人类白细胞抗原-Ⅰ类抗原的DNA分型与临床应用
作者：谭建明 唐孝达 谢桐 徐琴君 丁言德
单位：200080 上海市第一人民医院肾移植中心
关键词：组织相容性；HLA抗原；聚合酶链反应
中华医学杂志/981015 【摘要】 目的 采用顺序特异引物聚合酶链反应技术(PCR-SSP)建立汉族人群白细胞抗原-Ⅰ(HLA-Ⅰ)类抗原A、B位点DNA分型方法。方法 设计合成81个特异性引物和1对阳性对照引物，组成20个PCR反应用于A位点分型、41个PCR反应用于B位点分型，建立一步法PCR-SSP方法，应用于62份标准DNA和345例肾移植供受者的HLA-Ⅰ类DNA分型。结果 所有样本PCR-SSP基因分型均获得成功，无假阳性和假阴性出现，40份样本的重复率100%，总耗时5小时。分型结果经双盲验证完全符合。可准确分辨出A位点等位基因19个、B位点等位基因41个;实际检出汉族人群A抗原特异性13个、B抗原特异性32个。结论 PCR-SSP技术行HLA-Ⅰ类A、B位点DNA分型，分辨率高、特异性强、重复性好、相对简捷快速，分型结果较血清学方法更加精确可靠，适合于临床应用。
, 百拇医药
DNA typing for HLA-A, B antigens by polymerase chain reaction with sequence-specific primers and clinical application
Tan Jianming, Tang Xiaoda, Xie Tong, et al. Renal Transplant Center, Shanghai First People′s Hospital, Shanghai 200080
【Abstract】 Objective To establish DNA typing for HLA-A, B antigens in Chinese by polymerase chain reaction with sequence-specific primers (PCR-SSP). Methods DNA samples were obtained from 178 unrelated donors and 167 kidney recipients. An additional panel of 62 standard DNAs that were typed by UCLA tissue typing lab in USA. A rapid genotyping for HLA-Ⅰ class (A, B antigens) by PCR-SSP was set up by designed and synthesized 81 specific primers and 1 pair of internal control primer, combining in 61 one-step reactions (20 PCR reactions for A alleles, 41 PCR reactions for B alleles). Results HLA-A, B alleles were successfully typed in 345 clinical samples and 62 standard DNAs by PCR-SSP technique. No false positive or false negative typing results were obtained. Reproducibility was 100% in 40 samples. The overall time of DNA typing was 5 hours. The typing results were consistent with those of UCLA tissue typing lab. Nineteen alleles of HLA-A and 41 HLA-B alleles were accurately distinguished. Thirteen HLA-A alleles and thirty-two HLA-B alleles in Chinese were practically typed. Conclusion DNA typing for HLA-Ⅰ class (A, B antigens) by PCR-SSP has proved to be a technique of high-resolution, high-specificity, well-reproducibility, and more suitable for clinical application than serology.
, 百拇医药
【Key words】 Histocompatibility HLA antigens Polymerase chain reaction
(Natl Med J China， 1998，78：763-767)
人类白细胞抗原(HLA)-Ⅰ类分子是影响骨髓移植成败和器官移植长期存活的关键因素之一。Ⅰ类抗原的分型研究是组织配型的主要内容，也是人类遗传学和免疫遗传学研究的基础。目前临床常用的血清学分型方法，由于存在着广泛的交叉反应和难以找到理想的单特异性抗血清分型试剂而常常出现技术上的困难和分型判断误差。近二年来，国外学者采用DNA分型方法对白种人群HLA-Ⅰ类抗原分型取得进展。我们采用顺序特异引物聚合酶链反应技术(PCR-SSP)对中国汉族人群Ⅰ类抗原的DNA分型进行研究与临床应用，现将结果报告如下。
材料与方法
, http://www.100md.com 一、DNA样本
1.标准DNA:系列标准DNA共62份，包括A位点A1～A74(无A43)和B位点B7～B78，由美国加州大学(UCLA)配型中心提供。
2.临床样本DNA，共345份。来源于等待肾移植受者167例，无关供者178例，年龄18～60岁，均为汉族南方籍人群。
3.模板DNA提取：采集肝素抗凝外周血3 ml，分离淋巴细胞。采用标准酚氯仿抽提法或快速盐析法提取DNA[1]。所获DNA纯度(260/ 280)A值为1.6～2.0。
二、扩增引物
根据1995年公布的HLA-Ⅰ类核苷酸序列[2]，参照Bunce等[3，4]、Bozon等[5]和Sadler等[6]报道的序列，自行设计A1～A74特异性引物30个、B7～B78特异性引物51个和阳性对照引物2个，由中国科学院上海Sangan公司合成，page纯化。引物的解链温度58 ℃～62℃，引物序列详见表1。引物的组成与反应格局、引物浓度、扩增产物大小和特异性，详见表2、表3。
, 百拇医药
表1 HLA-Ⅰ类抗原PCR-SSP分型引物序列 引物
编号
退火
位置
5′-末端引物序列
(5′→3′)
引物
编号
退火
位置
3′-末端引物序列
(5′→3′)
, 百拇医药
173
Ex2 5-25
ccactccatgaggtatttctt
127
Ex3 18-36
cgtcgcagccatacatcca
174
Ex2 168-186
ccggagtattgggacctgc
167
Ex3 216-233
, http://www.100md.com
gagccactccacgcaccg
187
Ex2 144-161
gcgccgtggatagagcaa
168
Ex3 216-233
gagccactccacgcacgt
