人B7逆转录病毒基因转移体系的建立及在原代培养肾癌细胞中的表达
作者：郭应禄 邢念增 张智清 俞莉章 刘漓波 朱丽华 李宏伟
单位：100034 北京医科大学第一附属医院泌尿外科、北京医科大学泌尿外科研究所(郭应禄、邢念增、俞莉章、刘漓波、李宏伟)，检验科(朱丽华)；中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室(张智清)
关键词：
中华医学杂志/980928 T淋巴细胞的活化需要双信号刺激，关于T淋巴细胞共刺激信号的分子生物学机制目前尚未完全知晓，可能与抗原呈递细胞(APCs)上的多种分子有关，而其中最引人注意的是B7分子[1]。为探讨B7基因在肾癌治疗中的作用。本实验建立了介导B7基因的逆转录病毒基因转移体系，并将B7基因导入原代培养的肾癌细胞系RC中。
一、材料与方法
1.质粒及细胞：质粒pcDNA3B7由北京医科大学第一临床医学院检验科提供，逆转录病毒载体pLXSN由北京医科大学人民医院中心实验室王申五教授惠赠。包装细胞PA317及NIH3T3细胞由中国预防医学科学院病毒基因工程国家重点实验室提供。
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2.试剂：各种限制性内切酶购自华美生物公司和中国医学科学院基础医学研究所友谊生物公司。脂质体Lipofectine、G418、购自GIBCO BRL公司。抗B7蛋白抗体购自法国Immunotech公司。羊抗鼠FITC抗体购自北京天象人生物技术公司。非放射性DNA标记及检测试剂盒、PCR试剂盒购自西德Boehringer公司。51Cr购自美国Du Pont公司。
3.逆转录病毒表达载体的构建：质粒pcDNA3B7经EcoRⅠ酶消化之后，回收B7基因片段，与已经EcoR Ⅰ酶消化的pLXSN一起经T4 DNA连接酶连接，将B7基因亚克隆到pLXSN载体上，正向重组子记为pLXSNB7。
4.分泌重组逆转录病毒无性繁殖体系的建立：采用脂质体介导的转染技术(参阅产品说明书)。待细胞克隆在选择培养基(含G418 800 μg)中生长到肉眼清楚可见(直径1～2 mm左右)时，将细胞移入96孔板内，长满后再移至24孔板内，最后在培养瓶中扩增培养、传代建株。
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5.重组逆转录病毒的获得及病毒滴度的测定：70%左右成片的基因转染的包装细胞，按5 ml/106个细胞更换培养液后，培养4小时，收取培养液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后于-70 ℃保存。培养上清经聚乙烯二醇浓缩后电镜下观察。病毒滴度的测定方法见文献[2]。
6.PCR及Southern杂交检测B7基因在PA317/pLXSNB7细胞基因组中的整合：细胞染色体DNA的提取参照分子克隆指南。扩增的5′端引物：5′ATGAATTCATGGGTCTTTCTCACTTCTGTTCAG 3′：3′端引物：5′ATGGATCCGTTAGTTATCAGGAAAATGCTC 3′。取10 μl PCR产物在13%琼脂糖凝胶电泳，鉴定并照相。Digoxin标记B7 cDNA探针及Southern杂交方法参照文献[2]。
7.原代肾癌细胞的培养及转B7基因RC细胞的制备：原代肾癌细胞RC的培养方法参照文献[3]。
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8.间接免疫荧光法检测转基因肿瘤细胞表面B7抗原：消化、收集转基因肿瘤细胞，用pH值为7.4的PBS液洗3遍，溶于100 μlPBS制备细胞悬液，加20 μl鼠抗人B7单抗(pH7.4 PBS 1∶30稀释)，4 ℃30分钟(每10分钟振摇1次)，PBS洗3遍，1 000r/min 10分钟；再用PBS 100 μl悬细胞，加荧光标记的羊抗鼠IgG抗体10 μl，4 ℃30分钟(10分钟振摇1次)；PBS液洗3遍后用1 ml PBS悬细胞，滴片，在荧光显微镜下观察。
9.特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤实验：采用51Cr释放法[4]。CTL活性如下式计算：
