lac Z转基因鼠体内角蛋白5及10的分布
作者：彭振辉 John J. Voorhees
单位：710004 西安医科大学第二临床医学院皮肤科(彭振辉)；美国密执安大学医学中心皮肤系(John J. Voorhees)
关键词：动物，转基因；乳糖操纵子；角蛋白
中华医学杂志980829 【摘要】 目的 探讨角蛋白5、10(K5、K10)在活鼠体内的分布。方法 (1) 用带有β-半乳糖甙酶编码的Lac Z作为报告基因，分别以牛K5、K10[含酶切位点(Sal Ⅰ)]为启动子的片段插入pLGZ及pLBS-2质粒。(2) 用微注射法将移植基因片段注入鼠受精卵中，保留聚合酶链反应(PCR)阳性者的后代作为实验用鼠。(3) 切转基因鼠背、尾等冰冻切片，0.1% 5-溴-4氯-3吲哚-β-D半乳糖甙(χ-gal)溶液复盖，核固红补染。结果 在鳞状上皮中，K5分布于表皮基层及毛囊外壁，K10分布于基底上层及毛囊外壁；除鳞状上皮外，K5、K10分布于除心脏外的基它脏器中，但脑中无K5分布。结论 lac Z转基因鼠有助于基因突变及基因治疗的研究；对K5、K10在体内分布的了解，有助于探索相关疾病及肿瘤的发生机制。
, 百拇医药
Distribution of K5, K10 in transgenic mouse with lac Z reporter gene Peng Zhenhui*, John J. Voorhees. * Department of Dermatology，Second Affiliated Hospital, Xian Medical University, Xian 710004
【Abstract】 Objective To detect the distribution of K5, K10 in live mouse. Methods lacZ gene, which encodes β-galactosidase, as a reporter gene, bovine K5, K10 as prmoter, containing Sal Ⅰ fragment, was inserted into the Sal Ⅰ sites of PLGZ and PLBS-2, respectively. The constructs were microinjected into the mice fertilized eggs, and then PCR positive ones were kept. The next generations could be used for experiments. Frozen sections of transgenic mice skin, tail were stained with 0.1% X-gal solution at 37 ℃ overnight and counterstained with nuclear fast red. Result In sguamous epidermis, K5 was distributed in basal and outer root sheath, K10 in suprabasal and inner root sheath. K5 and K10 were also distributed in some other organs except heart. No K5 was seen in the brain. Conclusion lacZ transgenic animal is helpful in the study of gene mutation and treatment. The recognition of K5 and K10 distribution could be a primary step to probe the mechanism of some related diseases and cancers.
, 百拇医药
【Key words】 Animals, transgenic Lac operor Keratin
(Natl Med J China, 1998, 78：633-635)
lac Z作为一种可供移植的“报告”基因已被广泛用作生物体内各种基因表达调控的定性及定量研究[1]。角蛋白5、10(K5、K10)是皮肤的重要结构蛋白，对其作用与功能，特别是与相关疾病及肿瘤的关系，仍在研究之中。我们以K5、K10为启动子，建立lac Z转基因鼠动物模型，直观显示K5、K10在体内的分布，为进一步研究创造了条件。
材料与方法
一、lac转基因鼠动物模型建立
, 百拇医药
