汉族人群载脂蛋白E基因多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病关系的研究
作者：鄢盛恺 周新 林其燧 宋耀虹
单位：100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院检验科(鄢盛恺、林其燧、宋耀虹)；湖北医科大学第二附属医院(周新)
关键词：
中华医学杂志/981026 我们采用热启动聚合酶链反应(PCR)结合限制性酶切分析建立了一种快速灵敏的载脂蛋白E(apoE)基因型研究方法。应用此法，检测了93例冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)患者与113例正常汉族人apoE基因型。分析apoE基因遗传变异是否与CHD发生关联，探讨apoE基因多态性对血脂、脂蛋白和载脂蛋白水平的影响及在CHD发病中的意义。
一、对象与方法
1.对象：CHD组93例，平均年龄62±8岁，符合WHO 1979年CHD诊断标准。对照组113例，其中含与CHD性别、年龄相匹配的人群。平均年龄47±7岁，为无心血管疾病的体检健康者。所有受试者均随机选自湖北地区汉族人群，排除伴有糖尿病或其他诸如肾、肝及甲状腺等疾病者。空腹12～14小时后静脉采血，1管用EDTA抗凝，供提取基因组DNA用；另1管不抗凝，分离血清后，-20℃密封保存。
, 百拇医药
2.方法：(1)DNA分离和apoE基因型测定：100 μl全血采用碘化钠法提取基因组DNA。用一对寡核苷酸引物扩增apoE基因含2个多态位点的基因序列，引物序列如下[1]：P1：5′-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3′，P2：5′-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3′。反应体系终体积为50 μl，包含：200 μmol/L dNTPs，引物P1、P2各30 pmol，100 ml/L DMSO，基因组DNA 0.5～1 μg及10×Buffer 5 μl。反应液经95℃预变性12分钟后，置冰浴。加入2 U Taq DNA聚合酶，将反应管放进已预设70℃的扩增仪(PE 2400型)中。先进行5个循环反应：即94 ℃变性1分钟，72℃引物退火和延伸3分钟。再进行35个下述循环：94℃ 1分钟,65℃ 1分钟,72℃ 1分钟。PCR产物用10 U Hha Ⅰ酶于37℃消化4小时，酶切产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(100V，3～4小时)。再用溴化乙锭染色35分钟，紫外灯下即可观察DNA片段图谱。(2)血脂与脂蛋白分析：血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)采用酶法测定，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)采用选择性沉淀法测定；载脂蛋白(apo) AI 、B采用免疫比浊法测定。
, 百拇医药
3.统计学分析：apoE基因型与等位基因频率用基因计数法计算。研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度及组间基因型与等位基因频率比较用χ2检验。组间血脂水平比较用t检验。不同基因型间血脂均数比较用单因素方差分析(ANOVA)和q检验。当控制性别、年龄后用多元逐步回归与相关分析研究等位基因与血脂相关性，采用SYSTAT软件包协助分析。
二、结果
1.apoE基因型与等位基因频率分布：(表1)。两组人群apoE基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(对照组χ2=1.34，P>0.05；CHD组χ2=4.32，P>0.05) ，具有群体代表性。但两组人群间apoE基因型与等位基因频率差异具有显著性意义，CHD组ε4/3与ε4频率均明显高于对照组。
组别
, 百拇医药
例数
基因型频率
等位基因频率
ε2/2
ε3/2
ε4/2
ε3/3
ε4/3
ε4/4
ε2
ε3
ε4
对照组
, http://www.100md.com
113
0
16.8
1.8
69.0
11.5
0.9
9.3
83.2
7.5
CHD组
93
0
, 百拇医药
14.0
1.1
52.6*
31.2
1.1
7.5
75.3*
17.2**
2.apoE基因多态性与CHD的关系：2组人群临床指标，可见CHD组血清TC、TG、LDL-C和apoB水平明显高于对照组(见表2)，HDL-C明显低于对照组(P<0.01)。两组间apoAI水平差异无显著意义。
应用Woolf公式[2]计算相对风险(RR) 来分析apoE基因多态性与CHD的关联性。关联分析显示apoE ε4等位基因与CHD发生密切关联(RR=2.9624，χ2=10.089，P<0.01)。