188
Ex2 117-133
gccgcgagtccgaggac
170
, http://www.100md.com
Ex3 195-213
cctccaggtaggctctctg
189
Ex2 181-199
accggaacacacagatctg
171
Ex3 48-64
ccgcggaggaagcgcca
192
Ex2 181-199
accgggagacacagatctc
, http://www.100md.com
212
Ex3 195-213
cctccaggtaggctctgtc
193
Ex2 170-188
ggagtattgggaccggaac
213
Ex3 44-59
gaggaggcgcccgtcg
194
Ex2 195-212
, http://www.100md.com aacatgaaggcctccgcg
214
Ex3 76-92
cttgccgtcgtaggcgg
195
Ex2 180-199
gaccggaacacacagatctt
215
Ex3 77-95
atccttgccgtcgtaggct
197
, 百拇医药
Ex2 157-173
agcaggaggggccggaa
216
Ex3 92-111
cgttcagggcgatgtaatct
203
Ex2 192-210
cagatctacaaggcccagg
217
Ex3 201-218
cgtgccctccaggtaggt
, http://www.100md.com
204
Ex2 117-133
gccgcgagtccgagagg
218
Ex3 216-233
ggccactccacgcactc
205
Ex2 10-30
ccatgaggtatttctacaccg
219
Ex3 229-246
, 百拇医药
ccaggtatctgcggagcg
206
Ex2 180-199
gaccggaacacacagatcta
220
Ex3 260-276
ccgcgcgctccagcgtg
207
Ex2 221-233
ccgagagagcctgcggaa
221
, 百拇医药
Ex3 262-279
taccaggcgctccagct
208
Ex2 220-238
accgagagaacctgcggat
224
Ex3 18-36
cgtcgcagccatacatcac
209
Ex2 116-133
cgccgcgagtccgagaga
, 百拇医药
225
Ex3 184-201
ctctcagctgctccgcct
239
Ex3 63-80
gggtaccagcaggacgct
228
Ex3 68-85
tcgtaggcgtcctggtgg
240
Ex2 186-205
, http://www.100md.com gagacacagaagtacaagcg
229
Ex3 156-173
ctccaacttgcgctggga
242
Ex2 222-239
cgagagagcctgcggaac
232
Ex2 173-192
gtgtgttccggtcccaatat
243
, 百拇医药
Ex2 119-136
cgcgagtccgaggtggc
234
Ex2 246-264
cgctctggttgtagtagcg
246
Ex2 5-24
ccactccatgaggtatttcc
235
Ex4 168-187
gcccacttctggaaggttct
, 百拇医药
251
Ex2 227-244
ggacctgcggaccctgct
236
Ex3 11-28
ccatacatcgtctgccaa
271
Ex2 52-69
gggagccccgcttcatct
237
Ex2 229-245
, 百拇医药 gcgcaggttccgcaggc
272
Ex2 116-133
cgccacgagtccgaggaa
238
Ex3 216-233
gagccactccacgcacag
278
Ex2 227-244
gagcctgcggaccctgct
241
, 百拇医药
Ex3 120-136
gccgcggtccaggagct
280
Ex2 76-94
gctacgtggacgacacgct
244
Ex3 228-245
caggtatctgcggagccc
284
Ex2 174-192
tattgggacgaggagacag
, 百拇医药
249
Ex3 195-213
cctccaggtaggctctcaa
286
Ex2 113-130
cgacgccgcgagccagaa
250
Ex2 225-242
gcaggttccgcaggctct
290
Ex2 191-209
, 百拇医药
acggaatgtgaaggcccag
277
Ex3 44-60
ggaggaagcgcccgtcg
291
Ex2 111-127
agcgacgccgcgagcca
281
Ex2 207-225
ctcggtcagtctgtgcctt
292
, 百拇医药
Ex2 166-184
ggccggagtattgggacga
282
Ex2 207-226
tctcggtaagtctgtgcctt
294
Ex2 210-229
tcacagactgaccgagagag
285
Ex3 69-86
gtcgtaggcgtcctggtc
, 百拇医药
295
Ex2 37-53
cccggcccggcagtgga
298
Ex3 80-100
atgtaatccttgccgtcgtaa
296
Ex2 149-167
gtggatagagcaggagggt
299
Ex3 212-229
, 百拇医药
cactccacgcacgtgcca
367
Ex2 249-268
tactacaaccagagcgagga
300
Ex3 105-123
agcgcaggtcctcgttcaa
434
Ex2 5-25
ccactccatgaggtatttcac
301
, 百拇医药
Ex3 71-88
ccgtcgtaggcgtgctgt
435
Ex2 230-246
cctgcgcaccgcgctcc
302
Ex3 110-128
ccaagagcgcaggtcctct
451
Ex3 63-80
gggtaccggcaggacgct
, 百拇医药
394
Ex3 20-39
ccacgtcgcagccatacatt
429
Ex2 186-205
gccttcacattccgtgtgtt
C5
Ex3 519-537
tgccaagtggagcacccaa
431
Ex3 216-232
, 百拇医药
agcccgtccacgcaccg
C3
Ex4 579-598
gcatcttgctctgtgcagat
486
Ex2 184-203
cttcacattccgtgtctcct
表2 HLA-A位点PCR-SSP分型反应格局、引物浓度、扩增产物大小与特异性 条带
编号
5′-端引物
3′-端引物
, http://www.100md.com
产物大
小(bp)
特异性
编号
浓度
(μmol/L)
编号
浓度
(μmol/L)
1
286
1.0
431
, 百拇医药
1.0
629
A1(0101，0102)
2
296
3.0
302
3.0
489
A2(0201-0217)
3
291
1.0
, http://www.100md.com
299
1.0
628