将牛K5、K10(含Sal Ⅰ)为启动子的大肠杆菌lac Z基因分别插入pLGZ，pLBS-2质粒。以Not Ⅰ分别水解质粒，所得移植基因片段以微注射法注入纯种鼠C57BL/6J和SJL/J杂交而得的受精卵中，注射浓度为2～3 ng/μl，注射后的受精卵孵化过夜发育至双细胞阶段时回植入一交配后半日、假性妊娠的CD-1母鼠子宫腔内。CD-1鼠21天后产下幼鼠，2周后切取少量鼠尾，经以Lac Z作为引物的聚合酶链反应(PCR)甄别，保留阳性鼠(F0)。以雄性F0代转基因鼠与雌性C57BL/6J纯种鼠交配，PCR甄别幼鼠，得到子代lac Z转基因鼠(F1)。F1或(及)其后代转基因鼠可作为实验用鼠。
二、β-半乳糖甙酶活性测定
取实验用转基因鼠背部皮肤、尾、舌、脑、心、肺、肝、肾、小肠和结肠标本，即冻入冰冻切片冷媒液OCT中，切片厚5 μm，空气中干燥半小时，4%甲醛液固定10分钟，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次。0.1% 5-溴-4氯-3吲哚-β-D半乳糖甙(χ-gal)溶液完全复盖标本，置湿盒内于5% CO2，37 ℃孵箱内过
, 百拇医药
图1 鼠背部皮肤，K5分布于表皮基层及毛囊外壁 X-gal液染，核固红补染(图2～20同) ×300(图2，4～20同) 图2 鼠背部皮肤，K10分布于表皮基底上层及毛囊内壁 图3 鼠尾，K5分布于表皮基层及毛囊外壁 ×150 图4 鼠尾，K10分布于表皮基底上层及毛囊内壁 图5 鼠舌乳头，K5分布于基层 图6 鼠舌乳头，K10分布于基底上层 图7 鼠脑无K5分布 图8 鼠脑，K10呈点状分布 图9 鼠心脏 中无K5分布 图10 鼠心脏中无K10分布 图11 鼠肺，K5间断分布于支气管壁粘膜 图12 鼠肺，K10间断分布于肺泡间质 图13 鼠肝上皮K5分布 图14 鼠肝上皮K10分布 图15 鼠肾小管上皮K5分布 图16 鼠肾小管上皮K10分布 图17 鼠小肠，K5分布于固有膜及绒毛上皮 图18 鼠小肠，K10分布于绒毛上皮 图19 鼠结肠，K5分布于粘膜上皮 图20 鼠结肠，K10分布于粘膜上皮
, http://www.100md.com
夜。次晨以PBS清洗3次，核固红补染3～5分钟。清水清洗，点盖玻液后加盖玻片镜检。
结 果
β-半乳糖甙酶可将无色的χ-gal转变成蓝色的靛兰，无此酶活性区被核固红补染成红色。本实验中表达β-半乳糖甙酶的lac Z基因分别被K5或K10导入其特定的分布区域，其分布特点为：在鳞状上皮中，K5分布于背部皮肤及尾的表皮基层、毛囊外壁，舌乳头基层细胞中；K10则分布于背部皮肤及尾表皮的基底上层、毛囊内壁及舌乳头基底上层细胞中。除鳞状上皮外，其它脏器亦有K5和K10的分布，K5分布在肝脏上皮组织、肾脏肾小管上皮、肺支气管粘膜、小肠固有膜及结肠粘膜上皮，脑和心脏中未见K5分布。K10分布在肝脏上皮、肾小管上皮、脑组织、肺间质、小肠绒毛上皮及结肠粘膜内，心脏中未见K10分布(图1～20)。
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讨 论
由于β-半乳糖甙酶可将无色的χ-gal转变成直观可视的蓝色靛蓝，而表达此酶的lac Z基因又可被特定启动子导入该启动子特异的分布区域，所以lac Z基因的表达可以准确地“报告”启动基因的位置，其精确度可以细胞计。正是由于以上特性，lac Z转基因动物实验常常被作为转基因动物研究的预备实验，研究者以此选择最佳启动子，也可以此验证所选用的启动子是否可将所需研究的基因导入所需位置。正常鼠体内β-半乳糖甙酶仅在肠道大肠杆菌，皮肤皮脂腺导管内有少量表达，说明实验受内源性酶假阳性干扰的可能性很小。本实验中，lac Z基因表达的部位也正是K5、K10的分布区域。
角蛋白是皮肤的重要结构蛋白之一，已知角蛋白在皮肤角朊细胞形成与分化过程中有重要作用，但对其作用机制尚不十分明了。角蛋白不仅存在于皮肤中，也存在于其它组织器官中[2]，甚至存在于一些非上皮组织中[3]。许多疾病，尤其是遗传性疾病及肿 瘤与角蛋白异常有关[4]。因角蛋白表达异常往往较组织异常改变发生更早，所以以角蛋白为标志物进行深入研究，有利于了解早期肿瘤或疾病发生机制[5]。因突变角蛋白转基因动物模型表现也有与人类某些疾病相类似的症状[6]，所以转基因动物研究无疑是基因诊断及基因治疗研究的有力手段。本研究显示，K5、K10在脏器的分布特点对研究与角蛋白异常相关疾病及肿瘤的发生机制提供了线索。
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参考文献
1 Lampson LA, Lampson MA, Dunne AD. Exploiting the lac Z reporter gene for quantitative analysis of disseminated tumor growth within the brain:use of the lac Z gene product as a tumor antigen, for evaluation of antigenic modulation, and to facilitate image analysis of tumor growth in situ. Cancer Res. 1993, 53：176-182.
