中药抑肝纤和促肝细胞生长素对大鼠免疫性肝纤维化的阻断作用

http://www.100md.com 《世界华人消化杂志》 1998年第9期

     作者：李兵顺¹ 王 继² 甄彦君² 王鑫国² 孙彦辉² 王淑琴¹ 吴中秋²

    单位：

    关键词：肝硬化，实验性/中西医结合疗法；肝细胞生长因子/投药和剂量；黄芪/投药和剂量；丹参/投药和剂量；大鼠，Wistar

    华人消化杂志980925Blocking effect of Chinese herbs Yiganxian and PHGF on immuno-damaged hepatic fibrosis in rats

    LI Bing-Shun¹, WANG Ji², ZHEN Yan-Jun², WANG Xin-Guo², SUN Yan-Hui², WANG Shu-Qin¹ and WU Zhong-Qiu<sup>2

    1</sup>Department of Infectious Diseases, the Third Hospital

    ²Department of Acupunture, Traditional Chinese Medical College, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China

    Subject headings liver cirrhosis, experimental/therapy; hepatocyte growth factor/administration and dosage; Astragalus Membranaceus/administration and dosage; Salvia Miltiorrhiza/administration and dosage; rats, Wistar

    Abstract

    AIM To study the blocking effects of traditional Chinese herbs Yiganxian and promoting hepatocyte growth factor (PHGF) on immuno-damaged liver fibrosis in rats.

    METHODS Treatment groups with various doses (including dried medicinal herbs (1.2?kg/?L or 2.4?kg/?L) traditional Chinese herbs Yiganxian and PHGF were compared with model group and control group. Serum PCⅢ, HA and LN, pathological changes of hepatic tissues, and results of collagenous fibers and reticular fibers pathological picture of the liver were analyzed.

    RESULTS Serum PCⅢ (μg/?L; in the 1.2?kg/?L group 92.4±25.2 vs 159.6±37.0，P<0.01) HA (μg/?L; 243.7±106.8 vs 481.2±121.1，P<0.01) LN (μg/?L; 88.9±26.4 vs 142.3±54.4，P<0.01) in the treatment group were obviously lower than model group,and close to control group (μg/?L; 91.6±32.6, μg/?L 236.6±121.2, μg/?L; 92.5±23.5). Pathological results under microscope and results of collagenous and reticular fibers pathological picture in the liver were better than model group especially in the group of low-dose traditional Chinese herbs (P<0.01/P<0.05).

    CONCLUSION Early administration of traditional Chinese herbs Yiganxian and PHGF can effectively prevent liver fibrosis in rats.

    中国图书资料分类号 R?575.205

    摘 要

    目的 用人血清清蛋白免疫损伤Wistar大鼠造成肝纤维化模型，观察中药抑肝纤和促肝细胞生长素对大鼠肝纤维化的阻断作用.

    方法 将不同浓度(含生药1.2?kg/?L或2.4?kg/?L两种)中药抑肝纤(主要含黄芪，丹参，鳖甲，牡蛎等)和促肝细胞生长素用于治疗组并与模型组和对照组进行对比，综合分析血清肝纤维化指标(PCⅢ，HA，LN)、肝组织病理改变、肝组织胶原纤维和网状纤维病理图象定量分析等结果.

    结果 治疗组血清肝纤维化指标PCⅢ(μg/?L; 1.2?kg/?L组为92.4±25.2 vs 159.6±37.0，P<0.01) HA (μg/?L; 1.2?kg/?L组为243.7±106.8 vs 481.2±121.1，P<0.01) LN (μg/?L; 1.2?kg/?L组为88.9±26.4 vs 142.3±54.4，P<0.01)均低于模型组，接近正常组(三项指标分别为91.6±32.6，236.6±121.2及92.5±23.5)差异有显著性. 光镜下肝组织病理变化，肝组织中胶原纤维和网状纤维病理图象定量分析结果治疗组优于模型组，尤以中药低浓度组更为明显(P<0.01或P<0.05).

    结论 研究结果表明，中药抑肝纤和促肝细胞生长素如能早期应用，可有效地阻断或延缓实验鼠肝纤维化的发生.

    0 引言

    多种病因所致的慢性肝损伤，由于肝细胞的变性坏死，纤维组织增生，最终可发展成肝硬变，因此，肝纤维化是慢性肝炎向肝硬变发展的必经阶段. 目前，人们普遍认为，此阶段是可逆的病理过程^[1，2]. 因此，寻找有效药物，阻断延缓及逆转肝纤维化的发生和发展是急待解决的问题^[3，4]. 我们使用人血清清蛋白造成Wistar大鼠免疫损伤性肝纤维化模型，采用中药抑肝纤和促肝细胞生长素(PHGF)治疗. 从肝纤维化的血清学指标，光镜下肝组织病理形态学改变，肝组织内胶原纤维和网状纤维病理图象定量分析进行综合性对照研究，以探讨抑肝纤和PHGF对实验鼠肝纤维化阻断或延缓作用，从而为临床应用提供可靠的依据.

