表皮生长因子受体单克隆抗体与丝裂霉素C交联物的抗肺癌活性
作者：陈小东 张尚权 严缘昌 钮善福
单位：200032 上海医科大学附属中山医院肺科(陈小东、钮善福)；中国科学院上海细胞生物学研究所(张尚权、严缘昌)
关键词：
中华医学杂志980831 近年来，一些调控肿瘤细胞生长的癌基因同源产物已成为肿瘤抗体导向治疗研究的靶点，表皮生长因子受体(EGFR)就是其中之一[1]。我们报道EGFR单克隆抗体(单抗)与丝裂霉素C(MMC)交联物对人肺癌细胞的体外杀伤作用，以探讨抗EGFR单抗在肺癌导向治疗中的应用价值。
一、材料和方法
本课题为上海市科技发展基金资助项目(954119028)
1.细胞株：选用人肺腺癌SPCA-1和A549细胞株作为靶细胞，人红白血病K562细胞株作为对照。细胞株连续培养在含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液中。
, 百拇医药
2.EGFR单抗：EGFR单抗杂交瘤株EQ75为本室自制。按常规制备小鼠腹水，经50%饱和硫酸铵沉淀初提后用快速蛋白液相色谱系统(FPLC，Pharmacia)及蛋白G亲和层析柱纯化单抗。以人阴道上皮癌A431细胞为阳性对照细胞，采用间接免疫荧光法及流式细胞仪鉴定单抗的特异性。
3.EGFR单抗与MMC交联物的制备：参照文献[2]方法加以改进。主要步骤为：溶于二甲基甲酰胺中的MMC在N-羟基琥珀酰亚胺及二环已基碳二亚胺作用下成为MMC活化酯；人血清白蛋白用N-琥珀酰亚氨基-3-(2-二硫吡啶)丙酯酸引入巯基。两者反应物再与已用N-琥珀酰亚胺碘乙酸酯于单抗(IgG)氨基端引入碘乙酰基的碘乙酰化单抗偶联，反应物过Sephadex G100柱分离获得硫醚键连接的免疫交联物。根据抗体及人血清白蛋白和MMC的消光系数计算交联物中IgG与MMC的摩尔数比，并以流式细胞仪免疫荧光法检测交联物中抗体的生物活性。
4.免疫交联物细胞毒活性测定：选用生长旺盛的人肺腺癌细胞株SPC A-1和A549作为靶细胞，人红白血病细胞K562为对照细胞，以噻唑蓝比色法测定交联物的细胞毒活性[3]。
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二、结果
1.EGFR单抗EQ75的鉴定：EGFR单抗EQ75对阳性对照细胞A431，受试细胞SPC A-1、A549及K562的免疫荧光FACS检测结果显示，A431、SPC A-1和A549细胞均强阳性，K562细胞为阴性。
2.免疫交联物中EQ75与MMC的摩尔数比及抗体生物活性：免疫交联物中EQ75与MMC的摩尔数比为1∶20～30。FACS免疫荧光法证实，免疫交联物制备过程中，抗体活性无丢失。
3.免疫交联物的细胞毒活性：免疫交联物EQ75-HSA-MMC对靶细胞SPC A-1和A549具有显著的杀伤作用，其杀伤活性是非靶细胞K562的306倍和100倍。免疫交联物对靶细胞SPC A-1和A549的杀伤活性较游离MMC增强25倍和13倍。但交联物对K562细胞的杀伤效应较游离MMC下降13倍。各测试物对靶与非靶细胞的50%抑制浓度(IC50)见附表。
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三、讨论
附表 各测试物对各受试细胞株的杀伤
活性(IC50，mol/L) 组别
细胞株
SPC A-1
A549
K562
MMC
3.9×10-8
6.1×10-8
3.9×10-8
, http://www.100md.com
EQ75
2.2×10-8
4.7×10-8
>2×10-7
EQ75-HSA
-MMC
1.6×10-9
4.9×10-9
4.9×10-7
注：MMC：丝裂霉素C；EQ75：EGFR单抗杂交瘤株；EQ75-HSA-MMC：免疫交联物
, 百拇医药
随着肿瘤分子生物学的发展，EGFR作为肿瘤导向治疗的潜在靶点已得到肯定[1]，并已证实EGFR单抗通过阻断EGFR介导的细胞信号传递，对某些高度表达EGFR的癌细胞具有显著的体内外生长抑制作用[4]。此外，EGFR单抗与化疗药物阿霉素或顺铂联合使用也具有抗癌协同作用[5]。从本结果可以看出，尽管游离MMC、抗EGFR单抗以及免疫交联物对靶细胞SPC A-1和A549均存在杀伤活性，但EQ75-HAS-MMC交联物对肺癌细胞株的体外杀伤效率显著强于游离MMC和EGFR单抗；而对非靶K562细胞，交联物的杀伤效率却明显低于游离MMC和EGFR单抗。上述结果表明EGFR单抗与MMC交联物对人肺腺癌细胞具有特异的选择性杀伤作用，证实EGFR单抗具备良好的导向性。
参考文献
