掺入
3H-Pro掺入
s-1
抑制率(%)
s-1
, 百拇医药
抑制率(%)
0
1996±19
10 474±1399
4
1535±298
23.1
9 322±1694
11.0
24
1000±146
49.9**
, 百拇医药
6 148±2342
41.3*
48
712±202
64.3**
4 420±1587**
57.8
与对照组比较* P<0.05，** P<0.01，△ IH764-3浓度为320 μmol/L
二、结果
1.IH764-3对肝功能的影响(表1)
, 百拇医药
2.IH764-3对血清HA和LN的影响(表2)
3.IH764-3对肝羟脯氨酸的影响：于造模6周、12周后,CCl4组肝羟脯氨酸分别为457±134和1340±389 μg/g湿重组织，较正常组显著升高；IH764-3组分别为265±91和667±228 μg/g湿重组织，后者较CCl4组降低50.2%(P<0.01)。
4.IH764-3对肝Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的影响：Northern杂交显示,CCl4组大鼠12周肝Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA分别较正常组增加5.6、4.4倍；IH764-3组分别增加4.2、2.8倍，其增加程度较CCl4组轻。
5.肝脏病理改变：注射CCl4 12周,CCl4组83.3%(10/12)肝表面布满细小结节,镜下见典型假小叶,纤维间隔宽；IH764-3组肝病变程度较轻,仅22.2%(2/9)肝表面不光滑,有细小结节,镜下见纤维组织增生,但多数呈不完全分隔,且纤维间隔细窄。用图象分析仪扫描VG染色切片并计算胶原纤维分布面积百分比,结果IH764-3组的胶原纤维分布面积百分比小于CCl4组[造模12周时：(9.9±2.6)%对(29.2±8.2)%，P<0.01]，与镜下所见结果一致。
, 百拇医药
6.IH764-3对体外培养的肝贮脂细胞增殖及胶原合成的影响：IH764-3对贮脂细胞的3H-TdR和3H-Pro掺入均有显著抑制作用,并随浓度增加或时间延长而增强(表3、4)，表明其对贮脂细胞增殖和胶原合成有显著抑制效应,并呈时间、剂量依赖性关系。
三、讨论
肝纤维化的治疗目前临床上仍缺少理想方法。本实验发现丹参单体IH764-3可显著减轻大鼠CCl4肝纤维化程度，能明显降低肝羟脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA含量，降低血清HA、LN水平，改善肝功能，组织学检查也显示其具有抗肝纤维化作用。
本实验亦观察到IH764-3对大鼠贮脂细胞的增殖及胶原合成有时间、剂量依赖的抑制效应。由于贮脂细胞是肝损伤时细胞外基质的主要产生细胞,因此,这可能是它体内抗肝纤维化作用的主要途径。胶原生物合成中,脯氨酰-4-羟化酶为胶原分子三螺旋状结构形成和稳定所必需,抑制该酶活性能减少胶原合成。体外研究发现,IH764-3可有效抑制脯氨酰的酶促羟化反应[3]，这可能是其抗肝纤维化作用的又一机制。近年研究表明，脂质过氧化在肝纤维化发生过程中起重要作用,超氧阴离子、乙醛、丙二醛等均可刺激成纤维细胞或贮脂细胞胶原mRNA的表达和胶原的产生。我们发现IH764-3可显著降低肝丙二醛含量,提示它可通过抑制脂质过氧化对肝纤维化起保护作用。
参考文献
1 陈岳祥，黄裕新，王庆莉，等.抗TNFα单抗对实验性大鼠肝纤维化的影响.中华消化杂志，1997，17：358-359.
2 陈岳祥，李石，范列英，等.牛磺酸抑制大鼠贮脂细胞增殖及前胶原基因表达.中华肝脏病学杂志，1997，5：150-152.
3 杨纯正，刘瑞林，刘健，等.IH764-3对胶原生物合成中脯氨酰羟化的作用.中国医学科学院学报，1993，15：364-368.
(收稿：1997-11-24 修回：1998-04-28), http://www.100md.com