    1 材料和方法

    1.1 材料 ①实验动物：♂ Wistar大鼠，体重216?g～232?g. 购自北京军区白求恩国际和平医院动物室. ②100?mg/?L人血清清蛋白购自兰州生物制品所. ③佐剂蛋白的制备：羊毛脂加液体石蜡高压灭菌研磨制成不完全弗氏佐剂，再加灭活卡介苗制成完全弗氏佐剂，与清蛋白稀释液配成1∶1浓度的佐剂蛋白. ④中药抑肝纤制备：以黄芪、丹参、鳖甲、牡蛎等药物为主组成，由制剂室统一煎制，按比例制成(低浓度生药1.2?kg/?L和高浓度生药2.4?kg/?L)两种. ⑤PHGF由空军广州医院肝病研究所提供，质量分数20?g/?L.

    1.2 方法

    1.2.1 动物分组与处理 Wistar大鼠随机分组. A组为模型组12只；B组为中药治疗组，其中B₁组为低剂量组12只，B₂组为高剂量组12只；C组为PHGF治疗组12只；D组为正常对照组12只. A组制备过程：免疫诱导阶段：d?1腹股沟部位sc完全性佐剂蛋白1?mL，d?14，d?24，d?34同一部位注射不完全性弗氏佐剂和清蛋白稀释液1?mL. 免疫攻击阶段：清蛋白2.5?g/?L尾静脉注射，2次/?wk. wk?2，wk?3，wk?4每周递增0.5?g/?L，4?wk后达4?g/?L，继续尾静脉注射共10?wk. 初次免疫诱导后治疗组加用抑肝纤和PHGF，B₁，B₂和C组10?mL/?(kg*d)，ig直至实验结束. D组实验步骤同上，等剂量生理盐水ig. 实验结束后各组动物一并摘眼球取血后剖杀摘取肝、脾等脏器，福尔马林固定低温保存待检.

    1.2.2 检测指标 ①血清肝纤维化指标PCⅢ，HA，LN检测：试剂分别由重庆肿瘤所、上海海军医学研究所提供. 河北医科大学三院同位素科专人检测. ②肝组织病理学：常规HE染色由河北医科大学病理室制作. 病理诊断参照第五届全国传染病与寄生虫病制定的诊断依据^[5]. 肝组织特殊染色：胶原纤维采用Masson三重染色，网状纤维采用Gomori银染色法. 分别由中日友好医院和解放军304医院病理科协助完成. ③胶原纤维和网状纤维病理图象定量分析：使用CMIAS-008病理图象分析系统操作，分别测出阳性目标总面积、面密度、积分光密度等指标，由空军总医院病理科协助完成.

    统计学处理 采用方差分析及q检验.

    2 结果

    2.1 血清PCⅢ，HA，LN 治疗组血清3项指标明显低于模型组(P<0.01或<0.05)，与正常组比较差异不显著(P>0.05，表1).

    2.2 肝组织病理形态学观察 可见无论肝小叶结构、 纤维增生状况、肝细胞变性坏死程度及肝细胞增生等方面，治疗组与模型组均有明显差异(表2).

    表1 各组肝纤维化大鼠血清PCⅢ，HA，LN水平

    (μg/?L或ng/?mL,±s) 组别

    n

    PCⅢ(μg/?L)

    HA(ng/?mL)

    LN(ng/?mL)

    A组 (模型组)

    8

    159.6±37.0

    481.2±121.1

    142.3±54.4

    B₁组 (低剂量组)

    10

    92.4±25.2^a

    243.7±106.8^a

    88.9±26.4^a

    B₂组 (高剂量组)

    9

    104.4±36.8^a

    307.9±121.3^a

    105.4±31.7^b

    C组 (PHGF组)

    9

    94.1±27.6^a

    256.5±112.4^a

    95.6±34.4^b

    D组 (正常对照组)

    10

    91.6±32.6

    236.6±121.2

    92.5±23.5

    ^aP<0.01，^bP<0.05，vs A组.