2 Moll R, Franke WW, Schiller DL. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors, and cultured cells. Cell, 1982, 31：11-24.
, 百拇医药
3 Traweek ST, Liu J, Battifora H. Keratin gene expression in non-epithelial tissues. detection with polymerase chain reaction. Am J Pathol, 1993, 142：1111-1118.
4 Fuchs E. Genetic skin disorders of keratin. J Invest Dermatol, 1992, 99：671-674.
5 Nelson W, Sun T-T. The 50-and 58-kdalton keration classes as molecular markers for stratified squamous epithelia: cell culture studies. J Cell Biol, 1983, 97：244-249.
6 Fuchs E, Esteves RA, Coulombe PA. Transgenic mice expressing a mutant keratin 10 gene reveal the likely genetic basis for epidermolytic hyperkeratosis. Proc Netl Acad Sci USA, 1992, 89：6906-6910.
(收稿：1997-11-26 修回：1998-05-11), http://www.100md.com
单位：710004 西安医科大学第二临床医学院皮肤科(彭振辉)；美国密执安大学医学中心皮肤系(John J. Voorhees)
关键词：动物，转基因；乳糖操纵子；角蛋白
中华医学杂志980829 【摘要】 目的 探讨角蛋白5、10(K5、K10)在活鼠体内的分布。方法 (1) 用带有β-半乳糖甙酶编码的Lac Z作为报告基因，分别以牛K5、K10[含酶切位点(Sal Ⅰ)]为启动子的片段插入pLGZ及pLBS-2质粒。(2) 用微注射法将移植基因片段注入鼠受精卵中，保留聚合酶链反应(PCR)阳性者的后代作为实验用鼠。(3) 切转基因鼠背、尾等冰冻切片，0.1% 5-溴-4氯-3吲哚-β-D半乳糖甙(χ-gal)溶液复盖，核固红补染。结果 在鳞状上皮中，K5分布于表皮基层及毛囊外壁，K10分布于基底上层及毛囊外壁；除鳞状上皮外，K5、K10分布于除心脏外的基它脏器中，但脑中无K5分布。结论 lac Z转基因鼠有助于基因突变及基因治疗的研究；对K5、K10在体内分布的了解，有助于探索相关疾病及肿瘤的发生机制。
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Distribution of K5, K10 in transgenic mouse with lac Z reporter gene Peng Zhenhui*, John J. Voorhees. * Department of Dermatology，Second Affiliated Hospital, Xian Medical University, Xian 710004
【Abstract】 Objective To detect the distribution of K5, K10 in live mouse. Methods lacZ gene, which encodes β-galactosidase, as a reporter gene, bovine K5, K10 as prmoter, containing Sal Ⅰ fragment, was inserted into the Sal Ⅰ sites of PLGZ and PLBS-2, respectively. The constructs were microinjected into the mice fertilized eggs, and then PCR positive ones were kept. The next generations could be used for experiments. Frozen sections of transgenic mice skin, tail were stained with 0.1% X-gal solution at 37 ℃ overnight and counterstained with nuclear fast red. Result In sguamous epidermis, K5 was distributed in basal and outer root sheath, K10 in suprabasal and inner root sheath. K5 and K10 were also distributed in some other organs except heart. No K5 was seen in the brain. Conclusion lacZ transgenic animal is helpful in the study of gene mutation and treatment. The recognition of K5 and K10 distribution could be a primary step to probe the mechanism of some related diseases and cancers.