, http://www.100md.com
3.apoE基因多态性对血脂、脂蛋白水平的影响：ε3/2、ε3/3、ε4/3基因型组间血清TC、 LDL-C和apoB水平差异有显著性意义，如按由低到高顺序排列，则呈ε3/2<ε3/3<ε4/3趋势。 ε3/2型组TC、 LDL-C和apoB水平最低，ε4/3型组明显高于ε3/2型组(表3)。 ε3/3型组TG含量最低。各型间TG、HDL-C和 apoAI水平差异无显著性意义。ε4/2和ε4/4型因例数太少，未予统计分析。
Spearman相关分析显示，LDL-C与TC、apoB呈显著正相关。ε2等位基因与LDL-C和apoB呈负相关, ε4与 TC、LDL-C和apoB 呈正相关。当控制性别、年龄后进行多元逐步回归分析显示，ε4、ε3等位基因与TC呈正相关，且ε4与LDL-C水平增高相关。而TG、HDL-C和apoAI与apoE等位基因无相关性。
三、讨论
近来相继报道几种应用PCR技术检测apoE基因型的方法[3]。由于apoE基因序列中G+C%含量高，PCR扩增条件不易掌握，常出现扩增产物少且非特异扩增多的现象。应用热启动PCR，可通过减少引物模板错配及引物二聚体形成，从而大大提高扩增反应特异性与产率。此法快速、经济，适合流行病学研究及普通实验室应用。
, http://www.100md.com
表2 CHD组和对照组血脂及脂蛋白水平比较(
±s) 组别
例数
TC
(mmol/L)
TG
(mmol/L)
HDL-C
(mmol/L)
LDL-C
(mmol/L)
apoAI
, http://www.100md.com
(g/L)
apoB
(g/L)
对照组
113
4.2±0.7
1.0±0.4
1.4±0.3
2.5±0.8
1.10±0.12
0.80±0.22
CHD组
, 百拇医药 93
5.5±1.0**
1.7±0.9**
1.1±0.4**
3.5±0.9**
1.06±0.17
0.99±0.27**
注：与对照组比较**P<0.01表3 CHD组不同apoE基因型组血脂及脂蛋白水平比较(±s) 组别
, http://www.100md.com
例数
TC
(mmol/L)
TG
(mmol/L)
HDL-C
(mmol/L)
LDL-C
(mmol/L)
apoAI
(g/L)
apoB
(g/L)
, http://www.100md.com
ε4/3
29
5.9±1.0
2.1±1.4
1.1±0.4
3.8±1.1
1.08±0.18
1.14±0.31
ε3/2
13
5.2±1.0*
1.9±0.9
, http://www.100md.com
1.1±0.4
2.0±0.8**
1.01±0.15
0.83±0.31**
ε3/3
49
5.4±0.9*
1.6±0.8
1.1±0.3
3.4±0.7
1.08±0.17
, 百拇医药
0.95±0.20**
注：与ε4/3型组比较，*P<0.05，**P<0.01
不同种族人群apoE等位基因频率分布具有一定差异性。本研究显示，汉族人群apoE基因型和等位基因频率与日本人群相似，但与高加索人具有显著性差别。湖北地区汉族人群与国内外其他地区汉族人群apoE基因型与等位基因频率基本相似，仅有轻微差别[4]。这些差异性可能与人口结构有关。不同人群间apoE ε4等位基因的差异亦是解释这些人群心血管疾病发生率不同的原因。
临床研究表明，诸如心肌梗死(MI)幸存者、血管造影证明有动脉粥样硬化(AS)患者ε4频率明显高于对照组，与其他基因型相比，ε4/3杂合子与MI早发有关[5]。Van Beckxmeer等[6]研究认为，ε4等位基因是男性早发缺血性心脏病的遗传风险因子，尤其是ε4/4纯合子更与年轻有关。有作者报道，ε4等位基因与女性CHD发生显著相关，当调整传统CHD风险因子与血脂指标后，ε4与不同性别人群冠心病发生均相关[7]。本文结果表明，CHD组ε4/3基因型与ε4等位基因频率均显著高于对照组，关联分析显示，ε4与CHD发生密切关联。结合相关回归分析资料证明，apoE等位基因是影响血脂谱的重要因素，apoE ε4等位基因与血清TC、LDL-C和apoB水平升高有关。本组研究结果证实，apoE基因多态性与汉族人群CHD发生密切相关，其在一定程度下通过与环境及其他遗传因素的复杂作用影响血脂水平。apoE ε4可能是我国汉族人群CHD的一个独立的遗传危险因素。 参考文献
, http://www.100md.com
1 Richard P, Thomas G, de Zulueta MP, et al. Common and rare genotype of human apolipoprotein E determined by specific restriction profiles of polymerase chain reaction-amplified DNA. Clin Chem, 1994, 40:24-29.
