缺血-再灌流致骨骼肌内源性碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达
作者：付小兵 杨银辉 王亚平 孙同柱 蒋礼先 盛志勇
单位：100037 北京，中国人民解放军第三○四医院、全军烧伤研究所
关键词：缺血-再灌流损伤；原位杂交；聚合酶链反应
中华医学杂志/980921 【摘要】 目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA在正常、缺血以及缺血和再灌流骨骼肌中的表达。方法 利用大鼠后肢缺血-再灌流损伤模型,采用原位杂交方法与定量PCR技术,观察bFGF mRNA在正常与创伤骨骼肌的定位特征与表达量的改变。结果 在未缺血骨骼肌,bFGF mRNA染色为棕黑色,呈点状或点片状弥散分布于胞浆中,其阳性表达率为82%。在缺血以及缺血与再灌流损伤的骨骼肌,bFGF mRNA的分布方式没有改变,但其染色强度与密度却明显减弱,肌纤维bFGF mRNA阳性染色率分别为52%和22%。结论 创伤导致骨骼肌内源性bFGF mRNA表达量减少,进而导致bFGF产生减少,是缺血与再灌流条件下骨骼肌中内源性bFGF含量减少的重要原因之一。
, 百拇医药
Ischemia and reperfusion reduce the mRNA expression of endogenous basic fibroblast growth factor (bFGF) in rat skeletal muscles
Fu Xiaobing, Yang Yinhui, Wang Yaping, et al. 304th Hospital, PLA, Beijing 100037
【Abstract】 Objective To explore the expression of bFGF gene in normal and wounded rat skeletal muscles. Methods In situ hybridization and quantitative PCR methods were used to evaluate the location of basic fibroblast growth factor (bFGF) mRNA and the amount of bFGF mRNA expression in normal, ischemic or ischemic and reperfused rat skeletal muscles. Results According to the intensity of the stain in situ hybridization, four main classes of fibers could be identified: strong, moderate, weak and negative stained fibers. bFGF mRNA was found in the cytoplasm in both normal and wounded muscles; however, the signal intensity was much stronger in normal muscles. In the normal muscles, bFGF mRNA was distributed irregularly and sparsely, and 82% of fibers had positive bFGF mRNA staining, and only 52% and 22% of fibers in ischemic or ischemic and reperfused muscles were positive for bFGF mRNA staining in situ hybridization. The results in quantitative PCR study supported the concept of the reduced bFGF mRNA expression in the wounded muscles. Conclusions The loss of stored bFGF in wounded skeletal muscles as we showed previously is also caused by its increased damage and reduced secretion.
, 百拇医药
【Key words】 Ischemia and reperfusion Quantitative PCR In situ hybridization
(Natl Med J China, 1998, 78：696-698)
成纤维细胞生长因子(FGF)在组织生长、血管生发以及创伤修复中作用的研究已愈来愈受到人们重视[1]。我们以前的研究[2]表明,急性缺血与再灌流损伤将导致骨骼肌内源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)含量的减少。最近，我们利用定量聚合酶链反应(PCR)技术与原位杂交方法，观察到缺血再灌流导致骨骼肌内源性bFGF mRNA表达减少现象，现将结果报道如下。
材料与方法
一、材料
1.动物模型制作与取材：健康雄性Wistar大鼠8只,经腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)后随机分成2组。在缺血与再灌流损伤组(4只),将橡皮止血带置于右后肢膝关节上方维持4小时,其张力以刚好阻断动脉血流为度,然后放松止血带让肢体再灌流24小时。单纯肢体缺血组致伤方法与上述类似,但无再灌流发生。所有动物的左后肢均为同一动物的未缺血组织对照。
, 百拇医药
