腺病毒载体介导人PML基因在人前列腺癌细胞的高效转染和表达
作者：贺大林 Chang Kun-Sang 南勋义 Chung Leland W.K.
单位：
关键词：
中华医学杂志/981010 早幼粒细胞白血病基因(Promyelocytic leukemia, PML)编码的蛋白质是一种广谱的细胞生长抑制因子，在多种肿瘤细胞中过度表达能够有效地抑制细胞生长和裸鼠体内致瘤能力。在前列腺癌、乳腺癌及结肠癌中的表达变化可能与肿瘤的分化、局部浸润和转移有关。我们采用人腺病毒载体将人PML基因导入体外培养的人前列腺癌细胞，以研究外源PML基因导入人前列腺癌细胞的可能性，为前列腺癌的基因治疗提供有益的探索。
一、材料与方法
1.PML重组腺病毒(Ad-PML)、β-半乳糖苷酶重组腺病毒及只含空载体的重组腺病毒(Ad-对照)均由Dr.Chang实验室提供。
, 百拇医药
2.细胞培养：前列腺癌细胞LNCaP、DU145和PC-3常规培养在RPMI-1640培养液中，含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，37 ℃、5% CO2开放培养。
3.β-Gal染色检测重组腺病毒对前列腺癌细胞的感染能力。LNCaP、DU145、PC-3细胞分别培养在60mm培养皿中，24小时后，用β-半乳糖苷酶重组腺病毒按不同浓度感染细胞24小时，固定、反应、染色、计数核蓝染细胞百分比。评估LNCaP、DU145和PC-3细胞的病毒感染能力。
4.聚合酶链反应(PCR)、Western Blot和免疫荧光染色检测PML基因转染及蛋白表达：按前述方法培养LNCaP、DU145和PC-3细胞，24小时后，用Ad-PML和Ad-对照分别感染细胞24小时，消化、离心细胞，备用。
(1) PCR：分别取少许上述不同细胞提取DNA於PCR仪循环30个周期，PCR产物经1%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml EB)电泳分离DNA片段。
, 百拇医药
(2) 免疫荧光染色：取上述少许不同细胞，用Cytospin仪固定细胞到载玻片上，干燥、固定，用兔抗人PML抗体(一抗)、荧光素标记鼠抗兔抗体(二抗)按文献[1]方法进行免疫荧光染色。
(3) Western Blot：剩余上述不同细胞，用RIPA缓冲液裂解细胞，提取总蛋白，用美国Bio-Rad公司试剂盒测定蛋白浓度，取40 μg蛋白经8% SDS-PAG电泳和电转移，用兔抗人PML抗体与之杂交，用ECL试剂盒(美国Amersham公司)检测杂交结果。
二、结果
1.LNCaP、DU145、PC-3细胞转染效率测定：结果显示不同前列腺细胞对腺病毒感染有不同的敏感性。LNCaP细胞转染效率最高，DU145细胞次之，PC-3细胞转染效率较低，提示LNCaP和DU145细胞对腺病毒感染效率高于PC-3细胞。
2.腺病毒载体介导的PML基因转染及其蛋白表达：PCR检测结果显示感染Ad-PML的LNCaP、PC-3和DU145中都可检测到580bp的PML cDNA特异性片段，而感染Ad-对照的细胞中则测不到。证实了腺病毒载体成功地将外源PML基因转染到了前列腺癌细胞中。
, http://www.100md.com
经Western Blot和免疫荧光染色检测证实感染Ad-PML后的LNCaP、DU145、PC-3细胞中均有PML蛋白的高效表达，证实了腺病毒载体不但可以成功地介导外源PML基因到前列腺癌细胞中，而且可以使其蛋白在细胞中得以高效表达(附图)。
附图 免疫荧光法检测PML蛋白结果
注A、C、E分别为未感染Ad-PML的LNCap、DU145、PG-3
B、D、F分别为感染Ad-PML的LNCap、DU145、PG-3
感染Ad-PML的细胞PML蛋白表达明显增强。
三、讨论
通过导入抑癌基因及其它相关基因作为基因治疗的基础研究和动物实验都已取得了可喜的进步[2，3]。腺病毒载体克服了逆转录病毒作为载体的诸多缺点，具有携带大片段外源DNA(36 kb)的潜力；很高的体外培养增殖滴度(1010pfu/ml)；能感染分裂期后的非复制性细胞；不具致癌原性等，是比较理想的外源基因介导载体。
, 百拇医药
位于15号染色体上的PML基因编码的蛋白质是一种广谱的生长抑制因子，对包括白血病细胞和一些实体瘤细胞在内的多种肿瘤细胞具有抑制生长的作用[4，5]。我们应用Ad-PML研究观察了重组腺病毒对不同前列腺癌细胞的基因转染能力。结果表明重组人腺病毒载体可以成功地介导外源PML基因到人前列腺癌细胞中并且可使其高效表达。这不仅为研究PML生长抑制因子对前列腺癌细胞的作用建立了有用的模型，而且为PML生长抑制因子用于肿瘤基因治疗研究提供了有益的探索。
