肝癌bcl-2基因重排及与乙型肝炎病毒感染的关系
作者：郭琳琅 肖莎 曹长安
单位：510282 广州市，第一军医大学珠江医院病理科
关键词：
中华医学杂志/980918 为探讨bcl-2基因重排与肝癌发生和乙型肝炎病毒(HBV)感染的关系，我们采用半套式原位聚合酶链反应(PCR)和免疫组织化学技术对40例肝细胞癌中bcl-2/JH融合基因及乙型肝炎表面抗原(HBsAg)进行了原位检测。
一、对象与方法
1.对象：为本院肝细胞癌患者，共40例，年龄28～64岁。标本为手术切除及活检标本。根据Edmondson-Steiner分类法，40例患者中Ⅰ级7例，Ⅱ级18例，Ⅲ～Ⅳ级15例。正常对照肝组织7例。
2.方法：标本经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm切片。引物和探针设计：依据t(14；18)断裂点集中于bcl-2基因上的2个热点，设计2对半引物和1对寡核苷酸探针，探针采用生物素标记，由中国科学院上海生物工程研究所合成。主要断裂区外引物(mbr)A：5′-CAGCCTTGAAACATTGATGG-3′；次要断裂区外引物(mcr)B：5′-CGTGCTGGTACCACTCCTG-3′；主要断裂区内引物(mbr)C：5′-TATGGTGGTTTGACCTTTAG-3′；次要断裂区内引物(mcr)D：5′-GGACCTTCCTTGGTGTGTTG-3′；免疫球蛋白重链基因引物(JH)：5′-ACCTGAGGAGACGGT GACC-3′；探针序列：主要断裂区mbr：5′-CCCTCCTGCCCTCCTTCCG-3′；次要断裂区mcr：5′-GGACCTTCCTTGGTGTGTTG-3′。半套式原位PCR扩增：(1)前处理：常规脱蜡，HCl处理，蛋白酶K(10 μg/ml)消化。置扩增仪平台上，98℃2分钟。(2)原位PCR扩增：Taq DNA聚合酶和dNTP为华美生物工程公司产品。反应液体积20 μl，其中4×dNTP2 μl，Taq酶1.5 U，10×buffer 2 μl。第一轮扩增用引物A、JH扩增mbr，B、JH扩增mcr形成的融合基因。将反应液滴加在切片上，加盖玻片。反应条件：94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。第2轮扩增用引物C、JH扩增mbr，D、JH扩增mcr形成的融合基因，循环条件同上，扩增30个循环。原位杂交：2轮扩增后揭去盖玻片，滴加杂交液40 μl(探针浓度50 pmol/L)，95℃变性10分钟，置湿盒内37℃过夜。免疫学显色，2%正常牛血清及0.3% Triton X-100封闭非特异性抗原，滴加第二抗体，用碱性磷酸酶显色系统显色(福州迈新Maxim公司产品)。核酸杂交阳性信号位于细胞核内，为紫蓝色颗粒状(图1，2)。阳性对照：已知阳性滤泡性淋巴瘤细胞。阴性对照：(1)空白对照：仅作HE染色。(2)PCR反应液中不加dNTP或Taq酶。
, 百拇医药
图1 肝癌细胞核内见紫蓝色颗粒(mbr阳性，▲示)，原位PCR ×200 图2 肝癌细胞核内见紫蓝色颗粒(mcr阳性，▲示)，原位PCR ×200
(3)杂交液中不加探针。
二、结果
1.肝癌及癌旁细胞中bcl-2/JH融合基因检测：40例肝细胞癌中bcl-2/JH融合基因阳性10例，占25%。其中Ⅰ级1例，Ⅱ级5例，Ⅲ～Ⅳ级4例；各组织学分级间差异无显著意义(P>0.05)。bcl-2断裂点发生在mbr和mcr区域各有5例。癌旁肝细胞中2例出现bcl-2/JH融合基因，发生在mbr和mcr区域各1例。7例正常肝组织无bcl-2/JH融合基因。
2.bcl-2/JH融合基因阳性率与HBsAg检出率的关系：肝癌组织中HBsAg阳性12例，占30%，癌旁组织中25例阳性，占63%。12例HBsAg阳性肝癌中bcl-2/JH融合基因阳性3例，28例HBsAg阴性肝癌中bcl-2/JH融合基因7例；25例HBsAg阳性癌旁肝细胞，bcl-2/JH融合基因阳性1例，15例HBsAg阴性癌旁细胞中bcl-2/JH融合基因阳性1例。2组比较差异无显著意义(P>0.05)。
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三、讨论
本研究40例肝细胞癌中有10例出现bcl-2/JH融合基因，占25%，其中发生mbr和mcr区域各为5例。mbr和mcr区域可能同为bcl-2基因在肝细胞癌的2个重要断裂区。肝细胞癌中检测到bcl-2/JH融合基因，提示bcl-2基因重排在肝细胞癌变过程中可能起一定作用，而并非淋巴瘤的特异性改变。除癌细胞外，癌旁肝细胞中还检测到bcl-2/JH融合基因，说明bcl-2基因重排非肿瘤细胞所特有。
本研究对HBV感染与bcl-2基因重排的关系进行分析，发现HBsAg阳性和HBsAg阴性组bcl-2/JH融合基因检出率差异无显著意义，提示HBV感染与bcl-2基因重排无明显关系，HBV致肝细胞癌变的作用可能不是通过bcl-2基因重排实现的。肝细胞癌变是一个涉及多个癌基因和抑癌基因的复杂病理过程，bcl-2基因重排在肝细胞癌变过程中的作用，有待于进一步探讨。
(收稿：1997-09-07 修回：1998-05-14), 百拇医药
