PCR法检测胃癌组织中幽门螺杆菌
作者：李若平1 张振科2 姚希贤2 任锡玲21 李兰更2
单位：1解放军271医院消化科 天津市 300191；2河北医科大学第二医院消化科 石家庄市 050000
关键词：胃肿瘤/微生物学；螺杆菌，幽门；腺癌/微生物学；聚合酶链反应
华人消化杂志980839Subject headings stomach neoplasms/microbiology; Helicobacter pylori; adenocarcinoma/microbiology; polymerase chain reaction
中国图书资料分类号 R 735.2
, 百拇医药 1 对象和方法
1.1 对象 本研究选用河北医科大学第二医院1995年度经外科手术病理证实为胃癌的10例患者，年龄47岁～56岁，男7例，女3例，其中贲门胃底癌1例、胃窦癌6例、胃体小弯侧癌3例，病理均为腺癌. 对此10例切除具有癌灶标本用石蜡包埋备用.
1.2 方法 组织切片：取备用之胃癌石蜡包埋组织块用切片机切成厚度为10 μm薄片，每例均切2片，用无菌小镊夹入盛有0.5 ml二甲苯溶液的无菌Eppendorf管内，每次操作完后对刀片、小镊子用二甲苯认真擦洗，以防止交叉污染. 脱蜡：用微量离心机(12000 r/ min)离心5min沉淀组织和残存的石蜡，小心吸去壁上残存的二甲苯，再重复上述操作一次，加入0.5 ml无水乙醇翻转混匀，再用微量离心机离心5min，小心吸去乙醇，然后再次加入0.5 ml无水乙醇并翻转混匀离心5min，尽可能除去壁上残存的乙醇，真空干燥2 h，使乙醇完全挥发，干燥时用封口膜封住Eppendorf管，并在其上打几个小孔，防止污染. 模板(Template)提取：向上述干燥后的Eppendorf管内加入100 μl裂解液混匀，然后加入4 μl蛋白酶K，50℃水浴1 h，取出后置于沸水浴5min，最后离心(15000 r/ min)5min，取10 μl备用. PCR扩增：采用上海复华实业股份有限公司生物技术中心生产的Hp基因检测试剂盒，该试剂盒选择互补于Hp种尿素酶A基因片段为特异引物，引物1：5＇-GCCAATGGTAAATTAGTT-3＇，引物2：5＇-CTCCTTAATTGTTTTTAC-3＇，按顺序在500 μl的无菌Eppendorf管内加入18 μl反应液，2 μl稀释后的FD DNA polymerase, 10μl模板DNA提取液并做阳性对照(阴性对照加10 μl无菌双蒸水)，摇匀后加20 μl液体石蜡，短时离心，置93℃保温4min，再按下列步骤操作，变性93℃ 30S→退火50℃ 30S→延伸72℃ 60S，将Eppendorf管置于军事医学科学院研制的JK-236型PCR自动循环仪进行35个循环，最后置于72℃ 5min. 电泳鉴定：取10 μl扩增产物(扩增片段为430 bp)与1 μl溴酚蓝混匀，用2%琼脂糖凝胶(含0.5%溴乙锭)经TAE电泳30min(电压5V/ cm)，用紫外线投射仪检查，若标本扩增带与阳性对照扩增带处于同一位置，可判定标本为Hp阳性，否则为阴性(见图1).
, 百拇医药
2 结果
10例石蜡包埋癌组织中有6例Hp阳性(其中胃窦癌4例，胃体小弯侧癌2例)，其余4例为阴性；上述结果说明：本组病例中Hp在癌灶内较多，但因病例少未做统计学处理.
图1 1.DNA分子量标准参照物 PGEM 3Zf(+) Hae Ⅲ
2.胃癌石蜡包埋组织 3.阳性对照物 4.阴性对照物
3 讨论
自1983年 Warren与Mashall从胃粘膜中分离出幽门螺杆菌后，十多年来国内外学者对Hp感染与胃癌的关系从多方面做了大量研究. 目前多数学者已经认为Hp是慢性活动性胃炎病原菌，是消化性溃疡的重要致病因子，可能是胃癌的协同致癌因子. 在对Hp与胃癌的研究中大量临床研究资料证明：在胃癌灶之外的胃粘膜做Hp培养. 病理组织学及PCR检测Hp，证明Hp主要存在于癌旁组织中，因而提出Hp做为胃癌发生的启动因子[1]，可能是通过Hp感染→慢性胃炎→萎缩性胃炎→肠化生→胃癌这一过程发挥其协同致癌作用[2-6]. 只有个别报道在癌灶组织中行病理学检查Hp存在，如杨润宽[7]报道对2例贲门癌，74例非贲门癌(其中有16例早期胃癌和30例胃癌手术标本)的癌灶组织用Warthin-Starry染色，发现早期胃癌癌灶中Hp检出率为81.3%(13/ 16)，非贲门癌中Hp检出率为75.4%(43/ 57)，粘液腺癌灶中Hp检出率为30%(3/ 10)；本文采用PCR法从10例胃癌石蜡包埋癌灶组织中检测出6例Hp阳性，且均为非贲门腺癌(胃窦癌4例，胃小弯侧癌2例)，和杨润宽研究基本一致，这些研究则说明Hp不仅在癌灶旁胃粘膜中存在，而且在癌灶中也存在，这就支持Hp使胃粘膜上皮细胞中的一氧化氮合成酶(iNOS)活化. 癌基因(p53,Bcl-2,C-Ha-ras等)突变及超表达和细胞凋亡等致癌机制假说[1-2]. 由于后者报道较少，故目前对Hp到底是除于癌灶旁存在外，在癌灶中或两处均存在 是否两处Hp存在的比例有差别 等意见尚不一致，故对Hp如何起协同致癌作用的机制很难定论，有待于今后进一步研究，而本文提供的资料对今后深入研究可能有一定作用.