参考文献
1 Le XF, Yang P, Chang K S. Analysis of the growth and transformation suppressor domains of PML. J Biol Chem, 1996, 271：130-135.
2 Kleinerman DI, Zhang WW, Lin SH, et al. Application of a tumor suppressor (C-CAM1)-expressing recombinant adenovirus in androgen-independent human prostate cancer therapy: a preclinical study. Cancer Res. 1995, 55：2831-2836.
, 百拇医药
3 Srivastava S, Katayose D, Tong YA, et al. Recombinant adenovirus vector expressing wild-type P53 is a potent inhibitor of prostate cancer cell proliferation. Urology, 1995, 46：843-848.
4 Liu, J-H, Mu Z-M, Chang, KS. PML suppresses oncogenic transformation of NIH/3T3 cells by activated neu. J Exp Med. 1995, 181：1965-1973.
5 Koken M H M, Cruz G L, Quignon F, et al. The PML growth-suppressor has an altered expression in human oncogenesis. Oncogene, 1995, 10：1315-1324., http://www.100md.com
单位：
关键词：
中华医学杂志/981010 早幼粒细胞白血病基因(Promyelocytic leukemia, PML)编码的蛋白质是一种广谱的细胞生长抑制因子，在多种肿瘤细胞中过度表达能够有效地抑制细胞生长和裸鼠体内致瘤能力。在前列腺癌、乳腺癌及结肠癌中的表达变化可能与肿瘤的分化、局部浸润和转移有关。我们采用人腺病毒载体将人PML基因导入体外培养的人前列腺癌细胞，以研究外源PML基因导入人前列腺癌细胞的可能性，为前列腺癌的基因治疗提供有益的探索。
一、材料与方法
1.PML重组腺病毒(Ad-PML)、β-半乳糖苷酶重组腺病毒及只含空载体的重组腺病毒(Ad-对照)均由Dr.Chang实验室提供。
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2.细胞培养：前列腺癌细胞LNCaP、DU145和PC-3常规培养在RPMI-1640培养液中，含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，37 ℃、5% CO2开放培养。
3.β-Gal染色检测重组腺病毒对前列腺癌细胞的感染能力。LNCaP、DU145、PC-3细胞分别培养在60mm培养皿中，24小时后，用β-半乳糖苷酶重组腺病毒按不同浓度感染细胞24小时，固定、反应、染色、计数核蓝染细胞百分比。评估LNCaP、DU145和PC-3细胞的病毒感染能力。
4.聚合酶链反应(PCR)、Western Blot和免疫荧光染色检测PML基因转染及蛋白表达：按前述方法培养LNCaP、DU145和PC-3细胞，24小时后，用Ad-PML和Ad-对照分别感染细胞24小时，消化、离心细胞，备用。
(1) PCR：分别取少许上述不同细胞提取DNA於PCR仪循环30个周期，PCR产物经1%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml EB)电泳分离DNA片段。
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(2) 免疫荧光染色：取上述少许不同细胞，用Cytospin仪固定细胞到载玻片上，干燥、固定，用兔抗人PML抗体(一抗)、荧光素标记鼠抗兔抗体(二抗)按文献[1]方法进行免疫荧光染色。
