人反义igf-Ⅱ基因真核表达载体pIGF-ⅡAs的构建*

http://www.100md.com 《世界华人消化杂志》 1998年第9期

     作者：张鸣青¹ 杨冬华¹ 毛积芳² 顾 红² 徐 重¹

    单位：

    关键词：真核细胞/遗传学；基因，结构；基因，免疫球蛋白/遗传学

    华人消化杂志980920

    Construction of pIGF-ⅡAs:a eukaryotic expression vector for antisense human insulin-like growth factor Ⅱ gene^*

    ZHANG Ming-Qing¹, YANG Dong-Hua¹, MAO Ji-Fang², GU Hong² and XU Chong<sup>1

    1</sup>Department of Gastroenterology of Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China

    ²Department of Biochemistry, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

    Subject headings eukaryotic cells/genetics; genes, structural; genes, immunoglobulin/genetics

    Abstract

    AIM To construct a eukaryotic expression vector for antisense human insulin like growth factor Ⅱ (IGF-Ⅱ) gene.

    METHODS A cDNA coding B domain of the human IGF-Ⅱ was synthesized and cloned into pGEM7Zf(+) vector. The IGF-Ⅱ fragment from restriction endonuclease digestion was further inserted into eukaryotic vector pcDNA3 in transdirection.

    RESULTS The sequence of cloned IGF-Ⅱ cDNA was proved to be the same as the designed. The constructed antisense IGF-Ⅱ pcDNA3 was identified to be correct by PCR and dot blotting hybridization.

    CONCLUSION A reliable and forthright method for chemical synthesis of small fragments gene and cloning was provided. A way for construction of pIGF-ⅡAs-A eukaryotic expression vector for antisense human IGF-Ⅱ gene was set up. This study is one of the basic work for IGF-Ⅱ antisense gene therapy for hepatocellular carcinoma.

    摘 要

    目的 人反义igf-Ⅱ基因真核表达载体的构建.

    方法 PC/gene软件分析并设计人IGF-Ⅱ cDNA B区域，化学合成并得到人IGF-Ⅱ cDNA克隆于原核载体pGEM7Zf(+)，将之反向连接到逆转病毒表达载体pcDNA3. 经定向设计，将IGF-Ⅱ反义基因插入真核载体，pcDNA3中.

    结果 经DNA双链测序证明，克隆的人IGF-Ⅱ cDNA序列与设计完全一致，构建所得反义IGF-Ⅱ真核载体pIGF-ⅡAs，经Dot blot, PCR鉴定结果正确.

    结论 为小片断的基因合成与克隆提供了简捷可靠的方法，得到了反义igf-Ⅱ基因真核表达载体，为肝癌的反义基因治疗提供了基础.

    0 引言

    胰岛素样生长因子Ⅱ(insulin like growth factor-Ⅱ， IGF-Ⅱ)是一类具有胰岛素样生长刺激活性及免疫调节的67肽分子，其基因定位于11p15，11号染色体短臂的缺失与重排，可丧失对IGF-Ⅱ 基因的抑制性调控，导致IGF-Ⅱ呈持续性过表达. 肝脏是合成分泌IGF-Ⅱ的主要器官. IGF-ⅡRNA存在于各种组织中，在肝癌、结肠癌等多种肿瘤中IGF-Ⅱ表达增高. 我们既往曾从不同角度、不同水平研究证实，igf-Ⅱ基因的异常激活与肝细胞的持续增殖、生长、分化及恶性转化关系密切，尤其是在不典型增生肝细胞中存在着IGF-Ⅱ及其受体几乎一致性过量表达，从而提示IGF-Ⅱ及其受体可能通过自分泌及旁分泌机制参与肝癌的演变^[1-3]. 为了深入探讨IGF-Ⅱ在肝细胞及肝癌细胞中生物效应及癌变机制，我们在IGF-Ⅱ cDNA片断化学合成与克隆的基础上进行IGF-Ⅱ反义真核表达载体的构建，为下一步基础治疗的研究奠定依据.

    1 材料和方法

    1.1 主要试剂 碱基合成单体全套试剂购自加拿大Sangon, T4 kinase购自Biolabs，T4DNA ligase，限制性内切酶EcoRⅠ,XbaⅠ，载体pGEM7Zf(+)，地高辛标记试剂盒购自Boehringer Mannheim；真核载体pcDNA3由第二军医大学毛积芳教授惠赠；IPTG，x-gal，DH5 α购自华美生物公司；Sequenase version 2.0 DNA 序列测定试剂盒购自US biochemical (USB)；DNA/PCR纯化试剂盒购自上海华顺公司. α-³²PdATP购自北京亚辉公司.

