荧光原位杂交技术在急性淋巴细胞白血病异常染色体检测中的应用
作者：杨科 黄凌燕
单位：100700 北京军区总院血液科
关键词：
中华医学杂志/981024 在急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中，荧光原位杂交(FISH)的应用，可以更容易检测到异常17、18和21号染色体，我们通过对38例ALL染色体检查，对荧光原位杂交及染色体G分带技术进行了比较。
一、对象和方法
1.对象：1993年12月～1995年2月从各医院共收集了38例初治ALL标本，其中女11例，男27例，年龄2～59岁。10例正常标本来自非肿瘤患者。骨髓单个核细胞用Ficoll方法进行分离，用0.075 mol/L KCl低渗液处理后，用甲醇∶冰乙酸(3∶1)反复抽提并固定，-20℃保存。
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2.细胞遗传学：骨髓及外周血经短期培养(37℃，24 h)后，终止于有丝分裂中期，应用G分带技术分析15～20个分裂中期细胞，核型分析根据染色体国际命名法。
3.免疫表型分析：单个核细胞用间接免疫荧光标记，用荧光显微镜观察。所用单克隆抗体包括T、B及髓系细胞表面相关抗原的抗体。
4.荧光原位杂交：将储存于-20℃细胞分别滴于玻璃片上，置于55℃，干烤过夜，再用100 μg/ml RNA酶处理，37℃ 1小时，然后分别用70%、80%和100%冷乙醇脱水，空气中干燥，再用70%甲酰胺70℃水浴中灭活2分钟，2×SSC洗3次，每次4分钟，用冷乙醇脱水。杂交混合液包括15 μl DNA探针及30 μl杂交液，70℃水浴中5分钟，将杂交混合液加在玻璃片上，37℃湿盒中杂交过夜，杂交结束后分别用2×SSC 50%甲酰胺，2×SSC及磷酸盐缓冲液冲洗，每次10分钟，再用荧光标记抗生物素蛋白及抗体37℃作用30分钟，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，最后分别用1 μg/ml碘化丙酊及二脒基苯基吲哚对染色体组及核酸染色。
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5.DNA探针：生物素标记的α-卫星中心着丝粒探针，用于观察17、18和21号染色体组。(Oncor，Gaitherburg，美国)
6.杂交结果观察：利用Olympus荧光显微镜读片，计数500个细胞。χ2检验。
二、结果
1.临床资料分析：38例患者骨髓原幼淋巴细胞数为40%～90%，外周血白细胞数为(2.5～32.9)×109/L，其中12例为L1，21例为L2，5例为L3。免疫分型：12例为T细胞型，8例为前B细胞型，11例为普通型，4例为B细胞型，3例为T、B双表型。
2.细胞遗传学分析：38例ALL患者中32例存在染色体异常，6例正常。14例存在染色体结构异常，18例为多倍体细胞。
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3.FISH技术对正常对照17、18和21染色体的检查结果：10例非血液病患者，染色体核型检查均正常，对17、18和21号染色体荧光原位杂交检查结果，97%、98%及96.5%杂交信号数为2，而三倍体数阳性率均数分别为2.5%、1.7%和2.8%，因此对于ALL患者，异常三倍体信号数大于5.3%、4.1%和6.0%为阳性，(即>
±2s)。
4.17号染色体细胞遗传学及FISH检查结果：常规细胞遗传学染色体G分带技术检查11例存在异常三倍体，异常细胞数40%～90%，FISH检查此异常17号染色体三倍体数为28%～70%，另外在染色体G分带检查正常者还检出了6例存在异常三倍体，异常细胞数为7%～11%。
5.18号染色体G分带技术同FISH检查结果比较：常规染色体G分带技术检查13例存在异常三倍体，异常细胞数为57%～95%，FISH检查此13例异常细胞数为31%～80%。另外在染色体G分带结果正常者中发现9例异常三倍18号染色体，异常细胞数9%～12%。
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6.21号染色体的G分带检查及FISH检查结果：38例进行染色体G分带技术检查患者中，18例21号染色体存在异常三倍体，异常三倍体细胞占分裂期细胞34%～95%，此18例分裂间期细胞FISH检查也发现异常三倍体细胞，阳性率占21%～78%，另外20例染色体G分带检查阴性者，FISH检查仍有部分阳性结果，其中5例存在异常三倍体，异常细胞数为7%～11%。
对存在17、18、21号异常三倍染色体的患者与其外周血白细胞计数、骨髓中原幼淋巴细胞数及免疫表型进行了对比分析，结果未发现有相应关系。
三、讨论
通过对38例ALL患者染色体G分带技术及荧光原位杂交检查，发现FISH技术由于杂交信号重叠，靶DNA未完全灭活，探针杂交不完全等原因，使得部分正常标本出现阳性结果，Baurmann等[1，2]利用不同探针也有不同的假阳性报道，因此FISH异常杂交信号阳性率大于多少才算有意义，如果标准过高，就会将微小残留病灶或早期复发检测为假阴性。标准过低，又会出现假阳性，影响诊断。本实验通过对10例正常骨髓检测，将大于+2s定为阳性结果。从研究结果可以看出，G分带技术对17、18及21号异常三倍体检查结果与FISH结果相同，只是大部分异常细胞数百分率低于G分带技术检测，原因未明。另外，FISH检查还发现了部分G分带技术检查17、18、21染色体正常，FISH检查异常的结果(6/38，9/38，5/38)。这可能由于分带技术至多仅能分析20个左右的细胞分裂相，而FISH计数可以多达500个左右细胞，因而结果更直接、可靠，更适于对复杂核型分析及化疗或骨髓移植后早期，在有核细胞少不适于进行细胞遗传学分析等情况下，FISH方法仍然可以得到有意义的数据。