单位：510282 广州市，第一军医大学珠江医院病理科
关键词：
中华医学杂志/980918 为探讨bcl-2基因重排与肝癌发生和乙型肝炎病毒(HBV)感染的关系，我们采用半套式原位聚合酶链反应(PCR)和免疫组织化学技术对40例肝细胞癌中bcl-2/JH融合基因及乙型肝炎表面抗原(HBsAg)进行了原位检测。
一、对象与方法
1.对象：为本院肝细胞癌患者，共40例，年龄28～64岁。标本为手术切除及活检标本。根据Edmondson-Steiner分类法，40例患者中Ⅰ级7例，Ⅱ级18例，Ⅲ～Ⅳ级15例。正常对照肝组织7例。
2.方法：标本经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm切片。引物和探针设计：依据t(14；18)断裂点集中于bcl-2基因上的2个热点，设计2对半引物和1对寡核苷酸探针，探针采用生物素标记，由中国科学院上海生物工程研究所合成。主要断裂区外引物(mbr)A：5′-CAGCCTTGAAACATTGATGG-3′；次要断裂区外引物(mcr)B：5′-CGTGCTGGTACCACTCCTG-3′；主要断裂区内引物(mbr)C：5′-TATGGTGGTTTGACCTTTAG-3′；次要断裂区内引物(mcr)D：5′-GGACCTTCCTTGGTGTGTTG-3′；免疫球蛋白重链基因引物(JH)：5′-ACCTGAGGAGACGGT GACC-3′；探针序列：主要断裂区mbr：5′-CCCTCCTGCCCTCCTTCCG-3′；次要断裂区mcr：5′-GGACCTTCCTTGGTGTGTTG-3′。半套式原位PCR扩增：(1)前处理：常规脱蜡，HCl处理，蛋白酶K(10 μg/ml)消化。置扩增仪平台上，98℃2分钟。(2)原位PCR扩增：Taq DNA聚合酶和dNTP为华美生物工程公司产品。反应液体积20 μl，其中4×dNTP2 μl，Taq酶1.5 U，10×buffer 2 μl。第一轮扩增用引物A、JH扩增mbr，B、JH扩增mcr形成的融合基因。将反应液滴加在切片上，加盖玻片。反应条件：94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。第2轮扩增用引物C、JH扩增mbr，D、JH扩增mcr形成的融合基因，循环条件同上，扩增30个循环。原位杂交：2轮扩增后揭去盖玻片，滴加杂交液40 μl(探针浓度50 pmol/L)，95℃变性10分钟，置湿盒内37℃过夜。免疫学显色，2%正常牛血清及0.3% Triton X-100封闭非特异性抗原，滴加第二抗体，用碱性磷酸酶显色系统显色(福州迈新Maxim公司产品)。核酸杂交阳性信号位于细胞核内，为紫蓝色颗粒状(图1，2)。阳性对照：已知阳性滤泡性淋巴瘤细胞。阴性对照：(1)空白对照：仅作HE染色。(2)PCR反应液中不加dNTP或Taq酶。
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图1 肝癌细胞核内见紫蓝色颗粒(mbr阳性，▲示)，原位PCR ×200 图2 肝癌细胞核内见紫蓝色颗粒(mcr阳性，▲示)，原位PCR ×200
(3)杂交液中不加探针。
二、结果
1.肝癌及癌旁细胞中bcl-2/JH融合基因检测：40例肝细胞癌中bcl-2/JH融合基因阳性10例，占25%。其中Ⅰ级1例，Ⅱ级5例，Ⅲ～Ⅳ级4例；各组织学分级间差异无显著意义(P>0.05)。bcl-2断裂点发生在mbr和mcr区域各有5例。癌旁肝细胞中2例出现bcl-2/JH融合基因，发生在mbr和mcr区域各1例。7例正常肝组织无bcl-2/JH融合基因。
2.bcl-2/JH融合基因阳性率与HBsAg检出率的关系：肝癌组织中HBsAg阳性12例，占30%，癌旁组织中25例阳性，占63%。12例HBsAg阳性肝癌中bcl-2/JH融合基因阳性3例，28例HBsAg阴性肝癌中bcl-2/JH融合基因7例；25例HBsAg阳性癌旁肝细胞，bcl-2/JH融合基因阳性1例，15例HBsAg阴性癌旁细胞中bcl-2/JH融合基因阳性1例。2组比较差异无显著意义(P>0.05)。
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三、讨论
本研究40例肝细胞癌中有10例出现bcl-2/JH融合基因，占25%，其中发生mbr和mcr区域各为5例。mbr和mcr区域可能同为bcl-2基因在肝细胞癌的2个重要断裂区。肝细胞癌中检测到bcl-2/JH融合基因，提示bcl-2基因重排在肝细胞癌变过程中可能起一定作用，而并非淋巴瘤的特异性改变。除癌细胞外，癌旁肝细胞中还检测到bcl-2/JH融合基因，说明bcl-2基因重排非肿瘤细胞所特有。
本研究对HBV感染与bcl-2基因重排的关系进行分析，发现HBsAg阳性和HBsAg阴性组bcl-2/JH融合基因检出率差异无显著意义，提示HBV感染与bcl-2基因重排无明显关系，HBV致肝细胞癌变的作用可能不是通过bcl-2基因重排实现的。肝细胞癌变是一个涉及多个癌基因和抑癌基因的复杂病理过程，bcl-2基因重排在肝细胞癌变过程中的作用，有待于进一步探讨。
(收稿：1997-09-07 修回：1998-05-14), 百拇医药