2 Woolf B. On estimating the relation between blood group and disease. Ann Hum Genet ,1955,19:251-253.
3 Siest G, Pillot T, Regis-Bailly A, et al. Apolipoprotein E: An important gene and protein to follow in laboratory medicine. Clin Chem ,1995,41:1068-1086.
, http://www.100md.com
4 鄢盛恺，周新，哈黛文.汉族人载脂蛋白E基因多态性对血脂、载脂蛋白和脂蛋白(a)水平的影响.基础医学与临床, 1998,118:48-52.
5 Nieminen MS, Mattila KJ, Aalto-Setala K,et al. Lipoproteins and their genetic variation in subjects with and without angiographically verified coronary artery disease. Arterioscler Thromb ,1992,12:58-69.
6 Van Beckxmeer FM, Mamotte CD. Apolipoprotein E ε4 homozygosity in young men with coronary heart disease. Lancet ,1992,340:879-880.
7 Wilson PW, Myers RH, Larson MG, et al. Apolipoprotein E alleles, dyslipidemia, and coronary heart disease. The Framingham offspring study. JAMA, 1994,272:1666-1671., 百拇医药
单位：100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院检验科(鄢盛恺、林其燧、宋耀虹)；湖北医科大学第二附属医院(周新)
关键词：
中华医学杂志/981026 我们采用热启动聚合酶链反应(PCR)结合限制性酶切分析建立了一种快速灵敏的载脂蛋白E(apoE)基因型研究方法。应用此法，检测了93例冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)患者与113例正常汉族人apoE基因型。分析apoE基因遗传变异是否与CHD发生关联，探讨apoE基因多态性对血脂、脂蛋白和载脂蛋白水平的影响及在CHD发病中的意义。
一、对象与方法
1.对象：CHD组93例，平均年龄62±8岁，符合WHO 1979年CHD诊断标准。对照组113例，其中含与CHD性别、年龄相匹配的人群。平均年龄47±7岁，为无心血管疾病的体检健康者。所有受试者均随机选自湖北地区汉族人群，排除伴有糖尿病或其他诸如肾、肝及甲状腺等疾病者。空腹12～14小时后静脉采血，1管用EDTA抗凝，供提取基因组DNA用；另1管不抗凝，分离血清后，-20℃密封保存。
, 百拇医药
2.方法：(1)DNA分离和apoE基因型测定：100 μl全血采用碘化钠法提取基因组DNA。用一对寡核苷酸引物扩增apoE基因含2个多态位点的基因序列，引物序列如下[1]：P1：5′-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3′，P2：5′-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3′。反应体系终体积为50 μl，包含：200 μmol/L dNTPs，引物P1、P2各30 pmol，100 ml/L DMSO，基因组DNA 0.5～1 μg及10×Buffer 5 μl。反应液经95℃预变性12分钟后，置冰浴。加入2 U Taq DNA聚合酶，将反应管放进已预设70℃的扩增仪(PE 2400型)中。先进行5个循环反应：即94 ℃变性1分钟，72℃引物退火和延伸3分钟。再进行35个下述循环：94℃ 1分钟,65℃ 1分钟,72℃ 1分钟。PCR产物用10 U Hha Ⅰ酶于37℃消化4小时，酶切产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(100V，3～4小时)。再用溴化乙锭染色35分钟，紫外灯下即可观察DNA片段图谱。(2)血脂与脂蛋白分析：血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)采用酶法测定，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)采用选择性沉淀法测定；载脂蛋白(apo) AI 、B采用免疫比浊法测定。