, 百拇医药
通讯作者 李若平
收稿日期 1998-03-28 修回日期 1998-04-17
4 参考文献
1 林三仁. 幽门螺杆菌与胃癌关系的进展. 中华消化杂志，1997；17(5)：249-250
2 祖毅. 幽门螺杆菌感染与胃癌关系的研究进展. 国外医学内科学分册，1998；25(2)：58-59
3 Shigeru E, Toshifumi O, Yusuke S, Detection of Helicobacter pylori infection in early stage gastric cancer. Cancer, 1995;75(8):2203-2206
4 Walker MM, Pretolani S, Gasbarrini G. Gastric carcinoma and gastric lymphoma. Current Opinion in Gastroenterology, 1996;12(Suppl):33-35
, http://www.100md.com
5 Yutaka Hauda, Toshihiko Saitoh, Minoru Kawaguehi, Association of Helicobacter pylori and diffuse type gastric cancer. J Gastroenterol, 1996;31(Suppl 9):29-30
6 徐世平. 幽门螺杆菌感染与人胃癌相关性研究. 中华消化杂志，1997；17(4)：211-212
7 杨润宽. 幽门螺杆菌感染与胃癌相关性研究. 中华消化杂志，1997；17(5)：251-253ISSN 1007-9319 CN 14-1218/ R 华人消化杂志，1998;6(8):734, 百拇医药(李若平1 张振科2 姚希贤2 任锡玲21 李兰更2)
单位：1解放军271医院消化科 天津市 300191；2河北医科大学第二医院消化科 石家庄市 050000
关键词：胃肿瘤/微生物学；螺杆菌，幽门；腺癌/微生物学；聚合酶链反应
华人消化杂志980839Subject headings stomach neoplasms/microbiology; Helicobacter pylori; adenocarcinoma/microbiology; polymerase chain reaction
中国图书资料分类号 R 735.2
, 百拇医药 1 对象和方法
1.1 对象 本研究选用河北医科大学第二医院1995年度经外科手术病理证实为胃癌的10例患者，年龄47岁～56岁，男7例，女3例，其中贲门胃底癌1例、胃窦癌6例、胃体小弯侧癌3例，病理均为腺癌. 对此10例切除具有癌灶标本用石蜡包埋备用.
1.2 方法 组织切片：取备用之胃癌石蜡包埋组织块用切片机切成厚度为10 μm薄片，每例均切2片，用无菌小镊夹入盛有0.5 ml二甲苯溶液的无菌Eppendorf管内，每次操作完后对刀片、小镊子用二甲苯认真擦洗，以防止交叉污染. 脱蜡：用微量离心机(12000 r/ min)离心5min沉淀组织和残存的石蜡，小心吸去壁上残存的二甲苯，再重复上述操作一次，加入0.5 ml无水乙醇翻转混匀，再用微量离心机离心5min，小心吸去乙醇，然后再次加入0.5 ml无水乙醇并翻转混匀离心5min，尽可能除去壁上残存的乙醇，真空干燥2 h，使乙醇完全挥发，干燥时用封口膜封住Eppendorf管，并在其上打几个小孔，防止污染. 模板(Template)提取：向上述干燥后的Eppendorf管内加入100 μl裂解液混匀，然后加入4 μl蛋白酶K，50℃水浴1 h，取出后置于沸水浴5min，最后离心(15000 r/ min)5min，取10 μl备用. PCR扩增：采用上海复华实业股份有限公司生物技术中心生产的Hp基因检测试剂盒，该试剂盒选择互补于Hp种尿素酶A基因片段为特异引物，引物1：5＇-GCCAATGGTAAATTAGTT-3＇，引物2：5＇-CTCCTTAATTGTTTTTAC-3＇，按顺序在500 μl的无菌Eppendorf管内加入18 μl反应液，2 μl稀释后的FD DNA polymerase, 10μl模板DNA提取液并做阳性对照(阴性对照加10 μl无菌双蒸水)，摇匀后加20 μl液体石蜡，短时离心，置93℃保温4min，再按下列步骤操作，变性93℃ 30S→退火50℃ 30S→延伸72℃ 60S，将Eppendorf管置于军事医学科学院研制的JK-236型PCR自动循环仪进行35个循环，最后置于72℃ 5min. 电泳鉴定：取10 μl扩增产物(扩增片段为430 bp)与1 μl溴酚蓝混匀，用2%琼脂糖凝胶(含0.5%溴乙锭)经TAE电泳30min(电压5V/ cm)，用紫外线投射仪检查，若标本扩增带与阳性对照扩增带处于同一位置，可判定标本为Hp阳性，否则为阴性(见图1).
