食管癌组织中端粒酶活性的研究
作者：王涛 张伟 金顺钱 张德超 刘毅 林培中
单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院胸外科(王涛、张德超、林培中)；肿瘤研究所肿瘤生物学检测中心(张伟、金顺钱、刘毅)
关键词：
中华医学杂志/981022 肿瘤细胞端粒酶活性研究已成为当前肿瘤标志物研究的热门课题，其对食管癌的早期诊断可能会产生重要影响。作者采用TRAP(telomeric repeat amplification protocol)技术[1]对食管癌组织和相邻正常粘膜组织进行端粒酶活性检测，旨在探索端粒酶在食管癌中的表达及其该指标在食管癌诊断，特别是早期诊断中的应用前景。现将结果报道如下。
一、对象与方法
1.对象：全部组织标本(包括44例食管癌，2例食管平滑肌瘤，44例相应癌旁上皮粘膜细胞)均取自我院1997年6月至1997年10月手术切除标本，术前均未放疗。标本均于离体后半小时内采集，液氮速冻，后转至-80 ℃冰箱贮存备用。所有病例均经我院病理证实。
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2.方法：(1) 端粒酶提取：每例标本取100 mg组织，用液氮速冻后在研钵中研成粉沫，再转至1.5 ml试管中，立即加入200 μl预冷的裂解液[10 mmol/L Tris-HCl (pH7.5)；1 mmol/L MgCl2；1 mmol/L EGTA，5 mmol/L 二巯基乙醇，0.5% CHAPS，10%甘油]，混匀后在0 ℃裂解30分钟，13 500r/min 4 ℃离心30分钟，吸取上清至一新预冷管中，采用BCA试剂盒(Sigma公司产品)进行蛋白质含量测定。
(2) 端粒酶检测：采用TRAP方法检测端粒酶活性，反应体积25 μl,反应体系含20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，1 mmol/L MgCl2, 63 mmol/L KCl, 0.005% Tween-20，1 mmol/L EGTA, 50 mmol/L dNTP, 1 μg T4基因32蛋白，0.1μg/ml BSA，74 kBq α32P- dCTP, 2U Taq酶和0.1μg TS引物(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)。加6 μg端粒酶提取物，混匀后30℃保温30分钟，90℃90秒灭活端粒酶，加0.1 μg CX引物(5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′)，混匀后覆盖石蜡油，在PE480 PCR仪上进行31个循环，循环参数为90 ℃40秒，50 ℃ 40秒，72 ℃50秒，最后于72 ℃延长10分钟，PCR产物在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳后凝胶与X光胶片置-80℃放射自显影，12小时后显示结果。每次检测以6μg肺癌细胞系气液色谱法蛋白作为阳性对照，阴性对照在反应液中不加组织提取物。
, 百拇医药
(3) 统计分析：χ2检验进行统计分析。
二、结果
1.食管癌及癌旁组织中端粒酶活性：阳性结果判定为经放射自显影后可见二条以上间隔6 bp的梯行带(见附图)。44例鳞癌中40例端粒酶表达阳性
P：肺癌细胞系GLC为阳性对照 N：癌旁组织，T：肿瘤组织 L：裂解缓冲液为阴性对照附图 端粒酶在食管癌及癌旁组织中的表达端粒酶在食管癌及癌旁组织中的表达
(90.9%)；44例癌旁组织中有9例端粒酶检测阳性(20.5%)，二者端粒酶表达其差异有显著意义(P<0.01)；2例食管平滑肌瘤端粒酶检测均为阴性。对44例癌旁组织进一步分析发现：在距肿瘤<5 cm的6例标本中4例端粒酶检测阳性(66.7%)，在距肿瘤>5 cm的38例标本中仅有5例表达阳性(13.2%)(P<0.05)。
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2.食管癌组织中端粒酶活性表达与临床资料间关系：根据食管癌浸润深度、肿瘤大小、有无淋巴结转移、分化程度、临床分期等不同进行分组，见附表。结果提示肿瘤浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期与端粒酶活性表达间差异无显著意义。
附表 食管癌组织中端粒酶活性表达
与临床资料的关系食管癌组织中端粒酶活性表达
与临床资料的关系 临床资料
端粒酶活性
阳性
阴性
年龄
42-75
, 百拇医药 50-77
平均年龄
56.5
64.4
性别(男:女)
34:6
3:1
肿瘤长度(cm)
2-11
4.5-10
浸润程度
达肌层
7
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0
达纤维膜
8
2
达周围器官
25
2
淋巴结转移
17
1
组织学类型(鳞癌)
低分化
8
, http://www.100md.com 2
中分化
20
2
高分化
12
0
临床分期
Ⅱa期
6
1
Ⅱb期
5
1
, 百拇医药
Ⅲ期
29
2
注：阳性40例，阴性4例
三、讨论