4小时缺血或24小时再灌流结束后,在深度麻醉下将动物活杀,取部分实验与对照组骨骼肌存入液氮,供PCR研究。另一部分组织经多聚甲醛处理后石蜡包埋,用于原位杂交检测。
2.组织总RNA提取与RT-PCR检测：用总RNA提取试剂盒提取50 mg组织中总RNA,每个标本取2 μg总RNA以oligo(dt)15为引物进行反转录,反转录体系为20 μl,取反转录产物2 μl为模板进行PCR扩增,扩增条件为:94 ℃，1分钟，50 ℃，1分钟,72 ℃ 1分钟，共29个循环,尽可能使PCR扩增产物与循环数及模板量的关系在线性范围内,以便对标本mRNA表达水平进行粗定量。
3.bFGF的原位杂交检测：42 bp寡核苷酸bFGF探针碱基序列为:5′-TCA CTC TCC TTT GAT AGA CAC AAC TCC TCT CTC TTC TGC TTG-3′，由中国科学院微生物研究所合成,用地高辛标记试剂盒(德国B.M.公司)进行标记。将正常,缺血以及缺血再灌流标本分别切成1 cm×1 cm×0.5 cm小块，用4%多聚甲醛固定,PBS冲洗,常规石蜡包埋,切片厚度为5 μm。切片脱蜡后,置于0.01 mol/L PBS-5 mmol/L MgCl2洗片，0.2 mol/L盐酸室温浸泡20分钟,蛋白酶K(1 μg/ml)42 ℃消化25分钟，0.2%甘氨酸终止反应,然后用4%多聚甲醛室温后固定20分钟，梯度乙醇脱水后,42 ℃湿盒杂交20小时。杂交后用2×SSC、0.1×SSC充分漂洗,用Anti-DIG-AP(1∶500)进行检测,NBT/BCIP显色过夜,反应终止后,常规脱水、透明、封片。同时设无探针的空白对照。
, 百拇医药
结果
1.不同病理生理状态下骨骼肌中bFGF mRNA的原位杂交检测：原位杂交检测显示,正常骨骼肌纤维中的bFGF mRNA为棕黑色,呈颗粒状或小点片状散在分布于胞浆中,其分布具有不均一性与局部浓集(即某些局部染色很强)等特点(图1)。尽管严格来讲原位杂交不能作为定量研究,但根据bFGF mRNA在组织中的分布与染色强度,可把肌纤维分为bFGF mRNA强阳性、中度阳性、弱阳性以及阴性4类(附表)
附表 骨骼肌纤维bFGF mRNA阳性染色比较 组别
相对阳性染色密度
强阳性
中度阳性
弱阳性
阴性
, 百拇医药
非缺血组
29/100
41/100
12/100
18/100
缺血组
2/100
30/100
20/100
48/100
缺血+再灌流组
0/100
11/100
, 百拇医药
11/100
78/100
注：随机选择每组动物标本，在镜下各观察10个视野，共计数100个纤维细胞，根据bFGF mRNA染色强度进行计数
图1 原位杂交检测bFGF mRNA在未缺血骨骼肌组织中的表达 图2 原位杂交检测bFGF mRNA在缺血骨骼肌中的定位和含量改变 图3 原位杂交检测bFGF mRNA.缺血再灌流导致组织内源性bFGF mRNA含量明显减少
在缺血和缺血与再灌流组织,bFGF mRNA的分布模式与正常组织类似,但染色密度却显著减弱(图2，3)。在这些肌纤维,bFGF mRNA染色稀疏,不规则,许多纤维已无bFGF mRNA的阳性表达。经检测,在缺血或缺血与再灌流组织,肌纤维bFGF mRNA阳性染色率分别为52%和22%。
, 百拇医药
2.不同病理生理状态下骨骼肌中bFGF mRNA的定量PCR检测：利用定量PCR方法,在相同mRNA模板量,相同反应条件下观察bFGF mRNA在正常、缺血以及缺血与再灌流骨骼肌的变化,并根据电泳带的宽度与强弱来判定反应结果。结果表明,正常骨骼肌中bFGF mRNA表达量最高,缺血骨骼肌次之,而缺血再灌流组织则明显减少(图4)。
图4 定量PCR检测正常(b,d)，缺血(a)和缺血-再灌流(c)骨骼肌中bFGF mRNA表达.bFGF mRNA表达量在缺血骨骼肌中减少，在缺血-再灌流骨骼肌中明显减少讨论
正常情况下,bFGF经骨骼肌纤维产生后,常以自分泌方式移出胞外,经与肝素结合后储存于肌纤维内膜[3]。对成熟的骨骼肌而言,胞外bFGF主要以储存形式存在,并无直接的生物学效应。而在某些疾病与创伤条件下,如营养障碍鼠的一定生长阶段或创伤修复过程中,储存的bFGF将被释放而发挥作用[2，3]。一般来讲,组织中bFGF含量本身主要取决于其产生与破坏(消耗)之间的平衡,特别是其mRNA模板量的多少对bFGF的产生有重要影响。尽管有研究表明,在脑创伤条件下bFGF mRNA表达量增加[4],但我们自己的研究却表明，缺血导致骨骼肌内源性bFGF含量减少,并初步证明这种减少主要来自于氧自由基破坏以及淋巴细胞肝素溶解酶等对bFGF的灭活,还设想可能与bFGF的产生减少有关[2，5]。
, 百拇医药
在本研究中,我们采用定量PCR技术与原位杂交方法,发现缺血再灌流可直接导致bFGF mRNA的破坏,进而从基因水平进一步证实我们以前的设想,即急性创伤后组织内源性bFGF含量的减少除破坏增加外,也来源于合成分泌减少。但其机制尚未完全明确,推测有以下方面:
1.在缺血再灌流条件下细胞发生损伤,使胞浆与胞外基质间的交流增加,其结果一方面导致胞浆内环境的改变，使bFGF mRNA发生破坏或失活,另一方面基质蛋白酶释放进入胞内,将直接导致bFGF mRNA的破坏。
2.是细胞的凋亡或坏死,使得整个细胞从bFGF本身到其mRNA均遭破坏,这一点可以从我们原位杂交的检测反应出来。
3.是否还存在bFGF碱基序列的改变值得进一步研究。
组织内源性bFGF产生减少与破坏增加将对机体产生严重不利影响。由于组织胚胎发生需要bFGF的参与,同时创伤修复中也需要bFGF的作用,因此,我们认为创伤后内源性bFGFmRNA的破坏,由此导致bFGF含量的减少可能是某些疾病与创伤条件下伤口愈合延迟的正真原因之一,同时也为外源性应用bFGF促进创伤愈合提供了更加直接的证据[6]。
, 百拇医药
参考文献
1 付小兵主编.生长因子与创伤修复.北京：人民军医出版社，1991.86-100.