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由于大部分ALL患者均为异常多倍体细胞，因此单纯依靠个别染色体探针不能完全指导临床或做为观察预后指标[3]。我们选用畸变率较高的17、18、21号染色体做为观察对象，通过FISH检查，17/38(45%)存在有+17，22/38(58%)存在有+18，23/38(61%)存在有+21。高于文献报道结果[4]，这可能由于样本量小，不能代表总体水平，尚需继续观察，也可能由于文献所采用常规细胞遗传学分析，许多阳性结果未被发现。
参考文献
1 Baurmann H, Cherif D, Berger R. Interphase cytogenetics by fluorescent in situ hybridization for characterization of monosomy 7 associated myeloid disorders. Leukemia, 1993,17：365-374.
, 百拇医药
2 Van Lom K, Hagemeijer A, Smit EME, et al. In situ hybridization on giemsa-stained bone marrow and blood smears of patients with hematologic disorders allows detection of cell-lineage-specific cytogenetic abnomalities. Blood, 1993,82：884-888.
3 Lorna M, Secker W. Prognostic and biological importance of chromosome findings in acute lymphoblastic leukemia. Cancer Genet Cytogenet, 1990,49：1-13.
4 Bertil J, Fredrik M, Felix M. Secondary chromosomal abnormalities acute leukemias. Leukemia, 1994,8：953., 百拇医药
单位：100700 北京军区总院血液科
关键词：
中华医学杂志/981024 在急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中，荧光原位杂交(FISH)的应用，可以更容易检测到异常17、18和21号染色体，我们通过对38例ALL染色体检查，对荧光原位杂交及染色体G分带技术进行了比较。
一、对象和方法
1.对象：1993年12月～1995年2月从各医院共收集了38例初治ALL标本，其中女11例，男27例，年龄2～59岁。10例正常标本来自非肿瘤患者。骨髓单个核细胞用Ficoll方法进行分离，用0.075 mol/L KCl低渗液处理后，用甲醇∶冰乙酸(3∶1)反复抽提并固定，-20℃保存。
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2.细胞遗传学：骨髓及外周血经短期培养(37℃，24 h)后，终止于有丝分裂中期，应用G分带技术分析15～20个分裂中期细胞，核型分析根据染色体国际命名法。
3.免疫表型分析：单个核细胞用间接免疫荧光标记，用荧光显微镜观察。所用单克隆抗体包括T、B及髓系细胞表面相关抗原的抗体。
4.荧光原位杂交：将储存于-20℃细胞分别滴于玻璃片上，置于55℃，干烤过夜，再用100 μg/ml RNA酶处理，37℃ 1小时，然后分别用70%、80%和100%冷乙醇脱水，空气中干燥，再用70%甲酰胺70℃水浴中灭活2分钟，2×SSC洗3次，每次4分钟，用冷乙醇脱水。杂交混合液包括15 μl DNA探针及30 μl杂交液，70℃水浴中5分钟，将杂交混合液加在玻璃片上，37℃湿盒中杂交过夜，杂交结束后分别用2×SSC 50%甲酰胺，2×SSC及磷酸盐缓冲液冲洗，每次10分钟，再用荧光标记抗生物素蛋白及抗体37℃作用30分钟，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，最后分别用1 μg/ml碘化丙酊及二脒基苯基吲哚对染色体组及核酸染色。
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5.DNA探针：生物素标记的α-卫星中心着丝粒探针，用于观察17、18和21号染色体组。(Oncor，Gaitherburg，美国)
6.杂交结果观察：利用Olympus荧光显微镜读片，计数500个细胞。χ2检验。
二、结果
1.临床资料分析：38例患者骨髓原幼淋巴细胞数为40%～90%，外周血白细胞数为(2.5～32.9)×109/L，其中12例为L1，21例为L2，5例为L3。免疫分型：12例为T细胞型，8例为前B细胞型，11例为普通型，4例为B细胞型，3例为T、B双表型。