(3) Western Blot：剩余上述不同细胞，用RIPA缓冲液裂解细胞，提取总蛋白，用美国Bio-Rad公司试剂盒测定蛋白浓度，取40 μg蛋白经8% SDS-PAG电泳和电转移，用兔抗人PML抗体与之杂交，用ECL试剂盒(美国Amersham公司)检测杂交结果。
二、结果
1.LNCaP、DU145、PC-3细胞转染效率测定：结果显示不同前列腺细胞对腺病毒感染有不同的敏感性。LNCaP细胞转染效率最高，DU145细胞次之，PC-3细胞转染效率较低，提示LNCaP和DU145细胞对腺病毒感染效率高于PC-3细胞。
2.腺病毒载体介导的PML基因转染及其蛋白表达：PCR检测结果显示感染Ad-PML的LNCaP、PC-3和DU145中都可检测到580bp的PML cDNA特异性片段，而感染Ad-对照的细胞中则测不到。证实了腺病毒载体成功地将外源PML基因转染到了前列腺癌细胞中。
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经Western Blot和免疫荧光染色检测证实感染Ad-PML后的LNCaP、DU145、PC-3细胞中均有PML蛋白的高效表达，证实了腺病毒载体不但可以成功地介导外源PML基因到前列腺癌细胞中，而且可以使其蛋白在细胞中得以高效表达(附图)。
附图 免疫荧光法检测PML蛋白结果
注A、C、E分别为未感染Ad-PML的LNCap、DU145、PG-3
B、D、F分别为感染Ad-PML的LNCap、DU145、PG-3
感染Ad-PML的细胞PML蛋白表达明显增强。
三、讨论
通过导入抑癌基因及其它相关基因作为基因治疗的基础研究和动物实验都已取得了可喜的进步[2，3]。腺病毒载体克服了逆转录病毒作为载体的诸多缺点，具有携带大片段外源DNA(36 kb)的潜力；很高的体外培养增殖滴度(1010pfu/ml)；能感染分裂期后的非复制性细胞；不具致癌原性等，是比较理想的外源基因介导载体。
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位于15号染色体上的PML基因编码的蛋白质是一种广谱的生长抑制因子，对包括白血病细胞和一些实体瘤细胞在内的多种肿瘤细胞具有抑制生长的作用[4，5]。我们应用Ad-PML研究观察了重组腺病毒对不同前列腺癌细胞的基因转染能力。结果表明重组人腺病毒载体可以成功地介导外源PML基因到人前列腺癌细胞中并且可使其高效表达。这不仅为研究PML生长抑制因子对前列腺癌细胞的作用建立了有用的模型，而且为PML生长抑制因子用于肿瘤基因治疗研究提供了有益的探索。
参考文献
1 Le XF, Yang P, Chang K S. Analysis of the growth and transformation suppressor domains of PML. J Biol Chem, 1996, 271：130-135.
2 Kleinerman DI, Zhang WW, Lin SH, et al. Application of a tumor suppressor (C-CAM1)-expressing recombinant adenovirus in androgen-independent human prostate cancer therapy: a preclinical study. Cancer Res. 1995, 55：2831-2836.
, 百拇医药
3 Srivastava S, Katayose D, Tong YA, et al. Recombinant adenovirus vector expressing wild-type P53 is a potent inhibitor of prostate cancer cell proliferation. Urology, 1995, 46：843-848.
4 Liu, J-H, Mu Z-M, Chang, KS. PML suppresses oncogenic transformation of NIH/3T3 cells by activated neu. J Exp Med. 1995, 181：1965-1973.
5 Koken M H M, Cruz G L, Quignon F, et al. The PML growth-suppressor has an altered expression in human oncogenesis. Oncogene, 1995, 10：1315-1324., http://www.100md.com