作用血小板源性生长因子基因工程活性肽在大鼠动脉粥样硬化早期中
作者：武湘兵 李进 赵克森
单位：510515 广州，第一军医大学病理生理学教研室(武湘兵、赵克森)，组织胚胎学教研室(李进)
关键词：
中华医学杂志/980929 目前认为，在动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)发病过程中，生长因子起着重要的致病作用。特别是血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF) ，它趋化单核细胞迁移、粘附，促进泡沫细胞、脂质条纹形成，而且还促进平滑肌细胞增殖，胆固醇的合成以及低密度脂蛋白受体表达等作用[1，2]。现已查明，许多细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素1(IL-1)、肿瘤生长因子(TGF)对AS的致病作用都是通过PDGF来实现的[3]。
为了阻断PDGF的致病作用，我们利用激素免疫中和技术，选用PDGF的A、B链与受体结合的共同部位13肽(ANFLVWEIVRKKP)作为小分子抗原，以乙型肝炎核心抗原(HBcAg)为大分子载体，通过基因工程技术与大分子载体蛋白融合，通过表达、纯化，作为免疫原免疫大鼠。观察免疫原在AS大鼠发病中的作用。如能达到阻断或减缓AS发生发展的目的，即为AS的防治提供新的预防措施。
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一、材料与方法
1.免疫原的制备：13肽基因与HBcAg基因融合，经大肠杆菌BL21表达，羟基磷灰石与Sepharose CL-4B纯化，得到融合蛋白纯品。经酶联免疫吸附测定(ELISA)、电镜鉴定符合融合蛋白特性，经大鼠动物实验证实具有PDGF,HBcAg抗原性，符合免疫原要求。
2.实验动物：21只Wistar大鼠，随机分为3组，高脂饲养组，高脂饲养免疫组，正常饲养组。
3.高脂饲料的配制：按文献[4]方法 。
4.组织取材及组织切片的制备：高脂饲养16周后取材，灌注固定后分离出主动脉全长并分成三段：主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉。分别免疫组织化学、石蜡染色。
5.融合蛋白的免疫时间及方法：高脂饲养前1周第1次免疫，融合蛋白(200 μg/只)与等量佐剂混合腹腔注射。第1次免疫后4周、8周进行第2、3次免疫。免疫后取尾血1 ml(不含肝素)，4 ℃保存过夜，离心6000r/min，取血清，测抗体效价。
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6.ELISA检测HBcAg抗体、13肽抗体效价：HBcAg抗体检测见试剂盒说明书(上海科华生物技术有限公司产品)。13肽的合成肽(上海永华细胞和基因高技术分析中心合成)溶于95%乙醇，1 μg/孔，包板，室温下吹干，10%甲醛固定30分钟，10%山羊血清(PBS稀释)封闭30分钟，待测血清，37 ℃1小时，1：300兔抗鼠IgG辣根过氧化物酶结合物(华美公司)，37 ℃30分钟。间苯二胺(OPD)为底物，反应8分钟，2NH2SO4终止，测光密度(A490)。
二、结果
1.免疫原的制备：基因序列分析表明，PDGF 13肽基因与HBcAg基因融合正确；Western Blot结果证实表达后的融合蛋白分子量约为22 000；电镜观察，此融合蛋白可形成大小均一的颗粒蛋白。融合蛋白第1次免疫大鼠后，可分别检测到HBcAg、13肽抗体，第2次加强免疫后2种抗体效价皆有升高，第2次免疫后，2种抗体效价基本稳定，7周后检测仍能检测出较高滴度的抗体。
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2.大鼠高脂饲养后血清总胆固醇含量变化：经过8周、16周高脂饲养，大鼠血清中总胆固醇含量明显增高(见附表)。甘油三酯无变化。
附表 血清总胆固醇含量变化
(mmol/L，
±s) 组别
鼠数
高脂
饲养前
高脂饲
养后8周
高脂饲
养后16周
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正常
对照组
7
1.49
±0.17
1.7
±0.4
1.2
±0.4
高脂
饲养组
7
1.50