    表2 光镜下各组大鼠肝脏病理形态学变化 组

    别

    肝小叶

    结构

    纤维增生

    纤维间隔

    肝细胞索

    排列

    肝细胞

    变性坏死

    炎细胞

    浸润

    肝细胞

    再生

    A

    组

    大量大小不等

    假小叶生成并

    有再分隔现象

    明显，多在Ⅲ～Ⅳ级

    纤维间隔形成并联

    络成网状

    紊乱部分肝窦

    消失

    中～重

    明显

    伴瘀胆

    偶见

    B₁

    组

    多数正常小叶

    结构清晰，无

    假小叶生成

    少量多在Ⅰ级个别

    Ⅱ级部分汇管区略

    扩大

    清晰或

    基本清晰

    轻～中

    少量

    多见

    B₂

    组

    小叶结构清晰

    或基本清晰

    偶见假小叶

    可见，多在Ⅱ级少数

    Ⅲ级汇管区部分扩大

    基本清晰

    部分紊乱

    轻～中

    可见

    可见

    C

    组

    多数正常小叶

    结构清晰，无

    假小叶

    少量多在Ⅰ～Ⅱ级，部分汇管区稍扩大

    清晰或

    基本清晰

    轻～中

    少量

    明显

    D

    组

    小叶结构清晰

    无

    整齐

    轻

    极少

    偶见

    2.3 胶原与网状纤维病理图象定量分析 治疗组胶原纤维和网状纤维单位目标阳性面积、面密度、积分光密度值与模型组比较有显著性差异(P<0.01或<0.05，表3，4)，与正常组比较无明显差异(P>0.05). 治疗组间无差异(P>0.05).

    表3 各组大鼠肝胶原纤维病理图象分析

    (n=5,±s) 组别

    单位目标面积(μm²/?个)

    面密度(μm²/?μm²)

    积分光密度(A)

    A组

    肝实质 451±148

    汇管区 595±184

    0.089±0.028

    0.861±0.050

    3728±1052

    3902±1730

    B₁组

    肝实质 214±137^a

    汇管区 306±183^a

    0.032±0.024^b

    0.493±0.195^b

    6036±2138^a

    6325±1789^a

    B₂组

    肝实质 235±148^a

    汇管区 354±217

    0.041±0.032^a

    0.503±0.299^a

    5763±2547

    6035±1682

    C组

    肝实质 229±153^a

    汇管区 330±196^a

    0.039±0.029^a

    0.486±0.096^a

    5477±2019^a

    5863±1593^a

    D组

    肝实质 173±116

    汇管区 302±162

    0.025±0.025

    0.339±0.307

    7501±3209

    6733±1293

    ^aP<0.05，^bP<0.01，vs A组.

    表4 各组大鼠肝网状纤维病理图象定量分析

    (n=5,±s) 组别

    单位目标面积(μm²/?个)

    面密度(μm²/?μm²)

    积分光密度(A)

    A组

    肝实质 219±130

    汇管区 641±258

    0.132±0.021

    0.523±0.089

    2285±1014

    4069±1620

    B₁组

    肝实质 48±8^a

    汇管区 264±90^a

    0.094±0.022^a

    0.378±0.066^a

    8834±3210^b

    7015±1843^a

    B₂组

    肝实质 55±10^a

    汇管区 302±78^a

    0.098±0.030

    0.391±0.071^a

    8210±3056^a

    6832±1794^a

    C组

    肝实质 53±10^a

    汇管区 287±91

    0.098±0.031^a

    0.393±0.078^a

    8682±3042^a

    6942±1762^a

    D组

    肝实质 44±11

    汇管区 264±83

    0.091±0.024

    0.362±0.126

    9502±4209

    670±1612

    ^aP<0.05，^bP<0.01，vs A组.3 讨论

    我国为肝炎高发地区，建立有效的免疫性肝损伤动物模型，对于慢性肝损伤发病机制的研究和筛选抗肝纤维化的有效药物具有重要的现实意义. 我们利用Wistar大鼠接受异种人血清清蛋白的免疫诱导和免疫攻击，历时16?wk左右. 模型组病理组织学显示，多数肝脏纤维组织呈现典型或明显增生， 纤维化程度多属Ⅲ～Ⅳ级，多数已完全纤维化. 因此，我们认为使用上述方法制造的动物模型较肝毒性物质所致的肝纤维化模型典型而持久，更接近乙丙型肝炎病毒所致的肝损伤. 纤维组织增生是慢性肝损伤阶段的重要病理特点. 主要表现为胶原蛋白、糖蛋白和其他成分的过度生成即细胞外基质(ECM)的过度沉积. 反应纤维化的血清学指标如PCⅢ，HA，LN的改变已有报道并得到临床的共识^[6，7]. 本结果显示，模型组血清学纤维化指标PCⅢ，HA，LN均较其他组有明显的升高，因此，上述指标的变化与肝组织纤维化程度呈现明显的正相关.