A3(0301，0302)
4
284
1.0
302
1.0
464
A23，24(2301，2401-2407)
5
292
, 百拇医药
3.0
249
3.0
557
A23(2301)
6
292
1.0
170
1.0
557
A24(2402-2407)
7
, 百拇医药
193
1.0
298
1.0
440
A25，26，34，66
(2501，2601-
2605，6601，6602，3401，3402)
8
294
3.0
298
, 百拇医药
3.0
400
A25(2501)
9
367
1.0
394
1.0
300
A1，11，36，80(01，11，3601，8001)
10
290
1.0
, 百拇医药
167
1.0
552
A11，66(1101，1102，6601)
11
290
2.0
302
2.0
447
A28(6801，6802，6901)
12
, 百拇医药 290
2.0
171
2.0
383
A69(6901)
13
174
2.0
300
2.0
465
A29(2901，2902)
, 百拇医药
14
295
2.0
301
2.0
561
A30(3001-3005)
15
434
3.0
486
3.0
198
, 百拇医药
A31(31011,31012)
16
173
3.0
234
3.0
259
A32(3201)
17
434
3.0
429
3.0
, 百拇医药
200
A33(3301-3303)
18
239/451
3.0
168
3.0
170
A34(3401,3402)
19
286
2.0
168
, http://www.100md.com
2.0
630
A36(3601)
20
173
2.0
300
2.0
628
A74,32
(7401,3201)
C5
0.1
, http://www.100md.com
C3
0.1
796
control
三、扩增条件
1.反应混合物：A位点引物组成20个PCR反应， B位点引物组成41个PCR反应。每份样本同时62管PCR反应(1管阴性对照)。每个反应体系总量25 μl。包括0.75×PCR Buffer (37.5 mmol/L KCl，7.5 mmol/L Tris)、1.5 mmol/L MgCl2、0.5U Taq酶(均为美国PE公司原装产品)、200 μmol/L dNTP、3%DMSO、1～3 μmol/L特异引物、0.1 μmol/L对照引物、50～100ng的模板DNA。
2.扩增温度：95 ℃预温2分钟，然后三温循环共计30个循环。A位点95℃30秒、65 ℃50秒、72 ℃50秒， 5个循环；95 ℃30秒、62 ℃50秒、72 ℃50秒，5个循环；95 ℃30秒、60 ℃ 50秒、72 ℃50秒， 20个循环。B位点95 ℃30秒、65 ℃45秒、72 ℃45秒，5个循环；95 ℃30秒、60 ℃50秒、72 ℃50秒，20个循环；95 ℃30秒、55 ℃60秒、72 ℃2分钟， 5个循环。最后72 ℃保温5分钟。
, http://www.100md.com
3.扩增仪：美国PE公司9600型扩增仪。
四、电泳
1×TAE缓冲液配制含0.5 μg/ml溴乙锭的2%琼脂糖凝胶，扩增产物10 μl点样，按15V/cm稳压电泳25分钟，紫外光下观察结果。结果
一、标准DNA分型结果
由美国UCLA配型中心提供的62份标准DNA，采用本文建立的PCR-SSP方法单盲分型，结果完全相符。可分辨的A位点等位基因特异性包括A1～A74共19个，B位点等位基因特异性包括B7～B78共41个以及Bw4、Bw6两大组。特异性阳性扩增产物大小与表2、表3计算值相同，见图1，图2。
二、临床样本分型结果
所有345份临床样本DNA，采用PCR-SSP行HLA-Ⅰ类分型均获得成功。共检出A位点等位基因总数635个，其中纯合子55例(占15.9%)，杂合子290例；B位点等位基因总数625个，其中纯合子65例(占18.8%)，杂合子280例。无假阳性和假阴性出现。阳性对照和各等位基因特异性扩增产物大小与表2、表3计算值完全相同。检测所需时间为5小时，包括模板DNA提取2小时，扩增2小时，其他1小时。
, http://www.100md.com
本方法可分辨的A抗原特异性19个、B抗原特异性41个。实际检出汉族南方籍人群的A抗原特异性13个，其中A23、A25、A34、A36、A66、A69等6个位点无阳性样本；B抗原特异性32个，其中B18、B41、B45、B47、B64、B65、B71、B72、B78等九个位点无阳性样本。汉族南方籍人群中， A位点的等位基因频率分布较为集中，最常见的等位基因频率为A2、A11和A24，分别占26.9%、23.1%和22.0%。B位点的等位基因频率分布较为分散，常见的等位基因频率为B60、B13、B62、B46、B51和B58，分别占13.7%、9.7%、8.1%、7.5%、7.5%和7.1%。
345份临床样本与血清学分型的初步比较显示:血清学A位点总误差31例，误差率9.0%，包括16个血清学空白位点(血清学仅分辨出一个A位点)，经DNA分型证实存在另一个A位点。15个血清学A位点分型结果与DNA分型结果不同，经重复实验证实血清学分型错误。B位点血清学分型总误
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表3 HLA-B位点PCR-SSP分型反应格局、引物浓度、扩增产物大小与特异性 条带
编号
5′-端引物
3′-端引物
产物大小
(bp)
特异性
编号
浓度(μmol/L)
编号
浓度(μmol/L)
1
, 百拇医药
208
3.0
216
3.0
401
B51,B52(5101-5105,52011,52012)
2
192
3.0
216
3.0
440
B52(52011,52012)
, http://www.100md.com
3
193
3.0
221
3.0
619
B7(0701-0705,8101)
4
195
3.0
221
3.0
606
, 百拇医药
B8(0801,0802)
5
272
3.0
285
3.0
480
B44(4402-4404)
6
246
3.0
215
3.0
, 百拇医药
600
B45,B21(4501,4901,5001)
7
280
3.0
225
3.0
635
B21(4901,5001,4005
,2704,2706,B45v)
8
208
, 百拇医药
3.0
215
3.0
385
B49,B59(4901,5901)
9
243
3.0
215
3.0
488
B13(1301-1303)
10
, http://www.100md.com
197
3.0
127
3.0
389
B64,B65(1401,1402)
11
205
3.0
232
3.0
182
B65(1402,3904)
, 百拇医药
12
243
2.0
250
2.0
123
B62,75,76(1501-1508,1511-1515,1519-1521)
13
192
3.0
214
3.0
, 百拇医药 421
B62,72,76(1501-1507,1512/14/19/20)
14
243
3.0
219/244
3.0
636
B76(1512,1514,1519)
15
194
3.0
, 百拇医药
225
3.0
516