2.细胞遗传学分析：38例ALL患者中32例存在染色体异常，6例正常。14例存在染色体结构异常，18例为多倍体细胞。
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3.FISH技术对正常对照17、18和21染色体的检查结果：10例非血液病患者，染色体核型检查均正常，对17、18和21号染色体荧光原位杂交检查结果，97%、98%及96.5%杂交信号数为2，而三倍体数阳性率均数分别为2.5%、1.7%和2.8%，因此对于ALL患者，异常三倍体信号数大于5.3%、4.1%和6.0%为阳性，(即>
±2s)。4.17号染色体细胞遗传学及FISH检查结果：常规细胞遗传学染色体G分带技术检查11例存在异常三倍体，异常细胞数40%～90%，FISH检查此异常17号染色体三倍体数为28%～70%，另外在染色体G分带检查正常者还检出了6例存在异常三倍体，异常细胞数为7%～11%。
5.18号染色体G分带技术同FISH检查结果比较：常规染色体G分带技术检查13例存在异常三倍体，异常细胞数为57%～95%，FISH检查此13例异常细胞数为31%～80%。另外在染色体G分带结果正常者中发现9例异常三倍18号染色体，异常细胞数9%～12%。
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6.21号染色体的G分带检查及FISH检查结果：38例进行染色体G分带技术检查患者中，18例21号染色体存在异常三倍体，异常三倍体细胞占分裂期细胞34%～95%，此18例分裂间期细胞FISH检查也发现异常三倍体细胞，阳性率占21%～78%，另外20例染色体G分带检查阴性者，FISH检查仍有部分阳性结果，其中5例存在异常三倍体，异常细胞数为7%～11%。
对存在17、18、21号异常三倍染色体的患者与其外周血白细胞计数、骨髓中原幼淋巴细胞数及免疫表型进行了对比分析，结果未发现有相应关系。
三、讨论
通过对38例ALL患者染色体G分带技术及荧光原位杂交检查，发现FISH技术由于杂交信号重叠，靶DNA未完全灭活，探针杂交不完全等原因，使得部分正常标本出现阳性结果，Baurmann等[1，2]利用不同探针也有不同的假阳性报道，因此FISH异常杂交信号阳性率大于多少才算有意义，如果标准过高，就会将微小残留病灶或早期复发检测为假阴性。标准过低，又会出现假阳性，影响诊断。本实验通过对10例正常骨髓检测，将大于
+2s定为阳性结果。从研究结果可以看出，G分带技术对17、18及21号异常三倍体检查结果与FISH结果相同，只是大部分异常细胞数百分率低于G分带技术检测，原因未明。另外，FISH检查还发现了部分G分带技术检查17、18、21染色体正常，FISH检查异常的结果(6/38，9/38，5/38)。这可能由于分带技术至多仅能分析20个左右的细胞分裂相，而FISH计数可以多达500个左右细胞，因而结果更直接、可靠，更适于对复杂核型分析及化疗或骨髓移植后早期，在有核细胞少不适于进行细胞遗传学分析等情况下，FISH方法仍然可以得到有意义的数据。, 百拇医药
由于大部分ALL患者均为异常多倍体细胞，因此单纯依靠个别染色体探针不能完全指导临床或做为观察预后指标[3]。我们选用畸变率较高的17、18、21号染色体做为观察对象，通过FISH检查，17/38(45%)存在有+17，22/38(58%)存在有+18，23/38(61%)存在有+21。高于文献报道结果[4]，这可能由于样本量小，不能代表总体水平，尚需继续观察，也可能由于文献所采用常规细胞遗传学分析，许多阳性结果未被发现。
参考文献
1 Baurmann H, Cherif D, Berger R. Interphase cytogenetics by fluorescent in situ hybridization for characterization of monosomy 7 associated myeloid disorders. Leukemia, 1993,17：365-374.
, 百拇医药
2 Van Lom K, Hagemeijer A, Smit EME, et al. In situ hybridization on giemsa-stained bone marrow and blood smears of patients with hematologic disorders allows detection of cell-lineage-specific cytogenetic abnomalities. Blood, 1993,82：884-888.
3 Lorna M, Secker W. Prognostic and biological importance of chromosome findings in acute lymphoblastic leukemia. Cancer Genet Cytogenet, 1990,49：1-13.
4 Bertil J, Fredrik M, Felix M. Secondary chromosomal abnormalities acute leukemias. Leukemia, 1994,8：953., 百拇医药