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±0.14
12.7
±2.3**
9.9
±3.7**
高脂
免疫组
7
1.58
±0.15
12.9
±4.1**
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14.0
±1.6**
注：与正常对照组及高脂饲养前自身比较，** P<0.001
3.免疫组织化学的图像分析：各实验组大鼠主动脉经免疫组织化学染色后，以Quantimet 520+图像分析仪进行主动脉内膜平均光密度值测定。结果显示，高脂饲养组分别与正常饲养组、融合蛋白免疫组差异有非常显著意义(P<0.001)。免疫组与正常饲养组比较，主动脉弓及腹主动脉内膜，差异有显著意义(P<0.05)，而胸主动脉内膜则无明显差异。在动脉粥样硬化病变的多发部位，主动脉弓处，各组肌层平滑肌细胞PcNA含量的比较，高脂饲养组血管平滑肌细胞PcNA含量与正常组及免疫组差异皆有非常显著意义(P<0.001)，而免疫组与正常组比较，差异无显著意义。
4.各实验组大鼠各部位的病理形态变化：病理切片结果表明，在高脂饲养组中，主动脉病理变化主要有内膜增厚，单核巨噬细胞粘着、附壁增多，泡沫细胞形成，血管平滑肌细胞显著增生、细胞排列紊乱、管壁增厚等病变。而免疫组则病理变化较轻，内膜只有少许水肿样变，无单核巨噬细胞粘附，肌层平滑肌细胞增殖不显著，排列整齐，主动脉各部位的形态与正常对照组相似。
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三、讨论
增殖细胞核抗原亦称周期素(proliferating cell nuclear antigen, PcNA)是一种仅在增殖细胞中合成和表达的36 000多肽，其表达和合成与细胞增殖周期相关，是细胞DNA合成所必需的，PcNA含量增多，表明细胞增殖活跃[5]。
本结果表明，高脂饲养组与免疫组大鼠经过8周的高脂饲养后，血清总胆固醇均有明显增高，与饲养前自身及正常饲养的大鼠相比，差异均有显著性意义(P<0.001)。在免疫组中大鼠经过3次免疫，体内分别产生不同程度的13肽、HBcAg抗体。但抗13肽抗体效价不是很高，推测是血清形成时，血小板释放PDGF，中和血浆里部分13肽抗体，使效价降低的缘故。在高脂饲养组，高脂血症引起大鼠早期的AS病理改变，即单核细胞大量粘附于内皮、泡沫细胞形成及平滑肌细胞大量增殖。但在免疫组，大鼠主动脉内膜、肌层各细胞成分的变化则病变甚轻。免疫组化图像分析结果表明，免疫组大鼠主动脉内膜PcNA含量与高脂饲养组差异有非常显著意义(P<0.001)，有的部位如胸主动脉甚至与正常组无差异。在AS多发部位主动脉弓处，免疫组的血管平滑肌细胞PcNA含量与正常组相近(P>0.05)，而高脂饲养组则大大增加，与前2组相比差异有显著性意义(P<0.001)。提示经免疫的大鼠虽有与高脂饲养组相同的高脂血症，但2组的主动脉血管形态改变却有着显著差别。上述结果表明，活性肽注入大鼠体内后，能明显地抑制平滑肌细胞、内皮细胞增殖，抑制单核细胞粘附及泡沫细胞形成作用，能有效地阻止AS的早期病变的发生，有可能为防治AS的发生、发展提供一条新的途径。参考文献
, 百拇医药
1 Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis an update. N Engl J Med，1986, 314.488-500.
2 Abedi H. Zachary I. Signalling mechanisms in the regulation of vascular cell migration. Cardiovasc Res，1995,30：544-556.
3 Shimokawa H. Ito A. Fukumoto Y. Chronic treatment with interleukin-1 beta induces coronary intimal lesions and vasospastic responses in pigs in vivo. The role of platelet-dorived growth factor. J Clin Invest, 1996，97：769-776.
4 张秋航、扬相林、李玉林，等.大鼠实验性动脉粥样硬化症的病理学研究，白求恩医科大学学报，1986，12：100-103.