1 Baselga J, Mendelson J. Receptor blockade with monoclonal antibodies as anti-cancer therapy. Pharmacol Ther, 1994,64：127-154.
, http://www.100md.com
2 Umemote N, Kato Y, Takeda Y, et al. Conjugates of mitomycin C with the immunoglobulin M monomer fragment of a monoclonal anti-MM46 immunoglobulin M antibody with or without serum albumin as intermediary. Immunol Cell Biol, 1984,6：297-307.
3 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays. J Immunol Methods, 1983,65：55-63.
4 Tosi E, Valota O′ Negri D, et al. Antitumor efficacy of an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antiboty and its F (ab′) 2 fragment against high and low EGFR-expressing carcinomas in nude mice. Int J Cancer, 1995,62：643-650.
5 Baselga J, Norton L, Masui H, et al. Antitumor effects of Doxorubicin in combination with anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies. J Natl Cancer Inst, 1993,85：1327-1333.
(收稿：1997-08-11 修回：1998-04-15), http://www.100md.com
单位：200032 上海医科大学附属中山医院肺科(陈小东、钮善福)；中国科学院上海细胞生物学研究所(张尚权、严缘昌)
关键词：
中华医学杂志980831 近年来，一些调控肿瘤细胞生长的癌基因同源产物已成为肿瘤抗体导向治疗研究的靶点，表皮生长因子受体(EGFR)就是其中之一[1]。我们报道EGFR单克隆抗体(单抗)与丝裂霉素C(MMC)交联物对人肺癌细胞的体外杀伤作用，以探讨抗EGFR单抗在肺癌导向治疗中的应用价值。
一、材料和方法
本课题为上海市科技发展基金资助项目(954119028)
1.细胞株：选用人肺腺癌SPCA-1和A549细胞株作为靶细胞，人红白血病K562细胞株作为对照。细胞株连续培养在含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液中。
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2.EGFR单抗：EGFR单抗杂交瘤株EQ75为本室自制。按常规制备小鼠腹水，经50%饱和硫酸铵沉淀初提后用快速蛋白液相色谱系统(FPLC，Pharmacia)及蛋白G亲和层析柱纯化单抗。以人阴道上皮癌A431细胞为阳性对照细胞，采用间接免疫荧光法及流式细胞仪鉴定单抗的特异性。
3.EGFR单抗与MMC交联物的制备：参照文献[2]方法加以改进。主要步骤为：溶于二甲基甲酰胺中的MMC在N-羟基琥珀酰亚胺及二环已基碳二亚胺作用下成为MMC活化酯；人血清白蛋白用N-琥珀酰亚氨基-3-(2-二硫吡啶)丙酯酸引入巯基。两者反应物再与已用N-琥珀酰亚胺碘乙酸酯于单抗(IgG)氨基端引入碘乙酰基的碘乙酰化单抗偶联，反应物过Sephadex G100柱分离获得硫醚键连接的免疫交联物。根据抗体及人血清白蛋白和MMC的消光系数计算交联物中IgG与MMC的摩尔数比，并以流式细胞仪免疫荧光法检测交联物中抗体的生物活性。
4.免疫交联物细胞毒活性测定：选用生长旺盛的人肺腺癌细胞株SPC A-1和A549作为靶细胞，人红白血病细胞K562为对照细胞，以噻唑蓝比色法测定交联物的细胞毒活性[3]。
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二、结果
1.EGFR单抗EQ75的鉴定：EGFR单抗EQ75对阳性对照细胞A431，受试细胞SPC A-1、A549及K562的免疫荧光FACS检测结果显示，A431、SPC A-1和A549细胞均强阳性，K562细胞为阴性。