端粒酶的激活与细胞永生化关系极为密切，是肿瘤发生的早期事件[2]。采用TRAP技术，国外已检测出头颈部鳞癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等组织端粒酶活性增高，而在邻近正常组织或良性肿瘤中多未检测到端粒酶活性，提示端粒酶在上述肿瘤中可能成为肿瘤特异生物学标记物。本实验检测了44例食管癌组织中的端粒酶活性， 其检出率为90.9%，2例食管平滑肌瘤端粒酶活性为阴性，在食管癌癌旁组织中端粒酶检出率为20.45%。端粒酶检出率在食管癌与癌旁组织间具有显著差异。提示端粒酶活性检测在食管癌分子生物学诊断中可能有重要意义。
, 百拇医药 Hiyama[3，4]等在研究乳腺癌、胃癌时认为肿瘤的临床分期、病理类型、肿瘤大小及淋巴结情况与端粒酶活性有密切关系。但本文对端粒酶活性与临床分期、肿瘤长度、侵润程度、淋巴结转移及组织学类型、分化程度的关系进行统计学分析后认为它们之间无相关性。
本研究发现癌旁组织中的端粒酶活性与肿瘤的距离有关。<5 cm的范围内，阳性率为66.7%(4/6)，>5 cm的范围内，阳性率为13.2%(5/38)。提示癌旁组织中可能有残存微小癌灶，这可作为判断复发和预后的指标。同时也提示癌旁组织中可能存在不典型增生病变，如经证实其对食管癌的早期诊断可能具有更实际的临床意义。MaoLi等[5]在头颈肿瘤的端粒酶的研究中提出手术切缘与局部复发有直接关系。我们 将在随访中会密切观察，以证实这种关系是否存在。
端粒酶在肿瘤组织中的特异性高表达，提示其有可能成为较好的肿瘤早期诊断的生物学标志物。已经有人对胸水、粪便、腹水、尿液、乳腺的针吸活检中癌细胞进行了端粒酶研究，并取得了较好的研究结果。因此，前瞻性研究食管癌高发现场高危人群重度不典型增生组织标本中的端粒酶活性，将有助于明确端粒酶活性作为食管癌早期诊断指标的可行性，该项工作正在进行中。 参考文献
, 百拇医药
1 Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science,1994,266: 2011-2015.
2 Rhyu MS.Telomeres telomerase and immortality.JNCI,1995,87:884-894.
3 Hiyama E,Gollahon L,Kataoka T,et al.Telomerase activity in human breast tumors.JNCI. 1996,88：116-122.
4 Hiyama E,Yokoyama T,Tatsumoto N,et al.Telomerase activity in gastric cancer.Cancer Research, 1995, 55：3258-3262.
5 Mao L,Naggar AE,Fan YH,et al. Telomerase activity in head and neck squamous cell carcinona and adjacent tissues.Cancer Research,1996, 56:5600-5604., 百拇医药
单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院胸外科(王涛、张德超、林培中)；肿瘤研究所肿瘤生物学检测中心(张伟、金顺钱、刘毅)
关键词：
中华医学杂志/981022 肿瘤细胞端粒酶活性研究已成为当前肿瘤标志物研究的热门课题，其对食管癌的早期诊断可能会产生重要影响。作者采用TRAP(telomeric repeat amplification protocol)技术[1]对食管癌组织和相邻正常粘膜组织进行端粒酶活性检测，旨在探索端粒酶在食管癌中的表达及其该指标在食管癌诊断，特别是早期诊断中的应用前景。现将结果报道如下。
一、对象与方法
1.对象：全部组织标本(包括44例食管癌，2例食管平滑肌瘤，44例相应癌旁上皮粘膜细胞)均取自我院1997年6月至1997年10月手术切除标本，术前均未放疗。标本均于离体后半小时内采集，液氮速冻，后转至-80 ℃冰箱贮存备用。所有病例均经我院病理证实。
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2.方法：(1) 端粒酶提取：每例标本取100 mg组织，用液氮速冻后在研钵中研成粉沫，再转至1.5 ml试管中，立即加入200 μl预冷的裂解液[10 mmol/L Tris-HCl (pH7.5)；1 mmol/L MgCl2；1 mmol/L EGTA，5 mmol/L 二巯基乙醇，0.5% CHAPS，10%甘油]，混匀后在0 ℃裂解30分钟，13 500r/min 4 ℃离心30分钟，吸取上清至一新预冷管中，采用BCA试剂盒(Sigma公司产品)进行蛋白质含量测定。
(2) 端粒酶检测：采用TRAP方法检测端粒酶活性，反应体积25 μl,反应体系含20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，1 mmol/L MgCl2, 63 mmol/L KCl, 0.005% Tween-20，1 mmol/L EGTA, 50 mmol/L dNTP, 1 μg T4基因32蛋白，0.1μg/ml BSA，74 kBq α32P- dCTP, 2U Taq酶和0.1μg TS引物(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)。加6 μg端粒酶提取物，混匀后30℃保温30分钟，90℃90秒灭活端粒酶，加0.1 μg CX引物(5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′)，混匀后覆盖石蜡油，在PE480 PCR仪上进行31个循环，循环参数为90 ℃40秒，50 ℃ 40秒，72 ℃50秒，最后于72 ℃延长10分钟，PCR产物在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳后凝胶与X光胶片置-80℃放射自显影，12小时后显示结果。每次检测以6μg肺癌细胞系气液色谱法蛋白作为阳性对照，阴性对照在反应液中不加组织提取物。