    抗肝纤维化治疗国内外虽陆续有过一些报道，但因种种原因尚未找到十分理想的药物，众多学者仍在进行有益的探索. 近些年来国内学者报道中药为主或中西药物联合应用治疗肝纤维化，动物实验和临床应用均显示出较好的苗头^[8，9]. PHGF为肝细胞刺激生长因子的重要组分，其对受损肝细胞的保护作用、肝细胞的再生作用已被大家广泛认识. 但其抗肝纤维化的确切作用还有待进一步证实. 鉴于慢性肝炎自始至终贯穿着气滞血瘀的病机特点，为进一步发扬我国传统医学的优势，我们检索了部分行之有效的药物，辅以自己的临床经验，施以益气活血、软坚散结为治疗大法，以黄芪益气、辅以润而不腻性气平和的山药；以丹参、赤芍活血；鳖甲、牡蛎、内金软坚散结；郁金行气而组成抑肝纤并将上述两种药物分别用与治疗组，观察其对抗或阻断肝纤维化的确切作用. 研究发现，两种药物使用后治疗组无论在肝纤维化血清学指标、光镜下普通染色及特殊染色肝组织病理变化特点，尤其是肝组织内胶原纤维和网状纤维病理图象分析结果与模型组均形成明显的对照. 血清学结果表明，治疗组血清PCⅢ，HA，LN明显低于模型组接近正常组(P<0.01或P<0.05). 光镜下病理组织学显示，治疗组实验鼠肝脏多数小叶结构清晰或基本清晰，少量纤维组织增生，增生程度多属Ⅰ～Ⅱ级之间，肝细胞索排列清晰或基本清晰，肝细胞变性、坏死多属轻度～中度之间，间质炎细胞少量浸润，并见肝细胞再生. 与模型组病理变化特点有明显的区别.

    为进一步证实各组间的确切差异，我们又将各组间增生的纤维组织进行了量化比较. 正如肝组织纤维病理图象定量分析结果所显示，无论肝实质或是汇管区内各种纤维的单位目标阳性面积、面密度和积分光密度治疗组与模型组均有明显的差异，表明治疗组中胶原纤维和网状纤维含量低于模型组(P<0.01或P<0.05)，尤其在中药低浓度组表现更为突出.

    综合上述结果不难看出，上述药物如能早期使用，可有效地对抗实验鼠肝细胞的坏死，阻断或延缓肝纤维化的发生. 探讨其机制，我们认为有以下可能：①上述药物可有效地保护肝细胞，减轻肝细胞的变性及坏死的程度，有效地稳定实验鼠机体的内环境. ②两种药物均可促进肝细胞的再生，加速肝细胞DNA的合成，有利于肝细胞的恢复. ③有研究认为PHGF可抑制成纤维细胞增殖和分化^[10]. 至于上述药物是否在诱导动物免疫功能改善方面也发挥了积极的作用以及两种药物联合应用后的治疗效果，有待今后做进一步的深入研究.

    4 参考文献

    1 王宝恩，王志富，殷蔚荑，黄受方，李建军. 实验性免疫性肝纤维化模型的研究. 中华医学杂志，1989；69(9)：503-505

    2 申保生，翁孝刚，乔汉臣，卢朝辉，韩清，王伟 et al. 中药甲益肝冲剂预防肝纤维化. 华人消化杂志，1998；6(5)：386-388

    3 杜荔清，唐望先，但自力，张文英，李绍白. 中药肝炎平防治肝纤维化的实验研究. 华人消化杂志，1998；6(1)：21-22

    4 沈礼勇，李定国，陆汉明. 中药治疗肝纤维化的研究. 新消化病学杂志，1997；5(2)：121-124

    5 病毒性肝炎防治方案(试行). 中华传染病杂志，1995；13(4)：241-247

    6 陈峰，蔡卫民. 近3年来肝纤维化血清学诊断与治疗. 新消化病学杂志，1997；5(2)：69-71

    7 杨永平，张世兰，周艳贤，宋喜秀. 病毒性肝炎患者血清Ⅰ、Ⅲ型胶原与透明质酸及病理改变的关系. 中华传染病杂志，1995；13(2)：111-112

    8 刘平，刘成，陈高朝，胡义杨，徐列明，吕萍 et al. 扶正化淤319方治疗慢性乙肝及其对纤维化血清学指标的影响. 中国中西医结合杂志，1996；16(10)：588-592

    9 叶红军，宋维汉，陈敏成，董丽，宋玉芳. 丹参和白细胞介素2防治大鼠免疫性肝纤维化的实验研究. 中华消化杂志，1994；14(5)：266-269

    10 叶红军，金珍婧，秦继红，王丽华. 促肝细胞生长素、IFN及IL-2对成纤维细胞增殖和分泌作用. 临床肝胆病杂志，1996；12(1)：20-22(李兵顺1 王 继2 甄彦君2 王鑫国2 孙彦辉2 王淑琴1 吴中秋2)

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