5 倪灿荣主编，免疫组织化学实验新技术及应用.北京：北京科学出版社，1993，358-358., http://www.100md.com
单位：510515 广州，第一军医大学病理生理学教研室(武湘兵、赵克森)，组织胚胎学教研室(李进)
关键词：
中华医学杂志/980929 目前认为，在动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)发病过程中，生长因子起着重要的致病作用。特别是血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF) ，它趋化单核细胞迁移、粘附，促进泡沫细胞、脂质条纹形成，而且还促进平滑肌细胞增殖，胆固醇的合成以及低密度脂蛋白受体表达等作用[1，2]。现已查明，许多细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素1(IL-1)、肿瘤生长因子(TGF)对AS的致病作用都是通过PDGF来实现的[3]。
为了阻断PDGF的致病作用，我们利用激素免疫中和技术，选用PDGF的A、B链与受体结合的共同部位13肽(ANFLVWEIVRKKP)作为小分子抗原，以乙型肝炎核心抗原(HBcAg)为大分子载体，通过基因工程技术与大分子载体蛋白融合，通过表达、纯化，作为免疫原免疫大鼠。观察免疫原在AS大鼠发病中的作用。如能达到阻断或减缓AS发生发展的目的，即为AS的防治提供新的预防措施。
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一、材料与方法
1.免疫原的制备：13肽基因与HBcAg基因融合，经大肠杆菌BL21表达，羟基磷灰石与Sepharose CL-4B纯化，得到融合蛋白纯品。经酶联免疫吸附测定(ELISA)、电镜鉴定符合融合蛋白特性，经大鼠动物实验证实具有PDGF,HBcAg抗原性，符合免疫原要求。
2.实验动物：21只Wistar大鼠，随机分为3组，高脂饲养组，高脂饲养免疫组，正常饲养组。
3.高脂饲料的配制：按文献[4]方法 。
4.组织取材及组织切片的制备：高脂饲养16周后取材，灌注固定后分离出主动脉全长并分成三段：主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉。分别免疫组织化学、石蜡染色。
5.融合蛋白的免疫时间及方法：高脂饲养前1周第1次免疫，融合蛋白(200 μg/只)与等量佐剂混合腹腔注射。第1次免疫后4周、8周进行第2、3次免疫。免疫后取尾血1 ml(不含肝素)，4 ℃保存过夜，离心6000r/min，取血清，测抗体效价。
, 百拇医药
6.ELISA检测HBcAg抗体、13肽抗体效价：HBcAg抗体检测见试剂盒说明书(上海科华生物技术有限公司产品)。13肽的合成肽(上海永华细胞和基因高技术分析中心合成)溶于95%乙醇，1 μg/孔，包板，室温下吹干，10%甲醛固定30分钟，10%山羊血清(PBS稀释)封闭30分钟，待测血清，37 ℃1小时，1：300兔抗鼠IgG辣根过氧化物酶结合物(华美公司)，37 ℃30分钟。间苯二胺(OPD)为底物，反应8分钟，2NH2SO4终止，测光密度(A490)。
二、结果
1.免疫原的制备：基因序列分析表明，PDGF 13肽基因与HBcAg基因融合正确；Western Blot结果证实表达后的融合蛋白分子量约为22 000；电镜观察，此融合蛋白可形成大小均一的颗粒蛋白。融合蛋白第1次免疫大鼠后，可分别检测到HBcAg、13肽抗体，第2次加强免疫后2种抗体效价皆有升高，第2次免疫后，2种抗体效价基本稳定，7周后检测仍能检测出较高滴度的抗体。
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2.大鼠高脂饲养后血清总胆固醇含量变化：经过8周、16周高脂饲养，大鼠血清中总胆固醇含量明显增高(见附表)。甘油三酯无变化。
附表 血清总胆固醇含量变化
(mmol/L，
±s) 组别鼠数
高脂
饲养前
高脂饲
养后8周
高脂饲
养后16周
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正常
对照组
7
1.49
±0.17
1.7
±0.4
1.2
±0.4
高脂
饲养组
7
1.50
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±0.14
12.7