, 百拇医药
(3) 统计分析：χ2检验进行统计分析。
二、结果
1.食管癌及癌旁组织中端粒酶活性：阳性结果判定为经放射自显影后可见二条以上间隔6 bp的梯行带(见附图)。44例鳞癌中40例端粒酶表达阳性
P：肺癌细胞系GLC为阳性对照 N：癌旁组织，T：肿瘤组织 L：裂解缓冲液为阴性对照附图 端粒酶在食管癌及癌旁组织中的表达端粒酶在食管癌及癌旁组织中的表达
(90.9%)；44例癌旁组织中有9例端粒酶检测阳性(20.5%)，二者端粒酶表达其差异有显著意义(P<0.01)；2例食管平滑肌瘤端粒酶检测均为阴性。对44例癌旁组织进一步分析发现：在距肿瘤<5 cm的6例标本中4例端粒酶检测阳性(66.7%)，在距肿瘤>5 cm的38例标本中仅有5例表达阳性(13.2%)(P<0.05)。
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2.食管癌组织中端粒酶活性表达与临床资料间关系：根据食管癌浸润深度、肿瘤大小、有无淋巴结转移、分化程度、临床分期等不同进行分组，见附表。结果提示肿瘤浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期与端粒酶活性表达间差异无显著意义。
附表 食管癌组织中端粒酶活性表达
与临床资料的关系食管癌组织中端粒酶活性表达
与临床资料的关系 临床资料
端粒酶活性
阳性
阴性
年龄
42-75
, 百拇医药 50-77
平均年龄
56.5
64.4
性别(男:女)
34:6
3:1
肿瘤长度(cm)
2-11
4.5-10
浸润程度
达肌层
7
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0
达纤维膜
8
2
达周围器官
25
2
淋巴结转移
17
1
组织学类型(鳞癌)
低分化
8
, http://www.100md.com 2
中分化
20
2
高分化
12
0
临床分期
Ⅱa期
6
1
Ⅱb期
5
1
, 百拇医药
Ⅲ期
29
2
注：阳性40例，阴性4例
三、讨论
端粒酶的激活与细胞永生化关系极为密切，是肿瘤发生的早期事件[2]。采用TRAP技术，国外已检测出头颈部鳞癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等组织端粒酶活性增高，而在邻近正常组织或良性肿瘤中多未检测到端粒酶活性，提示端粒酶在上述肿瘤中可能成为肿瘤特异生物学标记物。本实验检测了44例食管癌组织中的端粒酶活性， 其检出率为90.9%，2例食管平滑肌瘤端粒酶活性为阴性，在食管癌癌旁组织中端粒酶检出率为20.45%。端粒酶检出率在食管癌与癌旁组织间具有显著差异。提示端粒酶活性检测在食管癌分子生物学诊断中可能有重要意义。
, 百拇医药 Hiyama[3，4]等在研究乳腺癌、胃癌时认为肿瘤的临床分期、病理类型、肿瘤大小及淋巴结情况与端粒酶活性有密切关系。但本文对端粒酶活性与临床分期、肿瘤长度、侵润程度、淋巴结转移及组织学类型、分化程度的关系进行统计学分析后认为它们之间无相关性。
本研究发现癌旁组织中的端粒酶活性与肿瘤的距离有关。<5 cm的范围内，阳性率为66.7%(4/6)，>5 cm的范围内，阳性率为13.2%(5/38)。提示癌旁组织中可能有残存微小癌灶，这可作为判断复发和预后的指标。同时也提示癌旁组织中可能存在不典型增生病变，如经证实其对食管癌的早期诊断可能具有更实际的临床意义。MaoLi等[5]在头颈肿瘤的端粒酶的研究中提出手术切缘与局部复发有直接关系。我们 将在随访中会密切观察，以证实这种关系是否存在。
端粒酶在肿瘤组织中的特异性高表达，提示其有可能成为较好的肿瘤早期诊断的生物学标志物。已经有人对胸水、粪便、腹水、尿液、乳腺的针吸活检中癌细胞进行了端粒酶研究，并取得了较好的研究结果。因此，前瞻性研究食管癌高发现场高危人群重度不典型增生组织标本中的端粒酶活性，将有助于明确端粒酶活性作为食管癌早期诊断指标的可行性，该项工作正在进行中。 参考文献
, 百拇医药
1 Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science,1994,266: 2011-2015.
2 Rhyu MS.Telomeres telomerase and immortality.JNCI,1995,87:884-894.
3 Hiyama E,Gollahon L,Kataoka T,et al.Telomerase activity in human breast tumors.JNCI. 1996,88：116-122.
4 Hiyama E,Yokoyama T,Tatsumoto N,et al.Telomerase activity in gastric cancer.Cancer Research, 1995, 55：3258-3262.
5 Mao L,Naggar AE,Fan YH,et al. Telomerase activity in head and neck squamous cell carcinona and adjacent tissues.Cancer Research,1996, 56:5600-5604., 百拇医药