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【Key words】 Animals, transgenic Lac operor Keratin
(Natl Med J China, 1998, 78：633-635)
lac Z作为一种可供移植的“报告”基因已被广泛用作生物体内各种基因表达调控的定性及定量研究[1]。角蛋白5、10(K5、K10)是皮肤的重要结构蛋白，对其作用与功能，特别是与相关疾病及肿瘤的关系，仍在研究之中。我们以K5、K10为启动子，建立lac Z转基因鼠动物模型，直观显示K5、K10在体内的分布，为进一步研究创造了条件。
材料与方法
一、lac转基因鼠动物模型建立
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将牛K5、K10(含Sal Ⅰ)为启动子的大肠杆菌lac Z基因分别插入pLGZ，pLBS-2质粒。以Not Ⅰ分别水解质粒，所得移植基因片段以微注射法注入纯种鼠C57BL/6J和SJL/J杂交而得的受精卵中，注射浓度为2～3 ng/μl，注射后的受精卵孵化过夜发育至双细胞阶段时回植入一交配后半日、假性妊娠的CD-1母鼠子宫腔内。CD-1鼠21天后产下幼鼠，2周后切取少量鼠尾，经以Lac Z作为引物的聚合酶链反应(PCR)甄别，保留阳性鼠(F0)。以雄性F0代转基因鼠与雌性C57BL/6J纯种鼠交配，PCR甄别幼鼠，得到子代lac Z转基因鼠(F1)。F1或(及)其后代转基因鼠可作为实验用鼠。
二、β-半乳糖甙酶活性测定
取实验用转基因鼠背部皮肤、尾、舌、脑、心、肺、肝、肾、小肠和结肠标本，即冻入冰冻切片冷媒液OCT中，切片厚5 μm，空气中干燥半小时，4%甲醛液固定10分钟，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次。0.1% 5-溴-4氯-3吲哚-β-D半乳糖甙(χ-gal)溶液完全复盖标本，置湿盒内于5% CO2，37 ℃孵箱内过
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图1 鼠背部皮肤，K5分布于表皮基层及毛囊外壁 X-gal液染，核固红补染(图2～20同) ×300(图2，4～20同) 图2 鼠背部皮肤，K10分布于表皮基底上层及毛囊内壁 图3 鼠尾，K5分布于表皮基层及毛囊外壁 ×150 图4 鼠尾，K10分布于表皮基底上层及毛囊内壁 图5 鼠舌乳头，K5分布于基层 图6 鼠舌乳头，K10分布于基底上层 图7 鼠脑无K5分布 图8 鼠脑，K10呈点状分布 图9 鼠心脏 中无K5分布 图10 鼠心脏中无K10分布 图11 鼠肺，K5间断分布于支气管壁粘膜 图12 鼠肺，K10间断分布于肺泡间质 图13 鼠肝上皮K5分布 图14 鼠肝上皮K10分布 图15 鼠肾小管上皮K5分布 图16 鼠肾小管上皮K10分布 图17 鼠小肠，K5分布于固有膜及绒毛上皮 图18 鼠小肠，K10分布于绒毛上皮 图19 鼠结肠，K5分布于粘膜上皮 图20 鼠结肠，K10分布于粘膜上皮
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夜。次晨以PBS清洗3次，核固红补染3～5分钟。清水清洗，点盖玻液后加盖玻片镜检。
结 果
β-半乳糖甙酶可将无色的χ-gal转变成蓝色的靛兰，无此酶活性区被核固红补染成红色。本实验中表达β-半乳糖甙酶的lac Z基因分别被K5或K10导入其特定的分布区域，其分布特点为：在鳞状上皮中，K5分布于背部皮肤及尾的表皮基层、毛囊外壁，舌乳头基层细胞中；K10则分布于背部皮肤及尾表皮的基底上层、毛囊内壁及舌乳头基底上层细胞中。除鳞状上皮外，其它脏器亦有K5和K10的分布，K5分布在肝脏上皮组织、肾脏肾小管上皮、肺支气管粘膜、小肠固有膜及结肠粘膜上皮，脑和心脏中未见K5分布。K10分布在肝脏上皮、肾小管上皮、脑组织、肺间质、小肠绒毛上皮及结肠粘膜内，心脏中未见K10分布(图1～20)。