杀伤活性(%)=
(实验孔-自然释放孔(cpm))/(最大释放孔-自然释放孔(cpm))×100%
二、结果
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1.分泌重组逆转录病毒无性繁殖细胞系的建立：重组逆转录病毒载体pLXSN/B7及空载体pLXSN在脂质体的辅助下导入包装细胞PA317，经G418筛选2周得到阳性克隆，挑选阳性克隆扩增培养，命名为PA317/pLXSNB7及PA317/pLXSN。其重组逆转录病毒的滴度为(3×105～1×106) cfu/ml。细胞培养上清经PEG浓缩后电镜观察，可见明显的病毒颗粒。
2.PCR及Southern杂交检测：B7基因在PA317/pLXSNB 7细胞基因组中的整合，根据所设计引物，阳性PCR反应扩增出672 bp特异性片段，经Southern杂交证实是B7基因片段。从而说明B7基因已整合到PA317/pLXSNB7细胞基因组中。
3.间接免疫荧光检测B7分子在肾癌细胞表面的表达：用两种逆录病毒感染RC细胞，分别得到B7-RC、K-RC。采用间接免疫荧光法检测，大约有10%的B7-RC细胞有B7分子的表达，而对照组细胞无B7分子的表达。
, 百拇医药
4.转基因肾癌细胞诱导的CTLs毒性实验：取病人外周血，分离T淋巴细胞，在体外培养6天后，作细胞毒性试验。结果表明，B7-RC所诱导的自体CTLs杀伤能力最强，而CTLs对K-RC及RC细胞的杀伤率无明显差异。
三、讨论
现代免疫学已经证明肿瘤免疫以细胞免疫为主，而近年来的研究发现，T淋巴细胞的活化需要双信号刺激。Linsley等首先证实了T淋巴细胞上CD28分子是B7分子的配体，CD28与B7的相互作用能促进T淋巴细胞的增殖。虽然实验证明CTLA-4也是B7的配体，但CTLA-4与CD28对淋巴细胞具有不同的影响，CTLA-4对T淋巴细胞为负性刺激，而CD28则为正性刺激。
Wang等[4]报告，将B7基因转人转入人肾癌细胞系后，能使自体肿瘤特异性T淋巴细胞明显增殖，且使其杀伤活性大为增强；对异体CTLs则无明显刺激作用。
, 百拇医药
Jaffee等[3]报告其肾癌原代培养的成功率高达90%以上，目的基因通过逆转录病毒载体导入系统，不经筛选即可使70%的肾癌细胞获得阳性表达。我们建立的逆转录病毒载体导入系统，也能直接将B7基因导入肾癌细胞系及肾癌原代培养的细胞中，并能达到B7分子的表达。而且，转基因原代培养的肾癌细胞能够使自体的CTLs杀伤活性增强，说明逆转录病毒介导的转B7基因治疗肾癌是有希望的。然而，本逆转录病毒导入系统只能使大约10%的肿瘤细胞表达B7分子，说明其转染效率较低，可能是由于重组病毒滴度没有达到足够的高滴度所致。
然而，尽管肿瘤细胞中表达B7分子的细胞所占的比例较少，但通过CTLs杀伤实验证明这种转基因的肿瘤细胞能够诱导一定的抗肿瘤免疫反应，说明B7-CD28之间的相互作用，为T淋巴细胞的活化提供了共刺激信号。本实验为转B7基因治疗肾癌走向临床奠定了实验基础。
参考文献
, 百拇医药 1 Mueller D L, Jenkins MK, Schwartz R H. Clonal expansion versus functional clonal inactivation: A costimulatory signalling pathway determines the outcome of T cell antigen receptor occupancy. Ann Rev Immunol, 1989, 7：445-480.
2 陈庆华，张智清，宋永胜，等.用逆转录病毒载体表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子.病毒学报，1995，11：138-142.
3 Jaffee EM, Dranoff G, Cohen LK, et al. High efficiency gene transfer into primary human tumor explants without cell selection. Cancer Res, 1993, 53：2221-2226.