B63(1516,1517)
16
207
3.0
216
3.0
400
B78(7801,7802,1509)
17
208/435
, 百拇医药
3.0
217
3.0
498
B38(3801,3802)
18
207
3.0
217
3.0
507
B39,B67(3901-3908,6701)
19
, 百拇医药
206
3.0
217
3.0
548
B67(67011,67012)
20
194
3.0
224
3.0
351
B57(5701-5703)
, 百拇医药
21
194
3.0
213
3.0
374
B58(5801-5803)
22
187
3.0
214
3.0
458
, 百拇医药
B18(1801,1802)
23
203
3.0
215
3.0
413
B22(5401,5501,5502,5601,5602)
24
204
3.0
236
, 百拇医药 3.0
421
B54(5401)
25
203
3.0
238
3.0
551
B56(5601,5602)
26
280
2.0
, 百拇医药
281/282
2.0
149
B27(2701-2709)
27
195
3.0
213/277
3.0
389
B35,B53(3501-3511,5301)
28
, 百拇医药
188
3.0
237
3.0
128
B35,18,78,70(3501-3513,18,7801,7802,1522)
29
188
3.0
212
3.0
606
, 百拇医药
B37(3701)
30
192
3.0
220
3.0
605
B41(4101,4102)
31
203
3.0
220
3.0
, 百拇医药
594
B42(4201,42v)
32
240
3.0
241
3.0
459
B46(4601)
33
192
3.0
228
, http://www.100md.com
3.0
414
B47(4701)
34
209
3.0
229
3.0
567
B48(4801,8101)
35
280
2.0
, 百拇医药
229
2.0
607
B60(40011,40012,4007)
36
272
3.0
218
3.0
627
B40,B47(40011-4008,4701)
37
, http://www.100md.com
271
3.0
238
3.0
691
B70,B48(1503/9/10/18/23/29,72v,4802)
38
189
3.0
238
3.0
562
, 百拇医药 70,B71(no72)(1509,1510,1518,1521)
39
209
3.0
214
3.0
486
B72(1503,1518,72,4802)
40
435/208/251/278
3.0
235
, 百拇医药
3.0
1330
Bw4
41
242
3.0
235
3.0
1340
Bw6
C5
0.1
C3
, 百拇医药
0.1
796
control
差37例，误差率10.7%，包括19个血清学空白位点，经DNA分型证实存在另一个B位点，18个B位点血清学分型结果与DNA结果不同，重复实验证实血清学分型错误。
三、重复性实验与分型结果验证
1.重复性实验：选择20份标准DNA和20份不同位点的临床样本DNA，每位点重复实验5次，均获得相同的分型结果，重复率100%。
2.标准DNA证实:临床样本DNA与标准DNA同时、同条件进行PCR-SSP分型，其特异性扩增产物条带完全相同。
3.本实验检出的中国汉族南方籍人群A位点和B位点等位基因阳性样本DNA共40份，随机编号，送美国UCLA配型中心DNA实验室进行双盲验证，其分型结果完全相同。
, 百拇医药
M：分子量标志，N：阴性对照，条带1～20分别为A1～A74分型的特异性扩增产物(表2).产物片段长度范围170～630 bp不等.每个PCR反应体系包括内源性阳性对照(796 bp)图1 HLA-A抗原PCR-SSP分型结果
M：分子量标志，N：阴性对照，条带1～41分别为 B5～B78和Bw4, Bw6分型的特异性扩增产物(表3).产物片段长度范围123～1340 bp不等.每个PCR反应体系包括内源性阳性对照(796 bp)图2 HLA-B抗原PCR-SSP分型结果
讨论
本项研究根据最新公布的Ⅰ类分子核苷酸碱基序列，结合中国汉族人群基因频率分布特点，设计合成81个特异性引物，组成20个PCR反应用于A位点分型、41个PCR反应用于B位点分型，建立一步法PCR-SSP技术DNA分型方法。62份标准DNA和345份临床样本的实验研究结果显示，所有样本的DNA分型均获得成功，能够分辨出所有血清学方法能够分辨出的等位基因，而且对血清学存在明显交叉反应而难以确定或不能分辨的，也能作出准确地分型。如血清学对A19分裂子的确定，对B57、B58和B63，B38、B39和B67，以及B60、B61和B48等的分辨常常出现误差或错判，而本方法能够很容易地分辨出来。血清学对A34、A66、A69和A74， B35组和B40组的分型，至今缺乏理想的单特异性抗血清，而采用本方法能够作出准确的分型。分型结果经标准DNA验证和美国UCLA配型中心双盲验证完全符合，40份样本的重复性实验显示其重复率为100%。因此，本方法实际上是一种分辨度较高的DNA分型方法，结果精确可靠，分辨度显著高于血清学方法。本研究根据设计引物的反应格局组合引物混合物，一步法，一次扩增，立即可获得A、B位点的分型结果，总耗时为5小时，与血清学方法相同而结果更加精确可靠，使其临床应用成为可能。此外，DNA分型不需要血清学必备的活细胞，临床样本采集方便，试剂来源方便易得。本项研究的实验条件采用3种不同的退火温度，先高后低，既保证了扩增产物的特异性，又增加了灵敏性;同时设立内源性阳性对照，确保了每个PCR反应体系的准确无误。当然，本方法也存在自身的不足，突出的问题是目前难以应付临床大样本量的检测，如筛选异基因骨髓移植的供者。由于每份样本要同时进行62管PCR反应，国内现有的实验室一般一次只能检测3份样本。推荐解决的办法是先用血清学方法筛选出合适的供者，再用DNA分型确认;对于血清学的空白位点和难以肯定的位点，采用DNA分型来证实。
, 百拇医药
参考文献
1 谭建明，谢桐，徐琴君，等.快速盐析法提取DNA在HLA基因分型中的应用.中华器官移植杂志，1996，17：9-11.
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3 Bunce M, Fanning GC, Welsh KI. Comprehensive, serologically equivalent DNA typing for HLA-B by PCR using sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens, 1995, 45：81-90.
4 Bunce M, O′Neill CM, Barnado MCNM, et al. Phototyping: Comprehensive, DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 and DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers. Tissue Antigens, 1995, 46：355-366.