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由于β-半乳糖甙酶可将无色的χ-gal转变成直观可视的蓝色靛蓝，而表达此酶的lac Z基因又可被特定启动子导入该启动子特异的分布区域，所以lac Z基因的表达可以准确地“报告”启动基因的位置，其精确度可以细胞计。正是由于以上特性，lac Z转基因动物实验常常被作为转基因动物研究的预备实验，研究者以此选择最佳启动子，也可以此验证所选用的启动子是否可将所需研究的基因导入所需位置。正常鼠体内β-半乳糖甙酶仅在肠道大肠杆菌，皮肤皮脂腺导管内有少量表达，说明实验受内源性酶假阳性干扰的可能性很小。本实验中，lac Z基因表达的部位也正是K5、K10的分布区域。
角蛋白是皮肤的重要结构蛋白之一，已知角蛋白在皮肤角朊细胞形成与分化过程中有重要作用，但对其作用机制尚不十分明了。角蛋白不仅存在于皮肤中，也存在于其它组织器官中[2]，甚至存在于一些非上皮组织中[3]。许多疾病，尤其是遗传性疾病及肿 瘤与角蛋白异常有关[4]。因角蛋白表达异常往往较组织异常改变发生更早，所以以角蛋白为标志物进行深入研究，有利于了解早期肿瘤或疾病发生机制[5]。因突变角蛋白转基因动物模型表现也有与人类某些疾病相类似的症状[6]，所以转基因动物研究无疑是基因诊断及基因治疗研究的有力手段。本研究显示，K5、K10在脏器的分布特点对研究与角蛋白异常相关疾病及肿瘤的发生机制提供了线索。
, 百拇医药
参考文献
1 Lampson LA, Lampson MA, Dunne AD. Exploiting the lac Z reporter gene for quantitative analysis of disseminated tumor growth within the brain:use of the lac Z gene product as a tumor antigen, for evaluation of antigenic modulation, and to facilitate image analysis of tumor growth in situ. Cancer Res. 1993, 53：176-182.
2 Moll R, Franke WW, Schiller DL. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors, and cultured cells. Cell, 1982, 31：11-24.
, 百拇医药
3 Traweek ST, Liu J, Battifora H. Keratin gene expression in non-epithelial tissues. detection with polymerase chain reaction. Am J Pathol, 1993, 142：1111-1118.
4 Fuchs E. Genetic skin disorders of keratin. J Invest Dermatol, 1992, 99：671-674.
5 Nelson W, Sun T-T. The 50-and 58-kdalton keration classes as molecular markers for stratified squamous epithelia: cell culture studies. J Cell Biol, 1983, 97：244-249.
6 Fuchs E, Esteves RA, Coulombe PA. Transgenic mice expressing a mutant keratin 10 gene reveal the likely genetic basis for epidermolytic hyperkeratosis. Proc Netl Acad Sci USA, 1992, 89：6906-6910.
(收稿：1997-11-26 修回：1998-05-11), http://www.100md.com