    1.2 方法

    1.2.1 人IGF-Ⅱ cDNA片段的化学合成与纯化 根据igf-Ⅱ已知基因序列^[4]，经PC/gene软件分析和设计6个不同的(图1)24～39聚核苷酸片段，5＇和3＇端分别设计含XbaⅠ，EcoRⅠ酶切位点，以便定向克隆. 在ABI391DNA 合成仪分别合成纯化，片断设计见图2，构建策略见图4. 取F2，F3，F4，F5 4个片段磷酸化：F2，F3，F4，F5各取6μL (50amol/L)，T4 kinase 1μL(10×10⁶U/L), 10×T4 kinase buffer 4μL， ATP 0.5μL(5000amol/L)，双蒸水10.5μL，37℃ 温育1h，70℃×10min，等体积酚、酚：氯仿、氯仿抽提，0.1体积3M NaOAc，2倍体积无水乙醇沉淀，700mL/L乙醇洗涤、晾干，溶于双蒸水10μL中；加F1，F6各5μL(50pmol)，总体积为20μL，90℃×5min，缓慢退火至室温. 退火片段加10×T4 ligase buffer 2μL，T4 ligase (10×10³U/L) 1μL，加水补至体积为20μL，14℃ 12h，70℃×10min，等体积酚：氯仿抽提，0.1体积3M NaOAc, 2倍体积无水乙醇沉淀，700mL/L乙醇洗涤，晾干，溶于双蒸水10μL中. pGEM7Zf(+)双酶切：质粒1μg加EcoRⅠ，XbaⅠ各1μL (10u/L)，反应体积20μL，37℃水浴2h. 酶切片段经低溶点凝胶分离纯化大片段，溶于双蒸水10μL中，测A(OD值). IGF-Ⅱ cDNA质粒构建：双酶切pGEM7Zf(+)大片断与F1～6片断按1mol∶3mol混合，加T4 ligase buffer 4μL， T4 ligase 1μL， 总体积为20μL，14℃水浴12h，所得重组质粒称为pIGF-Ⅱ. pIGF-Ⅱ重组载体转化与筛选：Ecoli DH5α感受态制备^[5]，取pIGF-Ⅱ 10μL加入DH5α感受态200μL，0℃冰浴，30min；42℃ 90s；0℃冰浴，2min；上述溶液加入含1mL LB试管中，37℃，轻摇45min，离心，吸去上清，细菌沉淀用200μL LB重悬，涂于含X-gal, IPTG,AmpLB平皿上，37℃培养16h，进行兰白斑筛选，重组子pIGF-Ⅱ为白色克隆，对照为蓝色克隆. 人IGF-Ⅱ cDNA的序列测定：重组子质粒抽提纯化后，按USB测序试剂盒说明操作.

    F1 5＇ CTAGAGCTTACCGCCCCAGTGAGA 3＇

    F2 5＇ CCCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCG 3＇

    F3 5＇ TCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAG 3＇

    F4 5＇ AGCTCCCCGCCGCACAGGGTCTCACTGGGGCGGTAAGCT 3＇

    F5 5＇ AAGCCGCGGTCCCCACAGACGAACTGGAGGGTGTCCACC 3＇

    F6 5＇ AATTCTGCGGGCCTGCTGAAGTAG 3＇

    图1 化学合成的6个F1～F6单链核苷酸序列

    CTAGAGCTTACCGCCCCAGTGAGACCCTGTGCGGCGGGGA

    TCGAATGGCGGGGTCACTCTGGGACACGCCGCCCCT

    GCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGC

    CGACCACCTGTGGGAGGTCAAGCAGACACCCCTGGCGCCG

    TTCTACTTCAGCAGGCCCGCAG

    AAGATGAAGTCGTCCGGGCGTCTTAA

    图2 化学合成IGF-Ⅱ部分cDNA序列图

    1.2.2 人IGF-Ⅱ反义真核表达载体的构建 构建途径如图5所示. IGF-Ⅱ cDNA片断的纯化^[5]：pIGF-Ⅱ 30μg(30μL)，加EcoRⅠ 2.5μL，XbaⅠ 2.5μL，10×H buffer 5μL， 双蒸水10μL， 37℃水浴3h，电泳小片断割胶，过柱纯化，含目的片断约100mL的琼脂糖块，将之置1.5mL Eppendrof管中，加入S1溶液300μL，50℃，10min，将溶解液注入吸附柱，离心弃液，将450μL W1液加入吸附柱，弃液30μL(双蒸水pH 8.0)加入柱中，高速离心后得到所需目的片断DNA溶于30μL双蒸水中，测A(OD值). pcDNA3质粒酶切纯化，方法同2.3，分离大片断割胶过柱纯化，溶于30μL双蒸水中，测A(OD值). IGF-Ⅱ cDNA片断与pcDNA3双酶切大片断按2mol∶1mol数之比混合后，加T4 ligase连接，方法同①，重组子为pIGF-ⅡAs. pIGF-ⅡAs鉴定，F2片断1μg制备探针按地高辛标记盒操作说明进行，标记毕浓度为20mg/L，取pIGF-ⅡAs质粒100ng作Dot blotting，以pIGF-Ⅱ(测序证实为阳性对照)，pcDNA3，pSVK3,pGEM7Zf(+)为阴性对照， 以样本1，2，3，4，5及pcDNA3，pIGF-Ⅱ,pSVK3点样各100ng于NC膜，紫外线530nm照射10min，核酸固定经预杂交40℃，2h加标记探针杂交过夜，洗膜后，按地高辛显色系统操作说明进行，3h终止显色. 克隆产物的酶切鉴定：pIGF-Ⅱ,pIGF-ⅡAs，pcDNA3,pGEM7Zf(+)质粒各1μg，在20μL反应体积中，加入1μL EcoRⅠ，10×H buffer 2μL， 37℃ 1h后行10g/L琼脂糖凝胶电泳.