, 百拇医药
5 Bozon MV, Delgado JC, Turbay D, et al. Comparison of HLA-A antigen typing by serology with two polymerase chain reaction based DNA typing methods: implications for proficiency testing. Tissue Antigens, 1996, 47：512-518.
6 Sadler AM, Petronzelli F, Krausa P, et al. Low-resolution DNA typing for HLA-B using sequence-specific primers in allele or group specific ARMS/PCR. Tissue Antigens, 1994, 44：148-154.
(收稿：1998-01-19 修回：1998-06-16), 百拇医药
单位：200080 上海市第一人民医院肾移植中心
关键词：组织相容性；HLA抗原；聚合酶链反应
中华医学杂志/981015 【摘要】 目的 采用顺序特异引物聚合酶链反应技术(PCR-SSP)建立汉族人群白细胞抗原-Ⅰ(HLA-Ⅰ)类抗原A、B位点DNA分型方法。方法 设计合成81个特异性引物和1对阳性对照引物，组成20个PCR反应用于A位点分型、41个PCR反应用于B位点分型，建立一步法PCR-SSP方法，应用于62份标准DNA和345例肾移植供受者的HLA-Ⅰ类DNA分型。结果 所有样本PCR-SSP基因分型均获得成功，无假阳性和假阴性出现，40份样本的重复率100%，总耗时5小时。分型结果经双盲验证完全符合。可准确分辨出A位点等位基因19个、B位点等位基因41个;实际检出汉族人群A抗原特异性13个、B抗原特异性32个。结论 PCR-SSP技术行HLA-Ⅰ类A、B位点DNA分型，分辨率高、特异性强、重复性好、相对简捷快速，分型结果较血清学方法更加精确可靠，适合于临床应用。
, 百拇医药
DNA typing for HLA-A, B antigens by polymerase chain reaction with sequence-specific primers and clinical application
Tan Jianming, Tang Xiaoda, Xie Tong, et al. Renal Transplant Center, Shanghai First People′s Hospital, Shanghai 200080
【Abstract】 Objective To establish DNA typing for HLA-A, B antigens in Chinese by polymerase chain reaction with sequence-specific primers (PCR-SSP). Methods DNA samples were obtained from 178 unrelated donors and 167 kidney recipients. An additional panel of 62 standard DNAs that were typed by UCLA tissue typing lab in USA. A rapid genotyping for HLA-Ⅰ class (A, B antigens) by PCR-SSP was set up by designed and synthesized 81 specific primers and 1 pair of internal control primer, combining in 61 one-step reactions (20 PCR reactions for A alleles, 41 PCR reactions for B alleles). Results HLA-A, B alleles were successfully typed in 345 clinical samples and 62 standard DNAs by PCR-SSP technique. No false positive or false negative typing results were obtained. Reproducibility was 100% in 40 samples. The overall time of DNA typing was 5 hours. The typing results were consistent with those of UCLA tissue typing lab. Nineteen alleles of HLA-A and 41 HLA-B alleles were accurately distinguished. Thirteen HLA-A alleles and thirty-two HLA-B alleles in Chinese were practically typed. Conclusion DNA typing for HLA-Ⅰ class (A, B antigens) by PCR-SSP has proved to be a technique of high-resolution, high-specificity, well-reproducibility, and more suitable for clinical application than serology.
, 百拇医药
【Key words】 Histocompatibility HLA antigens Polymerase chain reaction
(Natl Med J China， 1998，78：763-767)
人类白细胞抗原(HLA)-Ⅰ类分子是影响骨髓移植成败和器官移植长期存活的关键因素之一。Ⅰ类抗原的分型研究是组织配型的主要内容，也是人类遗传学和免疫遗传学研究的基础。目前临床常用的血清学分型方法，由于存在着广泛的交叉反应和难以找到理想的单特异性抗血清分型试剂而常常出现技术上的困难和分型判断误差。近二年来，国外学者采用DNA分型方法对白种人群HLA-Ⅰ类抗原分型取得进展。我们采用顺序特异引物聚合酶链反应技术(PCR-SSP)对中国汉族人群Ⅰ类抗原的DNA分型进行研究与临床应用，现将结果报告如下。
材料与方法
, http://www.100md.com 一、DNA样本
1.标准DNA:系列标准DNA共62份，包括A位点A1～A74(无A43)和B位点B7～B78，由美国加州大学(UCLA)配型中心提供。
2.临床样本DNA，共345份。来源于等待肾移植受者167例，无关供者178例，年龄18～60岁，均为汉族南方籍人群。
3.模板DNA提取：采集肝素抗凝外周血3 ml，分离淋巴细胞。采用标准酚氯仿抽提法或快速盐析法提取DNA[1]。所获DNA纯度(260/ 280)A值为1.6～2.0。
二、扩增引物
根据1995年公布的HLA-Ⅰ类核苷酸序列[2]，参照Bunce等[3，4]、Bozon等[5]和Sadler等[6]报道的序列，自行设计A1～A74特异性引物30个、B7～B78特异性引物51个和阳性对照引物2个，由中国科学院上海Sangan公司合成，page纯化。引物的解链温度58 ℃～62℃，引物序列详见表1。引物的组成与反应格局、引物浓度、扩增产物大小和特异性，详见表2、表3。