, 百拇医药
3.统计学分析：apoE基因型与等位基因频率用基因计数法计算。研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度及组间基因型与等位基因频率比较用χ2检验。组间血脂水平比较用t检验。不同基因型间血脂均数比较用单因素方差分析(ANOVA)和q检验。当控制性别、年龄后用多元逐步回归与相关分析研究等位基因与血脂相关性，采用SYSTAT软件包协助分析。
二、结果
1.apoE基因型与等位基因频率分布：(表1)。两组人群apoE基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(对照组χ2=1.34，P>0.05；CHD组χ2=4.32，P>0.05) ，具有群体代表性。但两组人群间apoE基因型与等位基因频率差异具有显著性意义，CHD组ε4/3与ε4频率均明显高于对照组。
组别
, 百拇医药
例数
基因型频率
等位基因频率
ε2/2
ε3/2
ε4/2
ε3/3
ε4/3
ε4/4
ε2
ε3
ε4
对照组
, http://www.100md.com
113
0
16.8
1.8
69.0
11.5
0.9
9.3
83.2
7.5
CHD组
93
0
, 百拇医药
14.0
1.1
52.6*
31.2
1.1
7.5
75.3*
17.2**
2.apoE基因多态性与CHD的关系：2组人群临床指标，可见CHD组血清TC、TG、LDL-C和apoB水平明显高于对照组(见表2)，HDL-C明显低于对照组(P<0.01)。两组间apoAI水平差异无显著意义。
应用Woolf公式[2]计算相对风险(RR) 来分析apoE基因多态性与CHD的关联性。关联分析显示apoE ε4等位基因与CHD发生密切关联(RR=2.9624，χ2=10.089，P<0.01)。
, http://www.100md.com
3.apoE基因多态性对血脂、脂蛋白水平的影响：ε3/2、ε3/3、ε4/3基因型组间血清TC、 LDL-C和apoB水平差异有显著性意义，如按由低到高顺序排列，则呈ε3/2<ε3/3<ε4/3趋势。 ε3/2型组TC、 LDL-C和apoB水平最低，ε4/3型组明显高于ε3/2型组(表3)。 ε3/3型组TG含量最低。各型间TG、HDL-C和 apoAI水平差异无显著性意义。ε4/2和ε4/4型因例数太少，未予统计分析。
Spearman相关分析显示，LDL-C与TC、apoB呈显著正相关。ε2等位基因与LDL-C和apoB呈负相关, ε4与 TC、LDL-C和apoB 呈正相关。当控制性别、年龄后进行多元逐步回归分析显示，ε4、ε3等位基因与TC呈正相关，且ε4与LDL-C水平增高相关。而TG、HDL-C和apoAI与apoE等位基因无相关性。
三、讨论
近来相继报道几种应用PCR技术检测apoE基因型的方法[3]。由于apoE基因序列中G+C%含量高，PCR扩增条件不易掌握，常出现扩增产物少且非特异扩增多的现象。应用热启动PCR，可通过减少引物模板错配及引物二聚体形成，从而大大提高扩增反应特异性与产率。此法快速、经济，适合流行病学研究及普通实验室应用。
, http://www.100md.com
表2 CHD组和对照组血脂及脂蛋白水平比较(
±s) 组别例数
TC
(mmol/L)
TG
(mmol/L)
HDL-C
(mmol/L)
LDL-C
(mmol/L)
apoAI
, http://www.100md.com
(g/L)
apoB
(g/L)
对照组
113
4.2±0.7
1.0±0.4
1.4±0.3
2.5±0.8
1.10±0.12
0.80±0.22
CHD组
, 百拇医药 93
5.5±1.0**
1.7±0.9**
1.1±0.4**
3.5±0.9**
1.06±0.17
0.99±0.27**
注：与对照组比较**P<0.01表3 CHD组不同apoE基因型组血脂及脂蛋白水平比较(
±s) 组别, http://www.100md.com
例数
TC
(mmol/L)
TG
(mmol/L)
HDL-C
(mmol/L)
LDL-C
(mmol/L)
apoAI
(g/L)
apoB
(g/L)