±2.3**
9.9
±3.7**
高脂
免疫组
7
1.58
±0.15
12.9
±4.1**
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14.0
±1.6**
注：与正常对照组及高脂饲养前自身比较，** P<0.001
3.免疫组织化学的图像分析：各实验组大鼠主动脉经免疫组织化学染色后，以Quantimet 520+图像分析仪进行主动脉内膜平均光密度值测定。结果显示，高脂饲养组分别与正常饲养组、融合蛋白免疫组差异有非常显著意义(P<0.001)。免疫组与正常饲养组比较，主动脉弓及腹主动脉内膜，差异有显著意义(P<0.05)，而胸主动脉内膜则无明显差异。在动脉粥样硬化病变的多发部位，主动脉弓处，各组肌层平滑肌细胞PcNA含量的比较，高脂饲养组血管平滑肌细胞PcNA含量与正常组及免疫组差异皆有非常显著意义(P<0.001)，而免疫组与正常组比较，差异无显著意义。
4.各实验组大鼠各部位的病理形态变化：病理切片结果表明，在高脂饲养组中，主动脉病理变化主要有内膜增厚，单核巨噬细胞粘着、附壁增多，泡沫细胞形成，血管平滑肌细胞显著增生、细胞排列紊乱、管壁增厚等病变。而免疫组则病理变化较轻，内膜只有少许水肿样变，无单核巨噬细胞粘附，肌层平滑肌细胞增殖不显著，排列整齐，主动脉各部位的形态与正常对照组相似。
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三、讨论
增殖细胞核抗原亦称周期素(proliferating cell nuclear antigen, PcNA)是一种仅在增殖细胞中合成和表达的36 000多肽，其表达和合成与细胞增殖周期相关，是细胞DNA合成所必需的，PcNA含量增多，表明细胞增殖活跃[5]。
本结果表明，高脂饲养组与免疫组大鼠经过8周的高脂饲养后，血清总胆固醇均有明显增高，与饲养前自身及正常饲养的大鼠相比，差异均有显著性意义(P<0.001)。在免疫组中大鼠经过3次免疫，体内分别产生不同程度的13肽、HBcAg抗体。但抗13肽抗体效价不是很高，推测是血清形成时，血小板释放PDGF，中和血浆里部分13肽抗体，使效价降低的缘故。在高脂饲养组，高脂血症引起大鼠早期的AS病理改变，即单核细胞大量粘附于内皮、泡沫细胞形成及平滑肌细胞大量增殖。但在免疫组，大鼠主动脉内膜、肌层各细胞成分的变化则病变甚轻。免疫组化图像分析结果表明，免疫组大鼠主动脉内膜PcNA含量与高脂饲养组差异有非常显著意义(P<0.001)，有的部位如胸主动脉甚至与正常组无差异。在AS多发部位主动脉弓处，免疫组的血管平滑肌细胞PcNA含量与正常组相近(P>0.05)，而高脂饲养组则大大增加，与前2组相比差异有显著性意义(P<0.001)。提示经免疫的大鼠虽有与高脂饲养组相同的高脂血症，但2组的主动脉血管形态改变却有着显著差别。上述结果表明，活性肽注入大鼠体内后，能明显地抑制平滑肌细胞、内皮细胞增殖，抑制单核细胞粘附及泡沫细胞形成作用，能有效地阻止AS的早期病变的发生，有可能为防治AS的发生、发展提供一条新的途径。参考文献
, 百拇医药
1 Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis an update. N Engl J Med，1986, 314.488-500.
2 Abedi H. Zachary I. Signalling mechanisms in the regulation of vascular cell migration. Cardiovasc Res，1995,30：544-556.
3 Shimokawa H. Ito A. Fukumoto Y. Chronic treatment with interleukin-1 beta induces coronary intimal lesions and vasospastic responses in pigs in vivo. The role of platelet-dorived growth factor. J Clin Invest, 1996，97：769-776.
4 张秋航、扬相林、李玉林，等.大鼠实验性动脉粥样硬化症的病理学研究，白求恩医科大学学报，1986，12：100-103.
5 倪灿荣主编，免疫组织化学实验新技术及应用.北京：北京科学出版社，1993，358-358., http://www.100md.com