, 百拇医药
表1 HLA-Ⅰ类抗原PCR-SSP分型引物序列 引物
编号
退火
位置
5′-末端引物序列
(5′→3′)
引物
编号
退火
位置
3′-末端引物序列
(5′→3′)
, 百拇医药
173
Ex2 5-25
ccactccatgaggtatttctt
127
Ex3 18-36
cgtcgcagccatacatcca
174
Ex2 168-186
ccggagtattgggacctgc
167
Ex3 216-233
, http://www.100md.com
gagccactccacgcaccg
187
Ex2 144-161
gcgccgtggatagagcaa
168
Ex3 216-233
gagccactccacgcacgt
188
Ex2 117-133
gccgcgagtccgaggac
170
, http://www.100md.com
Ex3 195-213
cctccaggtaggctctctg
189
Ex2 181-199
accggaacacacagatctg
171
Ex3 48-64
ccgcggaggaagcgcca
192
Ex2 181-199
accgggagacacagatctc
, http://www.100md.com
212
Ex3 195-213
cctccaggtaggctctgtc
193
Ex2 170-188
ggagtattgggaccggaac
213
Ex3 44-59
gaggaggcgcccgtcg
194
Ex2 195-212
, http://www.100md.com aacatgaaggcctccgcg
214
Ex3 76-92
cttgccgtcgtaggcgg
195
Ex2 180-199
gaccggaacacacagatctt
215
Ex3 77-95
atccttgccgtcgtaggct
197
, 百拇医药
Ex2 157-173
agcaggaggggccggaa
216
Ex3 92-111
cgttcagggcgatgtaatct
203
Ex2 192-210
cagatctacaaggcccagg
217
Ex3 201-218
cgtgccctccaggtaggt
, http://www.100md.com
204
Ex2 117-133
gccgcgagtccgagagg
218
Ex3 216-233
ggccactccacgcactc
205
Ex2 10-30
ccatgaggtatttctacaccg
219
Ex3 229-246
, 百拇医药
ccaggtatctgcggagcg
206
Ex2 180-199
gaccggaacacacagatcta
220
Ex3 260-276
ccgcgcgctccagcgtg
207
Ex2 221-233
ccgagagagcctgcggaa
221
, 百拇医药
Ex3 262-279
taccaggcgctccagct
208
Ex2 220-238
accgagagaacctgcggat
224
Ex3 18-36
cgtcgcagccatacatcac
209
Ex2 116-133
cgccgcgagtccgagaga
, 百拇医药
225
Ex3 184-201
ctctcagctgctccgcct
239
Ex3 63-80
gggtaccagcaggacgct
228
Ex3 68-85
tcgtaggcgtcctggtgg
240
Ex2 186-205
, http://www.100md.com gagacacagaagtacaagcg
229
Ex3 156-173
ctccaacttgcgctggga
242
Ex2 222-239
cgagagagcctgcggaac
232
Ex2 173-192
gtgtgttccggtcccaatat
243
, 百拇医药
Ex2 119-136
cgcgagtccgaggtggc
234
Ex2 246-264
cgctctggttgtagtagcg
246
Ex2 5-24
ccactccatgaggtatttcc
235
Ex4 168-187
gcccacttctggaaggttct
, 百拇医药
251
Ex2 227-244
ggacctgcggaccctgct
236
Ex3 11-28
ccatacatcgtctgccaa
271
Ex2 52-69
gggagccccgcttcatct
237
Ex2 229-245
, 百拇医药 gcgcaggttccgcaggc
272
Ex2 116-133
cgccacgagtccgaggaa
238
Ex3 216-233
gagccactccacgcacag
278
Ex2 227-244
gagcctgcggaccctgct
241
, 百拇医药
Ex3 120-136
gccgcggtccaggagct
280
Ex2 76-94
gctacgtggacgacacgct
244
Ex3 228-245
caggtatctgcggagccc
284
Ex2 174-192
tattgggacgaggagacag
, 百拇医药
249
Ex3 195-213
cctccaggtaggctctcaa
286
Ex2 113-130
cgacgccgcgagccagaa
250
Ex2 225-242
gcaggttccgcaggctct
290
Ex2 191-209
, 百拇医药
acggaatgtgaaggcccag
277
Ex3 44-60
ggaggaagcgcccgtcg
291
Ex2 111-127
agcgacgccgcgagcca
281
Ex2 207-225
ctcggtcagtctgtgcctt
292
, 百拇医药
Ex2 166-184
ggccggagtattgggacga
282
Ex2 207-226
tctcggtaagtctgtgcctt
294
Ex2 210-229
tcacagactgaccgagagag
285
Ex3 69-86
gtcgtaggcgtcctggtc
, 百拇医药
295
Ex2 37-53
cccggcccggcagtgga
298
Ex3 80-100
atgtaatccttgccgtcgtaa
296
Ex2 149-167
gtggatagagcaggagggt
299
Ex3 212-229
, 百拇医药
cactccacgcacgtgcca
367
Ex2 249-268
tactacaaccagagcgagga
300
Ex3 105-123
agcgcaggtcctcgttcaa
434
Ex2 5-25
ccactccatgaggtatttcac
301
, 百拇医药
Ex3 71-88
ccgtcgtaggcgtgctgt
435
Ex2 230-246
cctgcgcaccgcgctcc
302
Ex3 110-128
ccaagagcgcaggtcctct
451
Ex3 63-80
gggtaccggcaggacgct
, 百拇医药
394
Ex3 20-39
ccacgtcgcagccatacatt
429
Ex2 186-205
gccttcacattccgtgtgtt
C5
Ex3 519-537
tgccaagtggagcacccaa
431
Ex3 216-232
, 百拇医药
