雌激素及孕激素对大鼠海马GAD67 mRNA和GABA-TmRNA表达水平的影响
作者：王伟 阮旭中 朱长庚
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院神经内科(王伟、阮旭中)，同济医科大学基础医学院(朱长庚)
关键词：
中华医学杂志/980926 海马是中枢神经系统内对癫痫最敏感的脑区和两性激素反应区[1]。为了确定雌激素及孕激素与海马内γ-氨基丁酸(GABA)能神经元是否存在相互作用，探讨二者与癫痫之间的关系，明确雌激素和孕激素的作用位点，我们采用来源于鼠脑的谷氨酸脱羧酶(glutamin acid decarboxylase,GAD) cDNA 和γ-氨基丁酸转氨酶(γ-aminobutyric acid transaminase ，GABA-T) cDNA 探针，用分子杂交方法观察了雌激素及孕激素对大鼠海马GABA能神经元标记酶GAD 以及谷氨酸合成酶GABA-T二者基因表达水平的影响。
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一、材料与方法
1.分组：21只雌性SD大鼠，体重180～220 g。所有实验鼠均于断头前1个月按文献[2]方法行卵巢切除术，术后正常喂养。实验鼠随机分为卵巢切除组(Ⅰ组)；卵巢切除+雌二醇治疗组(Ⅱ组)；卵巢切除+雌二醇+黄体酮治疗组(Ⅲ组)，每组7只实验大鼠。Ⅱ组：实验鼠于断头前2周经腹腔注射雌二醇(1 mg/kg)，每日1剂,共注射14天。Ⅲ组：实验鼠于断头前2周经腹腔注射雌二醇(1mg/kg)、黄体酮(10mg/kg)，每日各1剂，共注射14天。
2.探针的制备：按常规分子生物学方法，GAD67 cDNA、GABA-T cDNA质粒(美国Tillakaratne博士惠赠)，经感受态细菌的制备，质粒的转化、探针质粒的大量制备、EcoRⅠ限制性内切酶消化和32P同位素标记后待用。为了排除实验误差同时制备β-actin cDNA 探针待用。
, http://www.100md.com 3.大鼠脑组织总RNA提取：按常规方法进行各实验鼠于规定时限内迅速断头取脑，取右侧海马按异硫氰酸胍法提取组织RNA。
4.斑点杂交：按常规方法进行，RNA样本经100 ℃变性后，用[32P]dATP 标记的GAD67cDNA、GABA-T cDNA以及β-actin cDNA 探针分别进行斑点杂交。放射性自显影后所得杂交结果在薄层分析仪上600 nm处扫描,得到各斑点扫描图面积。
二、结果
1.各实验组β-actin mRNA表达水平的变化：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各实验组大鼠海马β-actin mRNA表达水平比较结果差异无显著性意义，提示各实验组实验条件均衡一致。
2.雌激素、孕激素对卵巢切除大鼠海马GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平的影响：卵巢切除后28天，经雌二醇治疗14天的大鼠海马GAD67 mRNA表达水平为26 096±10 750，GABA-TmRNA为79 833±14 360，均明显高于卵巢切除未治疗组水平(GAD67 mRNA为8 473±2 094，GABA-TmRNA为17 702±12 044)(P<0.05，P<0.01)。而雌二醇联合黄体酮治疗14天的大鼠海马GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平分别为9 987±2 014和9 549±1 614，均明显低于单纯雌二醇治疗组水平(P均<0.05) 。另外，GAD67 mRNA与GABA-TmRNA表达水平的变化呈一致性趋势，2组数据经统计学相关分析有明显的相关性(r=0.99)。
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三、讨论
研究表明，卵巢激素和海马具有某些一致性的功能，即对学习、记忆、认知功能以及癫痫发作的阈值有明显的调节作用，基于这些研究结果，有人推测海马可能是雌激素和孕激素调节大脑功能以及癫痫发作阈值的作用位点和关键部位[1]。GAD为GABA合成限速酶和特异性的标记酶，GADmRNA转录水平与GAD免疫活性是一致的[3]。尽管GABA-T不是唯一的Glu合成酶，但其活性的高低也可部分反应Glu递质的变化。因此,观察雌激素和孕激素对海马GAD mRNA以及 GABA-TmRNA的影响，不仅可以了解卵巢激素与海马神经元之间的关系，而且还可以从分子生物学水平探讨雌激素和孕激素调节大脑学习、记忆、认知功能以及癫痫发作阈值的作用机制。本实验经雌二醇治疗14天的大鼠海马GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平均明显高于卵巢切除未治疗组水平，而在雌二醇治疗的基础上加用黄体酮则可使上调的GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平明显降至接近卵巢切除未治疗组水平。另外，GAD67 mRNA与GABA-TmRNA表达水平的变化呈一致性趋势，二者的变化有明显的相关性(r=0.99)。本研究结果提示：(1) 雌激素及孕激素与海马内兴奋与抑制性神经元之间存在着相互作用，它们通过调节GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平从而影响海马内兴奋与抑制性神经元功能；(2)雌激素与孕激素对海马GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平的调节作用相反；(3) 海马可能是雌激素和孕激素调节大脑功能以及癫痫发作阈值的关键位点。作为GABA的代谢酶和Glu合成酶的GABA-T，其与GABA合成酶GAD的变化规律保持一致，提示海马中GABA-T与GAD之间，Glu能神经元与GABA能神经元之间可能存在着相互平衡关系。