2 Fu XB、Cuevas P、Gimenez-Gallego G, et al. Ischemia and reperfusion reduced the endogenous basic fibroblast growth factor in rat skeletal muscles: An immunohistochemical study. Wound Rep Reg, 1996, 4：381-385.
3 DiMario J, Buffinger N, Yamada S, et al. Fibroblast growth factor is in the extracellular matrix of dystrophic (mdx) mouse muscle. Science, 1989, 244：688-690.
, 百拇医药
4 Iwata A, Masago A, Yamada K, et al. Expression of basic fibroblast growth factor mRNA after transient local ischemia: comparison with expression of c-fos, c-jun, and hsp70 mRNA. J Neurotrauma, 1997, 14：201-210.
5 Naparstek Y, Cohen IR, Fuks Z, et al. Activated T lymphocytes produce a matrix-degrading heparan sulphate endoglycosidase. Nature, 1984, 310：241-244.
6 付小兵，王亚平，常国友，等.碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)加速猪背部创伤修复的实验研究.中华创伤杂志，1995，11：134-136.
(收稿：1997-09-30 修回：1998-05-18), 百拇医药
单位：100037 北京，中国人民解放军第三○四医院、全军烧伤研究所
关键词：缺血-再灌流损伤；原位杂交；聚合酶链反应
中华医学杂志/980921 【摘要】 目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA在正常、缺血以及缺血和再灌流骨骼肌中的表达。方法 利用大鼠后肢缺血-再灌流损伤模型,采用原位杂交方法与定量PCR技术,观察bFGF mRNA在正常与创伤骨骼肌的定位特征与表达量的改变。结果 在未缺血骨骼肌,bFGF mRNA染色为棕黑色,呈点状或点片状弥散分布于胞浆中,其阳性表达率为82%。在缺血以及缺血与再灌流损伤的骨骼肌,bFGF mRNA的分布方式没有改变,但其染色强度与密度却明显减弱,肌纤维bFGF mRNA阳性染色率分别为52%和22%。结论 创伤导致骨骼肌内源性bFGF mRNA表达量减少,进而导致bFGF产生减少,是缺血与再灌流条件下骨骼肌中内源性bFGF含量减少的重要原因之一。
, 百拇医药
Ischemia and reperfusion reduce the mRNA expression of endogenous basic fibroblast growth factor (bFGF) in rat skeletal muscles
Fu Xiaobing, Yang Yinhui, Wang Yaping, et al. 304th Hospital, PLA, Beijing 100037
【Abstract】 Objective To explore the expression of bFGF gene in normal and wounded rat skeletal muscles. Methods In situ hybridization and quantitative PCR methods were used to evaluate the location of basic fibroblast growth factor (bFGF) mRNA and the amount of bFGF mRNA expression in normal, ischemic or ischemic and reperfused rat skeletal muscles. Results According to the intensity of the stain in situ hybridization, four main classes of fibers could be identified: strong, moderate, weak and negative stained fibers. bFGF mRNA was found in the cytoplasm in both normal and wounded muscles; however, the signal intensity was much stronger in normal muscles. In the normal muscles, bFGF mRNA was distributed irregularly and sparsely, and 82% of fibers had positive bFGF mRNA staining, and only 52% and 22% of fibers in ischemic or ischemic and reperfused muscles were positive for bFGF mRNA staining in situ hybridization. The results in quantitative PCR study supported the concept of the reduced bFGF mRNA expression in the wounded muscles. Conclusions The loss of stored bFGF in wounded skeletal muscles as we showed previously is also caused by its increased damage and reduced secretion.