4 Wang YC, Zhu LH, McHugh R, et al. Induction of autologous tumor-specific cytotoxic T-lymphocyte activity against a human renal carcinoma cell line by B7-1 (CD80) costimulation. J Immunotherapy, 1996, 19：1-8., http://www.100md.com
单位：100034 北京医科大学第一附属医院泌尿外科、北京医科大学泌尿外科研究所(郭应禄、邢念增、俞莉章、刘漓波、李宏伟)，检验科(朱丽华)；中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室(张智清)
关键词：
中华医学杂志/980928 T淋巴细胞的活化需要双信号刺激，关于T淋巴细胞共刺激信号的分子生物学机制目前尚未完全知晓，可能与抗原呈递细胞(APCs)上的多种分子有关，而其中最引人注意的是B7分子[1]。为探讨B7基因在肾癌治疗中的作用。本实验建立了介导B7基因的逆转录病毒基因转移体系，并将B7基因导入原代培养的肾癌细胞系RC中。
一、材料与方法
1.质粒及细胞：质粒pcDNA3B7由北京医科大学第一临床医学院检验科提供，逆转录病毒载体pLXSN由北京医科大学人民医院中心实验室王申五教授惠赠。包装细胞PA317及NIH3T3细胞由中国预防医学科学院病毒基因工程国家重点实验室提供。
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2.试剂：各种限制性内切酶购自华美生物公司和中国医学科学院基础医学研究所友谊生物公司。脂质体Lipofectine、G418、购自GIBCO BRL公司。抗B7蛋白抗体购自法国Immunotech公司。羊抗鼠FITC抗体购自北京天象人生物技术公司。非放射性DNA标记及检测试剂盒、PCR试剂盒购自西德Boehringer公司。51Cr购自美国Du Pont公司。
3.逆转录病毒表达载体的构建：质粒pcDNA3B7经EcoRⅠ酶消化之后，回收B7基因片段，与已经EcoR Ⅰ酶消化的pLXSN一起经T4 DNA连接酶连接，将B7基因亚克隆到pLXSN载体上，正向重组子记为pLXSNB7。
4.分泌重组逆转录病毒无性繁殖体系的建立：采用脂质体介导的转染技术(参阅产品说明书)。待细胞克隆在选择培养基(含G418 800 μg)中生长到肉眼清楚可见(直径1～2 mm左右)时，将细胞移入96孔板内，长满后再移至24孔板内，最后在培养瓶中扩增培养、传代建株。
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5.重组逆转录病毒的获得及病毒滴度的测定：70%左右成片的基因转染的包装细胞，按5 ml/106个细胞更换培养液后，培养4小时，收取培养液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后于-70 ℃保存。培养上清经聚乙烯二醇浓缩后电镜下观察。病毒滴度的测定方法见文献[2]。
6.PCR及Southern杂交检测B7基因在PA317/pLXSNB7细胞基因组中的整合：细胞染色体DNA的提取参照分子克隆指南。扩增的5′端引物：5′ATGAATTCATGGGTCTTTCTCACTTCTGTTCAG 3′：3′端引物：5′ATGGATCCGTTAGTTATCAGGAAAATGCTC 3′。取10 μl PCR产物在13%琼脂糖凝胶电泳，鉴定并照相。Digoxin标记B7 cDNA探针及Southern杂交方法参照文献[2]。
7.原代肾癌细胞的培养及转B7基因RC细胞的制备：原代肾癌细胞RC的培养方法参照文献[3]。
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8.间接免疫荧光法检测转基因肿瘤细胞表面B7抗原：消化、收集转基因肿瘤细胞，用pH值为7.4的PBS液洗3遍，溶于100 μlPBS制备细胞悬液，加20 μl鼠抗人B7单抗(pH7.4 PBS 1∶30稀释)，4 ℃30分钟(每10分钟振摇1次)，PBS洗3遍，1 000r/min 10分钟；再用PBS 100 μl悬细胞，加荧光标记的羊抗鼠IgG抗体10 μl，4 ℃30分钟(10分钟振摇1次)；PBS液洗3遍后用1 ml PBS悬细胞，滴片，在荧光显微镜下观察。
9.特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤实验：采用51Cr释放法[4]。CTL活性如下式计算：
杀伤活性(%)=
(实验孔-自然释放孔(cpm))/(最大释放孔-自然释放孔(cpm))×100%