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尽管本研究发现雌激素、孕激素可引起大鼠海马GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平的变化，但究竟是雌激素、孕激素改变了大脑功能，导致癫痫发作的原因尚待进一步研究证实。Najlerahim[4]等研究发现，慢性癫痫大鼠海马GABA能神经元数目没有改变，但GAD67 mRNA表达水平明显增加，认为该慢性病理过程中GADmRNA的改变为代偿性表达增强。近年研究发现，雌激素不引起海马神经元数目的改变,仅增加细胞树突棘的密度以及突触的形成[5]。为此,结合本结果我们推测，本实验过程中卵巢切除大鼠经雌激素或孕激素治疗后海马GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平的变化可能为代偿性的改变。
参考文献
1 Lee WL, Hablitz JJ. Effect of APV and ketamine on epileptiform activity in the CA1 and CA3 regionsof the hippocampus. Epilepsy Res, 1990, 6：87.
, http://www.100md.com
2 徐淑云，卞如濂，陈修.药物实验方法学，第2版，北京：人民卫生出版社.1994：1293.
3 Benson DL, Huntsman MM, Jones EG. Activity-dependent changes in GAD and preprotachykinin mRNA in visual cortex of adult monkeys. Cereb-Cortex. 1994, 4：40-51.
4 Najlerahim A, Williams SF, Pearson RCA, et al. Increased expression of GAD mRNA during the chronic epileptic syndrome due to intrahippocampal tetanus toxin. Exp Brain Res, 1992, 90：332-342.
5 Gould E, Woolley CS, Frankfurt M, et al. Gonadal steroids regulate dentrtic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. J Neurosci, 1990, 10：1286-1291., 百拇医药
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院神经内科(王伟、阮旭中)，同济医科大学基础医学院(朱长庚)
关键词：
中华医学杂志/980926 海马是中枢神经系统内对癫痫最敏感的脑区和两性激素反应区[1]。为了确定雌激素及孕激素与海马内γ-氨基丁酸(GABA)能神经元是否存在相互作用，探讨二者与癫痫之间的关系，明确雌激素和孕激素的作用位点，我们采用来源于鼠脑的谷氨酸脱羧酶(glutamin acid decarboxylase,GAD) cDNA 和γ-氨基丁酸转氨酶(γ-aminobutyric acid transaminase ，GABA-T) cDNA 探针，用分子杂交方法观察了雌激素及孕激素对大鼠海马GABA能神经元标记酶GAD 以及谷氨酸合成酶GABA-T二者基因表达水平的影响。
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一、材料与方法
1.分组：21只雌性SD大鼠，体重180～220 g。所有实验鼠均于断头前1个月按文献[2]方法行卵巢切除术，术后正常喂养。实验鼠随机分为卵巢切除组(Ⅰ组)；卵巢切除+雌二醇治疗组(Ⅱ组)；卵巢切除+雌二醇+黄体酮治疗组(Ⅲ组)，每组7只实验大鼠。Ⅱ组：实验鼠于断头前2周经腹腔注射雌二醇(1 mg/kg)，每日1剂,共注射14天。Ⅲ组：实验鼠于断头前2周经腹腔注射雌二醇(1mg/kg)、黄体酮(10mg/kg)，每日各1剂，共注射14天。
2.探针的制备：按常规分子生物学方法，GAD67 cDNA、GABA-T cDNA质粒(美国Tillakaratne博士惠赠)，经感受态细菌的制备，质粒的转化、探针质粒的大量制备、EcoRⅠ限制性内切酶消化和32P同位素标记后待用。为了排除实验误差同时制备β-actin cDNA 探针待用。
, http://www.100md.com 3.大鼠脑组织总RNA提取：按常规方法进行各实验鼠于规定时限内迅速断头取脑，取右侧海马按异硫氰酸胍法提取组织RNA。
4.斑点杂交：按常规方法进行，RNA样本经100 ℃变性后，用[32P]dATP 标记的GAD67cDNA、GABA-T cDNA以及β-actin cDNA 探针分别进行斑点杂交。放射性自显影后所得杂交结果在薄层分析仪上600 nm处扫描,得到各斑点扫描图面积。
二、结果
1.各实验组β-actin mRNA表达水平的变化：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各实验组大鼠海马β-actin mRNA表达水平比较结果差异无显著性意义，提示各实验组实验条件均衡一致。