, 百拇医药
【Key words】 Ischemia and reperfusion Quantitative PCR In situ hybridization
(Natl Med J China, 1998, 78：696-698)
成纤维细胞生长因子(FGF)在组织生长、血管生发以及创伤修复中作用的研究已愈来愈受到人们重视[1]。我们以前的研究[2]表明,急性缺血与再灌流损伤将导致骨骼肌内源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)含量的减少。最近，我们利用定量聚合酶链反应(PCR)技术与原位杂交方法，观察到缺血再灌流导致骨骼肌内源性bFGF mRNA表达减少现象，现将结果报道如下。
材料与方法
一、材料
1.动物模型制作与取材：健康雄性Wistar大鼠8只,经腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)后随机分成2组。在缺血与再灌流损伤组(4只),将橡皮止血带置于右后肢膝关节上方维持4小时,其张力以刚好阻断动脉血流为度,然后放松止血带让肢体再灌流24小时。单纯肢体缺血组致伤方法与上述类似,但无再灌流发生。所有动物的左后肢均为同一动物的未缺血组织对照。
, 百拇医药
4小时缺血或24小时再灌流结束后,在深度麻醉下将动物活杀,取部分实验与对照组骨骼肌存入液氮,供PCR研究。另一部分组织经多聚甲醛处理后石蜡包埋,用于原位杂交检测。
2.组织总RNA提取与RT-PCR检测：用总RNA提取试剂盒提取50 mg组织中总RNA,每个标本取2 μg总RNA以oligo(dt)15为引物进行反转录,反转录体系为20 μl,取反转录产物2 μl为模板进行PCR扩增,扩增条件为:94 ℃，1分钟，50 ℃，1分钟,72 ℃ 1分钟，共29个循环,尽可能使PCR扩增产物与循环数及模板量的关系在线性范围内,以便对标本mRNA表达水平进行粗定量。
3.bFGF的原位杂交检测：42 bp寡核苷酸bFGF探针碱基序列为:5′-TCA CTC TCC TTT GAT AGA CAC AAC TCC TCT CTC TTC TGC TTG-3′，由中国科学院微生物研究所合成,用地高辛标记试剂盒(德国B.M.公司)进行标记。将正常,缺血以及缺血再灌流标本分别切成1 cm×1 cm×0.5 cm小块，用4%多聚甲醛固定,PBS冲洗,常规石蜡包埋,切片厚度为5 μm。切片脱蜡后,置于0.01 mol/L PBS-5 mmol/L MgCl2洗片，0.2 mol/L盐酸室温浸泡20分钟,蛋白酶K(1 μg/ml)42 ℃消化25分钟，0.2%甘氨酸终止反应,然后用4%多聚甲醛室温后固定20分钟，梯度乙醇脱水后,42 ℃湿盒杂交20小时。杂交后用2×SSC、0.1×SSC充分漂洗,用Anti-DIG-AP(1∶500)进行检测,NBT/BCIP显色过夜,反应终止后,常规脱水、透明、封片。同时设无探针的空白对照。
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结果
1.不同病理生理状态下骨骼肌中bFGF mRNA的原位杂交检测：原位杂交检测显示,正常骨骼肌纤维中的bFGF mRNA为棕黑色,呈颗粒状或小点片状散在分布于胞浆中,其分布具有不均一性与局部浓集(即某些局部染色很强)等特点(图1)。尽管严格来讲原位杂交不能作为定量研究,但根据bFGF mRNA在组织中的分布与染色强度,可把肌纤维分为bFGF mRNA强阳性、中度阳性、弱阳性以及阴性4类(附表)
附表 骨骼肌纤维bFGF mRNA阳性染色比较 组别
相对阳性染色密度
强阳性
中度阳性
弱阳性
阴性
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非缺血组
29/100
41/100
12/100
18/100
缺血组
2/100
30/100
20/100
48/100
缺血+再灌流组
0/100
11/100
, 百拇医药
11/100
78/100
注：随机选择每组动物标本，在镜下各观察10个视野，共计数100个纤维细胞，根据bFGF mRNA染色强度进行计数
图1 原位杂交检测bFGF mRNA在未缺血骨骼肌组织中的表达 图2 原位杂交检测bFGF mRNA在缺血骨骼肌中的定位和含量改变 图3 原位杂交检测bFGF mRNA.缺血再灌流导致组织内源性bFGF mRNA含量明显减少
在缺血和缺血与再灌流组织,bFGF mRNA的分布模式与正常组织类似,但染色密度却显著减弱(图2，3)。在这些肌纤维,bFGF mRNA染色稀疏,不规则,许多纤维已无bFGF mRNA的阳性表达。经检测,在缺血或缺血与再灌流组织,肌纤维bFGF mRNA阳性染色率分别为52%和22%。