    1.2.3 克隆产物的PCR鉴定^[6] pIGF-Ⅱ,pIGF-ⅡAs,pcDNA3,pGEM7Zf(+)质粒DNA各200ng约2μL，4μL dNTP (2mmol)，5μL MgCl₂ (1.5mmol)， 5μL 5×PCR buffer; F1,F6引物各2μL约50pmol，加双蒸水32μL，Taq酶0.6μL加液体石蜡50μL行PCR反应，反应条件：95℃ 5min，94℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 45s×30循环；72℃ 10min，4℃ 2h，产物经PCR离心柱纯化盒纯化，按操作说明进行.

    2 结果

    2.1 IGF-Ⅱ cDNA的合成与克隆 pIGF-Ⅱ经转化大肠杆菌DH5 α后，平皿出现42个白色菌落，46个蓝色菌落，阴性对照均蓝色菌落，DH5α在抗体平皿无菌落. 挑4株白色克隆，经培养，质粒大抽后纯化测序，结果与设计一致(图3).

    2.2 pIGF ⅡAs的重组与克隆 pIGF ⅡAs重组子约300个，取5个克隆抽质粒，斑点杂交均呈阳性信号，对照为阴性信号，结果见图6.

    2.3 克隆产物的PCR克隆产物与鉴定 pIGF-Ⅱ，pIGF ⅡAs，pcDNA3，pGEM7Zf(+)4种质粒以F1，F6引物PCR扩增结果见图7.

    2.4 pIGF-Ⅱ,pIGF ⅡAs,pcDNA3，pGEM7Zf(+)4种质粒(EcoRⅠ)消化后电泳所得片段 分别为3.1kb，5.5kb，5.4kb，3.0kb，4条不同DNA片段如图8所示.

    3 讨论

    我们根据IGF-ⅡmRNA前体确定的IGF-Ⅱ cDNA核苷酸序列及氨基酸一级结构的Bdomain(图1)，缘Bdomain系igf-Ⅱ基因编码序列的5＇端，利于反义RNA治疗，故选择此序列合成基因，F1～F6片断含XbaⅠ,EcoRⅠ，酶切位点，这样设计利于片断合成后定向克隆. igf-Ⅱ分6个片断合成，经PC/gene软件处理，充分考虑退火温度的均衡及二级结构的因素而设计，可避免退火效率低下和错配，通过一次生快速酶促连接反应得到的两端都是无磷酸基的igf-Ⅱ基因片断，与其连接产物的缺口相吻合，转入大肠杆菌DH5α后，获得足够的阳性克隆，如此构建的重组子经测序证实后可进一步用于igf-Ⅱ反义基因的构建，因pcDNA3与PcIGF-ⅡAs质粒片断相差不大，故用Dot blotting证实，结果经PCR同样扩增出106bp片断. 所以我们的设计获得了人IGF-ⅡcDNA反义表达载体. 目前pIGF-ⅡAs转入肝癌细胞，观察其生物学行为的研究正在进行.

    致谢 顾健人院士在反义基因设计予以指导.

    4 参考文献

    1 Yang DH, Liu WW, Gu JR, Liu SL. The expression of the products of IGF-Ⅱ, IGF-Ⅱ receptors and CSF-1 receptors in human primary hepatocellular carcinoma and juxtacancerous liver tissue. J Med Coll PLA, 1993;8(4):368-371

    2 杨冬华，刘为纹，顾健人，万大方，刘尚廉. IGF-Ⅱ,IGF-Ⅱ受体和CSF-1受体/C-fms癌基因产物在肝癌、癌旁肝组织的细胞定位与表达. 中华消化杂志，1993；13(4):189-192

    3 杨冬华，徐重，杨波，顾健人，钱连方，曲淑敏. 不同肝病患者肝细胞中胰岛素样生长因子及其受体的表达. 中华医学杂志，1996；76(1):50-51

    4 Bell GI, Merryweather JP, Sanchez-Pescador R, Stempien MM, Priestley L, Scott J et al. Sequence of a cDNA clone encoding human preproinsulin like growth factor Ⅱ. Nature, 1984;310(5980):775-777

    5 Davis L, Kuchi M, Battey J. Basic methods in molecular biology. 2nd ed. East Norwalk: Appletion and Lange, 1994:15-300

    6 Hugh G, Annette MG. PCR technology. Current innovations. 1st ed, Florida: CRC, 1994:20-30(张鸣青1 杨冬华1 毛积芳2 顾 红2 徐 重1)

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/1998/09/01/33/184.htm