2.免疫交联物中EQ75与MMC的摩尔数比及抗体生物活性：免疫交联物中EQ75与MMC的摩尔数比为1∶20～30。FACS免疫荧光法证实，免疫交联物制备过程中，抗体活性无丢失。
3.免疫交联物的细胞毒活性：免疫交联物EQ75-HSA-MMC对靶细胞SPC A-1和A549具有显著的杀伤作用，其杀伤活性是非靶细胞K562的306倍和100倍。免疫交联物对靶细胞SPC A-1和A549的杀伤活性较游离MMC增强25倍和13倍。但交联物对K562细胞的杀伤效应较游离MMC下降13倍。各测试物对靶与非靶细胞的50%抑制浓度(IC50)见附表。
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三、讨论
附表 各测试物对各受试细胞株的杀伤
活性(IC50，mol/L) 组别
细胞株
SPC A-1
A549
K562
MMC
3.9×10-8
6.1×10-8
3.9×10-8
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EQ75
2.2×10-8
4.7×10-8
>2×10-7
EQ75-HSA
-MMC
1.6×10-9
4.9×10-9
4.9×10-7
注：MMC：丝裂霉素C；EQ75：EGFR单抗杂交瘤株；EQ75-HSA-MMC：免疫交联物
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随着肿瘤分子生物学的发展，EGFR作为肿瘤导向治疗的潜在靶点已得到肯定[1]，并已证实EGFR单抗通过阻断EGFR介导的细胞信号传递，对某些高度表达EGFR的癌细胞具有显著的体内外生长抑制作用[4]。此外，EGFR单抗与化疗药物阿霉素或顺铂联合使用也具有抗癌协同作用[5]。从本结果可以看出，尽管游离MMC、抗EGFR单抗以及免疫交联物对靶细胞SPC A-1和A549均存在杀伤活性，但EQ75-HAS-MMC交联物对肺癌细胞株的体外杀伤效率显著强于游离MMC和EGFR单抗；而对非靶K562细胞，交联物的杀伤效率却明显低于游离MMC和EGFR单抗。上述结果表明EGFR单抗与MMC交联物对人肺腺癌细胞具有特异的选择性杀伤作用，证实EGFR单抗具备良好的导向性。
参考文献
1 Baselga J, Mendelson J. Receptor blockade with monoclonal antibodies as anti-cancer therapy. Pharmacol Ther, 1994,64：127-154.
, http://www.100md.com
2 Umemote N, Kato Y, Takeda Y, et al. Conjugates of mitomycin C with the immunoglobulin M monomer fragment of a monoclonal anti-MM46 immunoglobulin M antibody with or without serum albumin as intermediary. Immunol Cell Biol, 1984,6：297-307.
3 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays. J Immunol Methods, 1983,65：55-63.
4 Tosi E, Valota O′ Negri D, et al. Antitumor efficacy of an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antiboty and its F (ab′) 2 fragment against high and low EGFR-expressing carcinomas in nude mice. Int J Cancer, 1995,62：643-650.
5 Baselga J, Norton L, Masui H, et al. Antitumor effects of Doxorubicin in combination with anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies. J Natl Cancer Inst, 1993,85：1327-1333.
(收稿：1997-08-11 修回：1998-04-15), http://www.100md.com