, http://www.100md.com
ε4/3
29
5.9±1.0
2.1±1.4
1.1±0.4
3.8±1.1
1.08±0.18
1.14±0.31
ε3/2
13
5.2±1.0*
1.9±0.9
, http://www.100md.com
1.1±0.4
2.0±0.8**
1.01±0.15
0.83±0.31**
ε3/3
49
5.4±0.9*
1.6±0.8
1.1±0.3
3.4±0.7
1.08±0.17
, 百拇医药
0.95±0.20**
注：与ε4/3型组比较，*P<0.05，**P<0.01
不同种族人群apoE等位基因频率分布具有一定差异性。本研究显示，汉族人群apoE基因型和等位基因频率与日本人群相似，但与高加索人具有显著性差别。湖北地区汉族人群与国内外其他地区汉族人群apoE基因型与等位基因频率基本相似，仅有轻微差别[4]。这些差异性可能与人口结构有关。不同人群间apoE ε4等位基因的差异亦是解释这些人群心血管疾病发生率不同的原因。
临床研究表明，诸如心肌梗死(MI)幸存者、血管造影证明有动脉粥样硬化(AS)患者ε4频率明显高于对照组，与其他基因型相比，ε4/3杂合子与MI早发有关[5]。Van Beckxmeer等[6]研究认为，ε4等位基因是男性早发缺血性心脏病的遗传风险因子，尤其是ε4/4纯合子更与年轻有关。有作者报道，ε4等位基因与女性CHD发生显著相关，当调整传统CHD风险因子与血脂指标后，ε4与不同性别人群冠心病发生均相关[7]。本文结果表明，CHD组ε4/3基因型与ε4等位基因频率均显著高于对照组，关联分析显示，ε4与CHD发生密切关联。结合相关回归分析资料证明，apoE等位基因是影响血脂谱的重要因素，apoE ε4等位基因与血清TC、LDL-C和apoB水平升高有关。本组研究结果证实，apoE基因多态性与汉族人群CHD发生密切相关，其在一定程度下通过与环境及其他遗传因素的复杂作用影响血脂水平。apoE ε4可能是我国汉族人群CHD的一个独立的遗传危险因素。 参考文献
, http://www.100md.com
1 Richard P, Thomas G, de Zulueta MP, et al. Common and rare genotype of human apolipoprotein E determined by specific restriction profiles of polymerase chain reaction-amplified DNA. Clin Chem, 1994, 40:24-29.
2 Woolf B. On estimating the relation between blood group and disease. Ann Hum Genet ,1955,19:251-253.
3 Siest G, Pillot T, Regis-Bailly A, et al. Apolipoprotein E: An important gene and protein to follow in laboratory medicine. Clin Chem ,1995,41:1068-1086.
, http://www.100md.com
4 鄢盛恺，周新，哈黛文.汉族人载脂蛋白E基因多态性对血脂、载脂蛋白和脂蛋白(a)水平的影响.基础医学与临床, 1998,118:48-52.
5 Nieminen MS, Mattila KJ, Aalto-Setala K,et al. Lipoproteins and their genetic variation in subjects with and without angiographically verified coronary artery disease. Arterioscler Thromb ,1992,12:58-69.
6 Van Beckxmeer FM, Mamotte CD. Apolipoprotein E ε4 homozygosity in young men with coronary heart disease. Lancet ,1992,340:879-880.
7 Wilson PW, Myers RH, Larson MG, et al. Apolipoprotein E alleles, dyslipidemia, and coronary heart disease. The Framingham offspring study. JAMA, 1994,272:1666-1671., 百拇医药