2.雌激素、孕激素对卵巢切除大鼠海马GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平的影响：卵巢切除后28天，经雌二醇治疗14天的大鼠海马GAD67 mRNA表达水平为26 096±10 750，GABA-TmRNA为79 833±14 360，均明显高于卵巢切除未治疗组水平(GAD67 mRNA为8 473±2 094，GABA-TmRNA为17 702±12 044)(P<0.05，P<0.01)。而雌二醇联合黄体酮治疗14天的大鼠海马GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平分别为9 987±2 014和9 549±1 614，均明显低于单纯雌二醇治疗组水平(P均<0.05) 。另外，GAD67 mRNA与GABA-TmRNA表达水平的变化呈一致性趋势，2组数据经统计学相关分析有明显的相关性(r=0.99)。
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三、讨论
研究表明，卵巢激素和海马具有某些一致性的功能，即对学习、记忆、认知功能以及癫痫发作的阈值有明显的调节作用，基于这些研究结果，有人推测海马可能是雌激素和孕激素调节大脑功能以及癫痫发作阈值的作用位点和关键部位[1]。GAD为GABA合成限速酶和特异性的标记酶，GADmRNA转录水平与GAD免疫活性是一致的[3]。尽管GABA-T不是唯一的Glu合成酶，但其活性的高低也可部分反应Glu递质的变化。因此,观察雌激素和孕激素对海马GAD mRNA以及 GABA-TmRNA的影响，不仅可以了解卵巢激素与海马神经元之间的关系，而且还可以从分子生物学水平探讨雌激素和孕激素调节大脑学习、记忆、认知功能以及癫痫发作阈值的作用机制。本实验经雌二醇治疗14天的大鼠海马GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平均明显高于卵巢切除未治疗组水平，而在雌二醇治疗的基础上加用黄体酮则可使上调的GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平明显降至接近卵巢切除未治疗组水平。另外，GAD67 mRNA与GABA-TmRNA表达水平的变化呈一致性趋势，二者的变化有明显的相关性(r=0.99)。本研究结果提示：(1) 雌激素及孕激素与海马内兴奋与抑制性神经元之间存在着相互作用，它们通过调节GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平从而影响海马内兴奋与抑制性神经元功能；(2)雌激素与孕激素对海马GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平的调节作用相反；(3) 海马可能是雌激素和孕激素调节大脑功能以及癫痫发作阈值的关键位点。作为GABA的代谢酶和Glu合成酶的GABA-T，其与GABA合成酶GAD的变化规律保持一致，提示海马中GABA-T与GAD之间，Glu能神经元与GABA能神经元之间可能存在着相互平衡关系。
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尽管本研究发现雌激素、孕激素可引起大鼠海马GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平的变化，但究竟是雌激素、孕激素改变了大脑功能，导致癫痫发作的原因尚待进一步研究证实。Najlerahim[4]等研究发现，慢性癫痫大鼠海马GABA能神经元数目没有改变，但GAD67 mRNA表达水平明显增加，认为该慢性病理过程中GADmRNA的改变为代偿性表达增强。近年研究发现，雌激素不引起海马神经元数目的改变,仅增加细胞树突棘的密度以及突触的形成[5]。为此,结合本结果我们推测，本实验过程中卵巢切除大鼠经雌激素或孕激素治疗后海马GAD67 mRNA、GABA-TmRNA表达水平的变化可能为代偿性的改变。
参考文献
1 Lee WL, Hablitz JJ. Effect of APV and ketamine on epileptiform activity in the CA1 and CA3 regionsof the hippocampus. Epilepsy Res, 1990, 6：87.
, http://www.100md.com
2 徐淑云，卞如濂，陈修.药物实验方法学，第2版，北京：人民卫生出版社.1994：1293.
3 Benson DL, Huntsman MM, Jones EG. Activity-dependent changes in GAD and preprotachykinin mRNA in visual cortex of adult monkeys. Cereb-Cortex. 1994, 4：40-51.
4 Najlerahim A, Williams SF, Pearson RCA, et al. Increased expression of GAD mRNA during the chronic epileptic syndrome due to intrahippocampal tetanus toxin. Exp Brain Res, 1992, 90：332-342.
5 Gould E, Woolley CS, Frankfurt M, et al. Gonadal steroids regulate dentrtic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. J Neurosci, 1990, 10：1286-1291., 百拇医药