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2.不同病理生理状态下骨骼肌中bFGF mRNA的定量PCR检测：利用定量PCR方法,在相同mRNA模板量,相同反应条件下观察bFGF mRNA在正常、缺血以及缺血与再灌流骨骼肌的变化,并根据电泳带的宽度与强弱来判定反应结果。结果表明,正常骨骼肌中bFGF mRNA表达量最高,缺血骨骼肌次之,而缺血再灌流组织则明显减少(图4)。
图4 定量PCR检测正常(b,d)，缺血(a)和缺血-再灌流(c)骨骼肌中bFGF mRNA表达.bFGF mRNA表达量在缺血骨骼肌中减少，在缺血-再灌流骨骼肌中明显减少讨论
正常情况下,bFGF经骨骼肌纤维产生后,常以自分泌方式移出胞外,经与肝素结合后储存于肌纤维内膜[3]。对成熟的骨骼肌而言,胞外bFGF主要以储存形式存在,并无直接的生物学效应。而在某些疾病与创伤条件下,如营养障碍鼠的一定生长阶段或创伤修复过程中,储存的bFGF将被释放而发挥作用[2，3]。一般来讲,组织中bFGF含量本身主要取决于其产生与破坏(消耗)之间的平衡,特别是其mRNA模板量的多少对bFGF的产生有重要影响。尽管有研究表明,在脑创伤条件下bFGF mRNA表达量增加[4],但我们自己的研究却表明，缺血导致骨骼肌内源性bFGF含量减少,并初步证明这种减少主要来自于氧自由基破坏以及淋巴细胞肝素溶解酶等对bFGF的灭活,还设想可能与bFGF的产生减少有关[2，5]。
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在本研究中,我们采用定量PCR技术与原位杂交方法,发现缺血再灌流可直接导致bFGF mRNA的破坏,进而从基因水平进一步证实我们以前的设想,即急性创伤后组织内源性bFGF含量的减少除破坏增加外,也来源于合成分泌减少。但其机制尚未完全明确,推测有以下方面:
1.在缺血再灌流条件下细胞发生损伤,使胞浆与胞外基质间的交流增加,其结果一方面导致胞浆内环境的改变，使bFGF mRNA发生破坏或失活,另一方面基质蛋白酶释放进入胞内,将直接导致bFGF mRNA的破坏。
2.是细胞的凋亡或坏死,使得整个细胞从bFGF本身到其mRNA均遭破坏,这一点可以从我们原位杂交的检测反应出来。
3.是否还存在bFGF碱基序列的改变值得进一步研究。
组织内源性bFGF产生减少与破坏增加将对机体产生严重不利影响。由于组织胚胎发生需要bFGF的参与,同时创伤修复中也需要bFGF的作用,因此,我们认为创伤后内源性bFGFmRNA的破坏,由此导致bFGF含量的减少可能是某些疾病与创伤条件下伤口愈合延迟的正真原因之一,同时也为外源性应用bFGF促进创伤愈合提供了更加直接的证据[6]。
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参考文献
1 付小兵主编.生长因子与创伤修复.北京：人民军医出版社，1991.86-100.
2 Fu XB、Cuevas P、Gimenez-Gallego G, et al. Ischemia and reperfusion reduced the endogenous basic fibroblast growth factor in rat skeletal muscles: An immunohistochemical study. Wound Rep Reg, 1996, 4：381-385.
3 DiMario J, Buffinger N, Yamada S, et al. Fibroblast growth factor is in the extracellular matrix of dystrophic (mdx) mouse muscle. Science, 1989, 244：688-690.
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4 Iwata A, Masago A, Yamada K, et al. Expression of basic fibroblast growth factor mRNA after transient local ischemia: comparison with expression of c-fos, c-jun, and hsp70 mRNA. J Neurotrauma, 1997, 14：201-210.
5 Naparstek Y, Cohen IR, Fuks Z, et al. Activated T lymphocytes produce a matrix-degrading heparan sulphate endoglycosidase. Nature, 1984, 310：241-244.
6 付小兵，王亚平，常国友，等.碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)加速猪背部创伤修复的实验研究.中华创伤杂志，1995，11：134-136.
(收稿：1997-09-30 修回：1998-05-18), 百拇医药