, 百拇医药
2 结果
10例石蜡包埋癌组织中有6例Hp阳性(其中胃窦癌4例，胃体小弯侧癌2例)，其余4例为阴性；上述结果说明：本组病例中Hp在癌灶内较多，但因病例少未做统计学处理.
图1 1.DNA分子量标准参照物 PGEM 3Zf(+) Hae Ⅲ
2.胃癌石蜡包埋组织 3.阳性对照物 4.阴性对照物
3 讨论
自1983年 Warren与Mashall从胃粘膜中分离出幽门螺杆菌后，十多年来国内外学者对Hp感染与胃癌的关系从多方面做了大量研究. 目前多数学者已经认为Hp是慢性活动性胃炎病原菌，是消化性溃疡的重要致病因子，可能是胃癌的协同致癌因子. 在对Hp与胃癌的研究中大量临床研究资料证明：在胃癌灶之外的胃粘膜做Hp培养. 病理组织学及PCR检测Hp，证明Hp主要存在于癌旁组织中，因而提出Hp做为胃癌发生的启动因子[1]，可能是通过Hp感染→慢性胃炎→萎缩性胃炎→肠化生→胃癌这一过程发挥其协同致癌作用[2-6]. 只有个别报道在癌灶组织中行病理学检查Hp存在，如杨润宽[7]报道对2例贲门癌，74例非贲门癌(其中有16例早期胃癌和30例胃癌手术标本)的癌灶组织用Warthin-Starry染色，发现早期胃癌癌灶中Hp检出率为81.3%(13/ 16)，非贲门癌中Hp检出率为75.4%(43/ 57)，粘液腺癌灶中Hp检出率为30%(3/ 10)；本文采用PCR法从10例胃癌石蜡包埋癌灶组织中检测出6例Hp阳性，且均为非贲门腺癌(胃窦癌4例，胃小弯侧癌2例)，和杨润宽研究基本一致，这些研究则说明Hp不仅在癌灶旁胃粘膜中存在，而且在癌灶中也存在，这就支持Hp使胃粘膜上皮细胞中的一氧化氮合成酶(iNOS)活化. 癌基因(p53,Bcl-2,C-Ha-ras等)突变及超表达和细胞凋亡等致癌机制假说[1-2]. 由于后者报道较少，故目前对Hp到底是除于癌灶旁存在外，在癌灶中或两处均存在 是否两处Hp存在的比例有差别 等意见尚不一致，故对Hp如何起协同致癌作用的机制很难定论，有待于今后进一步研究，而本文提供的资料对今后深入研究可能有一定作用.
, 百拇医药
通讯作者 李若平
收稿日期 1998-03-28 修回日期 1998-04-17
4 参考文献
1 林三仁. 幽门螺杆菌与胃癌关系的进展. 中华消化杂志，1997；17(5)：249-250
2 祖毅. 幽门螺杆菌感染与胃癌关系的研究进展. 国外医学内科学分册，1998；25(2)：58-59
3 Shigeru E, Toshifumi O, Yusuke S, Detection of Helicobacter pylori infection in early stage gastric cancer. Cancer, 1995;75(8):2203-2206
4 Walker MM, Pretolani S, Gasbarrini G. Gastric carcinoma and gastric lymphoma. Current Opinion in Gastroenterology, 1996;12(Suppl):33-35
, http://www.100md.com
5 Yutaka Hauda, Toshihiko Saitoh, Minoru Kawaguehi, Association of Helicobacter pylori and diffuse type gastric cancer. J Gastroenterol, 1996;31(Suppl 9):29-30
6 徐世平. 幽门螺杆菌感染与人胃癌相关性研究. 中华消化杂志，1997；17(4)：211-212
7 杨润宽. 幽门螺杆菌感染与胃癌相关性研究. 中华消化杂志，1997；17(5)：251-253ISSN 1007-9319 CN 14-1218/ R 华人消化杂志，1998;6(8):734, 百拇医药(李若平1 张振科2 姚希贤2 任锡玲21 李兰更2)