agcccgtccacgcaccg
C3
Ex4 579-598
gcatcttgctctgtgcagat
486
Ex2 184-203
cttcacattccgtgtctcct
表2 HLA-A位点PCR-SSP分型反应格局、引物浓度、扩增产物大小与特异性 条带
编号
5′-端引物
3′-端引物
, http://www.100md.com
产物大
小(bp)
特异性
编号
浓度
(μmol/L)
编号
浓度
(μmol/L)
1
286
1.0
431
, 百拇医药
1.0
629
A1(0101，0102)
2
296
3.0
302
3.0
489
A2(0201-0217)
3
291
1.0
, http://www.100md.com
299
1.0
628
A3(0301，0302)
4
284
1.0
302
1.0
464
A23，24(2301，2401-2407)
5
292
, 百拇医药
3.0
249
3.0
557
A23(2301)
6
292
1.0
170
1.0
557
A24(2402-2407)
7
, 百拇医药
193
1.0
298
1.0
440
A25，26，34，66
(2501，2601-
2605，6601，6602，3401，3402)
8
294
3.0
298
, 百拇医药
3.0
400
A25(2501)
9
367
1.0
394
1.0
300
A1，11，36，80(01，11，3601，8001)
10
290
1.0
, 百拇医药
167
1.0
552
A11，66(1101，1102，6601)
11
290
2.0
302
2.0
447
A28(6801，6802，6901)
12
, 百拇医药 290
2.0
171
2.0
383
A69(6901)
13
174
2.0
300
2.0
465
A29(2901，2902)
, 百拇医药
14
295
2.0
301
2.0
561
A30(3001-3005)
15
434
3.0
486
3.0
198
, 百拇医药
A31(31011,31012)
16
173
3.0
234
3.0
259
A32(3201)
17
434
3.0
429
3.0
, 百拇医药
200
A33(3301-3303)
18
239/451
3.0
168
3.0
170
A34(3401,3402)
19
286
2.0
168
, http://www.100md.com
2.0
630
A36(3601)
20
173
2.0
300
2.0
628
A74,32
(7401,3201)
C5
0.1
, http://www.100md.com
C3
0.1
796
control
三、扩增条件
1.反应混合物：A位点引物组成20个PCR反应， B位点引物组成41个PCR反应。每份样本同时62管PCR反应(1管阴性对照)。每个反应体系总量25 μl。包括0.75×PCR Buffer (37.5 mmol/L KCl，7.5 mmol/L Tris)、1.5 mmol/L MgCl2、0.5U Taq酶(均为美国PE公司原装产品)、200 μmol/L dNTP、3%DMSO、1～3 μmol/L特异引物、0.1 μmol/L对照引物、50～100ng的模板DNA。
2.扩增温度：95 ℃预温2分钟，然后三温循环共计30个循环。A位点95℃30秒、65 ℃50秒、72 ℃50秒， 5个循环；95 ℃30秒、62 ℃50秒、72 ℃50秒，5个循环；95 ℃30秒、60 ℃ 50秒、72 ℃50秒， 20个循环。B位点95 ℃30秒、65 ℃45秒、72 ℃45秒，5个循环；95 ℃30秒、60 ℃50秒、72 ℃50秒，20个循环；95 ℃30秒、55 ℃60秒、72 ℃2分钟， 5个循环。最后72 ℃保温5分钟。
, http://www.100md.com
3.扩增仪：美国PE公司9600型扩增仪。
四、电泳
1×TAE缓冲液配制含0.5 μg/ml溴乙锭的2%琼脂糖凝胶，扩增产物10 μl点样，按15V/cm稳压电泳25分钟，紫外光下观察结果。结果
一、标准DNA分型结果
由美国UCLA配型中心提供的62份标准DNA，采用本文建立的PCR-SSP方法单盲分型，结果完全相符。可分辨的A位点等位基因特异性包括A1～A74共19个，B位点等位基因特异性包括B7～B78共41个以及Bw4、Bw6两大组。特异性阳性扩增产物大小与表2、表3计算值相同，见图1，图2。
二、临床样本分型结果
所有345份临床样本DNA，采用PCR-SSP行HLA-Ⅰ类分型均获得成功。共检出A位点等位基因总数635个，其中纯合子55例(占15.9%)，杂合子290例；B位点等位基因总数625个，其中纯合子65例(占18.8%)，杂合子280例。无假阳性和假阴性出现。阳性对照和各等位基因特异性扩增产物大小与表2、表3计算值完全相同。检测所需时间为5小时，包括模板DNA提取2小时，扩增2小时，其他1小时。
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本方法可分辨的A抗原特异性19个、B抗原特异性41个。实际检出汉族南方籍人群的A抗原特异性13个，其中A23、A25、A34、A36、A66、A69等6个位点无阳性样本；B抗原特异性32个，其中B18、B41、B45、B47、B64、B65、B71、B72、B78等九个位点无阳性样本。汉族南方籍人群中， A位点的等位基因频率分布较为集中，最常见的等位基因频率为A2、A11和A24，分别占26.9%、23.1%和22.0%。B位点的等位基因频率分布较为分散，常见的等位基因频率为B60、B13、B62、B46、B51和B58，分别占13.7%、9.7%、8.1%、7.5%、7.5%和7.1%。
345份临床样本与血清学分型的初步比较显示:血清学A位点总误差31例，误差率9.0%，包括16个血清学空白位点(血清学仅分辨出一个A位点)，经DNA分型证实存在另一个A位点。15个血清学A位点分型结果与DNA分型结果不同，经重复实验证实血清学分型错误。B位点血清学分型总误
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表3 HLA-B位点PCR-SSP分型反应格局、引物浓度、扩增产物大小与特异性 条带
编号
5′-端引物
3′-端引物
产物大小
(bp)
特异性
编号
浓度(μmol/L)
编号
浓度(μmol/L)
1
, 百拇医药
208
3.0
216
3.0
401
B51,B52(5101-5105,52011,52012)
2
192
3.0
216
3.0
440
B52(52011,52012)
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3
193
3.0
221
3.0
619
B7(0701-0705,8101)
4
195
3.0
221
3.0
606
, 百拇医药
B8(0801,0802)
5
272
3.0
285
3.0
480
B44(4402-4404)
6
246
3.0
215
3.0
, 百拇医药
600
B45,B21(4501,4901,5001)
7
280
3.0
225
3.0
635
B21(4901,5001,4005
,2704,2706,B45v)
8
208
, 百拇医药
3.0
215
3.0
385