二、结果
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1.分泌重组逆转录病毒无性繁殖细胞系的建立：重组逆转录病毒载体pLXSN/B7及空载体pLXSN在脂质体的辅助下导入包装细胞PA317，经G418筛选2周得到阳性克隆，挑选阳性克隆扩增培养，命名为PA317/pLXSNB7及PA317/pLXSN。其重组逆转录病毒的滴度为(3×105～1×106) cfu/ml。细胞培养上清经PEG浓缩后电镜观察，可见明显的病毒颗粒。
2.PCR及Southern杂交检测：B7基因在PA317/pLXSNB 7细胞基因组中的整合，根据所设计引物，阳性PCR反应扩增出672 bp特异性片段，经Southern杂交证实是B7基因片段。从而说明B7基因已整合到PA317/pLXSNB7细胞基因组中。
3.间接免疫荧光检测B7分子在肾癌细胞表面的表达：用两种逆录病毒感染RC细胞，分别得到B7-RC、K-RC。采用间接免疫荧光法检测，大约有10%的B7-RC细胞有B7分子的表达，而对照组细胞无B7分子的表达。
, 百拇医药
4.转基因肾癌细胞诱导的CTLs毒性实验：取病人外周血，分离T淋巴细胞，在体外培养6天后，作细胞毒性试验。结果表明，B7-RC所诱导的自体CTLs杀伤能力最强，而CTLs对K-RC及RC细胞的杀伤率无明显差异。
三、讨论
现代免疫学已经证明肿瘤免疫以细胞免疫为主，而近年来的研究发现，T淋巴细胞的活化需要双信号刺激。Linsley等首先证实了T淋巴细胞上CD28分子是B7分子的配体，CD28与B7的相互作用能促进T淋巴细胞的增殖。虽然实验证明CTLA-4也是B7的配体，但CTLA-4与CD28对淋巴细胞具有不同的影响，CTLA-4对T淋巴细胞为负性刺激，而CD28则为正性刺激。
Wang等[4]报告，将B7基因转人转入人肾癌细胞系后，能使自体肿瘤特异性T淋巴细胞明显增殖，且使其杀伤活性大为增强；对异体CTLs则无明显刺激作用。
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Jaffee等[3]报告其肾癌原代培养的成功率高达90%以上，目的基因通过逆转录病毒载体导入系统，不经筛选即可使70%的肾癌细胞获得阳性表达。我们建立的逆转录病毒载体导入系统，也能直接将B7基因导入肾癌细胞系及肾癌原代培养的细胞中，并能达到B7分子的表达。而且，转基因原代培养的肾癌细胞能够使自体的CTLs杀伤活性增强，说明逆转录病毒介导的转B7基因治疗肾癌是有希望的。然而，本逆转录病毒导入系统只能使大约10%的肿瘤细胞表达B7分子，说明其转染效率较低，可能是由于重组病毒滴度没有达到足够的高滴度所致。
然而，尽管肿瘤细胞中表达B7分子的细胞所占的比例较少，但通过CTLs杀伤实验证明这种转基因的肿瘤细胞能够诱导一定的抗肿瘤免疫反应，说明B7-CD28之间的相互作用，为T淋巴细胞的活化提供了共刺激信号。本实验为转B7基因治疗肾癌走向临床奠定了实验基础。
参考文献
, 百拇医药 1 Mueller D L, Jenkins MK, Schwartz R H. Clonal expansion versus functional clonal inactivation: A costimulatory signalling pathway determines the outcome of T cell antigen receptor occupancy. Ann Rev Immunol, 1989, 7：445-480.
2 陈庆华，张智清，宋永胜，等.用逆转录病毒载体表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子.病毒学报，1995，11：138-142.
3 Jaffee EM, Dranoff G, Cohen LK, et al. High efficiency gene transfer into primary human tumor explants without cell selection. Cancer Res, 1993, 53：2221-2226.
4 Wang YC, Zhu LH, McHugh R, et al. Induction of autologous tumor-specific cytotoxic T-lymphocyte activity against a human renal carcinoma cell line by B7-1 (CD80) costimulation. J Immunotherapy, 1996, 19：1-8., http://www.100md.com