B49,B59(4901,5901)
9
243
3.0
215
3.0
488
B13(1301-1303)
10
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197
3.0
127
3.0
389
B64,B65(1401,1402)
11
205
3.0
232
3.0
182
B65(1402,3904)
, 百拇医药
12
243
2.0
250
2.0
123
B62,75,76(1501-1508,1511-1515,1519-1521)
13
192
3.0
214
3.0
, 百拇医药 421
B62,72,76(1501-1507,1512/14/19/20)
14
243
3.0
219/244
3.0
636
B76(1512,1514,1519)
15
194
3.0
, 百拇医药
225
3.0
516
B63(1516,1517)
16
207
3.0
216
3.0
400
B78(7801,7802,1509)
17
208/435
, 百拇医药
3.0
217
3.0
498
B38(3801,3802)
18
207
3.0
217
3.0
507
B39,B67(3901-3908,6701)
19
, 百拇医药
206
3.0
217
3.0
548
B67(67011,67012)
20
194
3.0
224
3.0
351
B57(5701-5703)
, 百拇医药
21
194
3.0
213
3.0
374
B58(5801-5803)
22
187
3.0
214
3.0
458
, 百拇医药
B18(1801,1802)
23
203
3.0
215
3.0
413
B22(5401,5501,5502,5601,5602)
24
204
3.0
236
, 百拇医药 3.0
421
B54(5401)
25
203
3.0
238
3.0
551
B56(5601,5602)
26
280
2.0
, 百拇医药
281/282
2.0
149
B27(2701-2709)
27
195
3.0
213/277
3.0
389
B35,B53(3501-3511,5301)
28
, 百拇医药
188
3.0
237
3.0
128
B35,18,78,70(3501-3513,18,7801,7802,1522)
29
188
3.0
212
3.0
606
, 百拇医药
B37(3701)
30
192
3.0
220
3.0
605
B41(4101,4102)
31
203
3.0
220
3.0
, 百拇医药
594
B42(4201,42v)
32
240
3.0
241
3.0
459
B46(4601)
33
192
3.0
228
, http://www.100md.com
3.0
414
B47(4701)
34
209
3.0
229
3.0
567
B48(4801,8101)
35
280
2.0
, 百拇医药
229
2.0
607
B60(40011,40012,4007)
36
272
3.0
218
3.0
627
B40,B47(40011-4008,4701)
37
, http://www.100md.com
271
3.0
238
3.0
691
B70,B48(1503/9/10/18/23/29,72v,4802)
38
189
3.0
238
3.0
562
, 百拇医药 70,B71(no72)(1509,1510,1518,1521)
39
209
3.0
214
3.0
486
B72(1503,1518,72,4802)
40
435/208/251/278
3.0
235
, 百拇医药
3.0
1330
Bw4
41
242
3.0
235
3.0
1340
Bw6
C5
0.1
C3
, 百拇医药
0.1
796
control
差37例，误差率10.7%，包括19个血清学空白位点，经DNA分型证实存在另一个B位点，18个B位点血清学分型结果与DNA结果不同，重复实验证实血清学分型错误。
三、重复性实验与分型结果验证
1.重复性实验：选择20份标准DNA和20份不同位点的临床样本DNA，每位点重复实验5次，均获得相同的分型结果，重复率100%。
2.标准DNA证实:临床样本DNA与标准DNA同时、同条件进行PCR-SSP分型，其特异性扩增产物条带完全相同。
3.本实验检出的中国汉族南方籍人群A位点和B位点等位基因阳性样本DNA共40份，随机编号，送美国UCLA配型中心DNA实验室进行双盲验证，其分型结果完全相同。
, 百拇医药
M：分子量标志，N：阴性对照，条带1～20分别为A1～A74分型的特异性扩增产物(表2).产物片段长度范围170～630 bp不等.每个PCR反应体系包括内源性阳性对照(796 bp)图1 HLA-A抗原PCR-SSP分型结果
M：分子量标志，N：阴性对照，条带1～41分别为 B5～B78和Bw4, Bw6分型的特异性扩增产物(表3).产物片段长度范围123～1340 bp不等.每个PCR反应体系包括内源性阳性对照(796 bp)图2 HLA-B抗原PCR-SSP分型结果
讨论
本项研究根据最新公布的Ⅰ类分子核苷酸碱基序列，结合中国汉族人群基因频率分布特点，设计合成81个特异性引物，组成20个PCR反应用于A位点分型、41个PCR反应用于B位点分型，建立一步法PCR-SSP技术DNA分型方法。62份标准DNA和345份临床样本的实验研究结果显示，所有样本的DNA分型均获得成功，能够分辨出所有血清学方法能够分辨出的等位基因，而且对血清学存在明显交叉反应而难以确定或不能分辨的，也能作出准确地分型。如血清学对A19分裂子的确定，对B57、B58和B63，B38、B39和B67，以及B60、B61和B48等的分辨常常出现误差或错判，而本方法能够很容易地分辨出来。血清学对A34、A66、A69和A74， B35组和B40组的分型，至今缺乏理想的单特异性抗血清，而采用本方法能够作出准确的分型。分型结果经标准DNA验证和美国UCLA配型中心双盲验证完全符合，40份样本的重复性实验显示其重复率为100%。因此，本方法实际上是一种分辨度较高的DNA分型方法，结果精确可靠，分辨度显著高于血清学方法。本研究根据设计引物的反应格局组合引物混合物，一步法，一次扩增，立即可获得A、B位点的分型结果，总耗时为5小时，与血清学方法相同而结果更加精确可靠，使其临床应用成为可能。此外，DNA分型不需要血清学必备的活细胞，临床样本采集方便，试剂来源方便易得。本项研究的实验条件采用3种不同的退火温度，先高后低，既保证了扩增产物的特异性，又增加了灵敏性;同时设立内源性阳性对照，确保了每个PCR反应体系的准确无误。当然，本方法也存在自身的不足，突出的问题是目前难以应付临床大样本量的检测，如筛选异基因骨髓移植的供者。由于每份样本要同时进行62管PCR反应，国内现有的实验室一般一次只能检测3份样本。推荐解决的办法是先用血清学方法筛选出合适的供者，再用DNA分型确认;对于血清学的空白位点和难以肯定的位点，采用DNA分型来证实。
, 百拇医药
参考文献
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, 百拇医药
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(收稿：1998-01-19 修回：1998-06-16), 百拇医药