血管紧张素Ⅱ2型受体抑制成纤维细胞增殖和纤维连接蛋白分泌
作者：李文歌 陈香美 叶一舟 傅博
单位：100853 北京，中国人民解放军总医院肾科，中国人民解放军肾病中心重点实验室。
关键词：受体，血管紧张素；成纤维细胞；血管紧张素Ⅱ
中华医学杂志/981005 【摘要】 目的 研究血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2)对1型受体(AT1)介导的细胞增殖和纤维连接蛋白分泌的影响。方法 分别从AT2受体基因缺失和正常基因型的16天孕龄胎鼠培养皮肤成纤维细胞，观察两种成纤维细胞在血管紧张素Ⅱ(10-8mol/L)刺激下细胞增殖和产生纤维连接蛋白的情况。结果 在血管紧张素Ⅱ刺激下，AT2受体缺失组的成纤维细胞(0.462±0.026)增殖能力明显强于正常组成纤维细胞(0.389±0.021，P<0.01)，纤维连接蛋白基因及蛋白质表达与正常组成纤维细胞比较显著增加，(34.1±4.1)%、(16.2±2.3)%(P<0.01)。结论 AT2受体对AT1受体介导的细胞增殖和分泌纤维连接蛋白有一定的抑制作用。
, 百拇医药
AngiotensinⅡtype 2 receptor inhibits type 1 receptor-induced cell proliferation and fibronectin release in mouse fibroblasts
Li Wenge, Chen Xiangmei, Ye Yizhou, et al.
Department of Nephrology, General Hospital of PLA, Center of Nephrology and Key Laboratory of PLA, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To investigate the effects of angiotensinⅡtype 2 receptor (AT2) on the cell proliferation and fibronectin release induced by angiotensinⅡtype 1 receptor (AT1). Method Fibroblats were cultured from embryonic skin of AT2 receptor gene knocked-out mice (AT2-/-) and wild-type mice (AT2+/+) after 16 days of gestation, respectively. Cell proliferation and fibronectin release were examined in the fibroblasts treated with 10-8mol/L angiotensinⅡ. Results Cell proliferation rate was increased more markedly in the AT2-/- fibroblasts than in the AT2+/+ fibroblasts after treament with angiotensinⅡ(0.462±0.026 VS 0.389±0.021，P<0.01). Also, fibronectin release and its gene expression were significantly enhanced in the AT2-/- fibroblasts as compared with the AT2+/+ fibroblasts when exposed to angiotensinⅡ(34.1±4.1)%vs(16.2±2.3)%，P<0.01). Conclusion The AT2 receptor can inhibit the cell proliferation and fibronectin release induced by the AT1 receptor.
, 百拇医药
【Key words】 Receptor angiotensin Fibroblasts Angiotensin Ⅱ
(Natl Med J China, 1998, 78：738-740)
血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)1型(AT1)和2型(AT2)受体间的拮抗作用是目前肾素-血管紧张素系统的研究热点之一[1]。对AT2受体的早期研究发现，在哺乳类动物中，AT2受体基因的表达具有独特性，即在胚胎的各种组织中存在着丰富的AT2受体mRNA，出生后则急剧下降[2]，因此许多学者推测AT2受体可能主要与组织器官的发育有关。对AT2受体的基因敲除(gene knock out)研究发现，在AT2受体基因缺失小鼠中，收缩压和舒张压均有一定程度的升高[3]。最近，利用细胞转基因技术研究亦发现，将构建的AT2受体基因表达载体导入细胞内，AT2受体表达的增高能拮抗宿主细胞的增殖、诱发细胞的凋亡[4]。
, 百拇医药
本研究通过从AT2受体基因缺失和正常胎鼠培养皮肤成纤维细胞，观察了AT2受体缺失对AT1受体介导的成纤维细胞增殖和分泌纤维连接蛋白(FN)的影响。
材料与方法
一、材料
AT2受体基因缺失(以AT2-/-表示)小鼠和用于产生AT2基因缺失的正常小鼠(AT2+/+，C57BL/6系)均由美国Vanderbilt大学生化系Inagami[3]教授馈赠。
二、方法
1.胎鼠皮肤成纤维细胞的培养和鉴定[5，6]：以10周龄AT2-/-雄性和雌性小鼠交配，雌鼠怀孕16天时断颈处死，取出胎鼠，培养AT2-/-成纤维细胞。同时培养AT2+/+胎鼠皮肤成纤维细胞作为实验对照。两种成纤维细胞经α平滑肌肌动蛋白和波形蛋白(vimentin)抗体鉴定，纯度分别是97%和96%。
, 百拇医药
2.细胞增殖检测：将AT2-/-和AT2+/+两种胎鼠皮肤成纤维细胞按3×103个细胞/孔种植于96孔细胞培养板，采用四甲基偶氮多胍(MTT, 5mg/ml)掺入法检测细胞的增殖状况。
3.细胞培养上清中FN的测定：将成纤维细胞按5×103个细胞/孔种植于96孔细胞培养板，至24小时换为无血清DMEM培养基，12小时移弃，再分别加入无血清DMEM和含10-8mol/L AngⅡ的无血清DMEM培养基，48小时收集培养上清，采用双抗体夹心ELISA方法测定上清中FN的含量。
4.FN基因表达的逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测：用RNAzolBTM液分别从AT2-/-和AT2+/+两种胎鼠皮肤成纤维细胞提取总RNA，取10 μg总RNA进行逆转录，取1 μl逆转录产物进行PCR扩增，FN正义引物序列为：5′-GATGTGGATGTCGATTCCAT-3′(20bp)，反义序列为：5′-GATCTCTGGTCCATGAAGAT-3′ (20bp)，退火温度为50℃，扩增长度为1 107 bp，同时加入三磷酸甘油醛脱氢酶(G3PDH)引物作为内参照进行共同扩增反应。在1%琼脂糖凝胶中电泳观察PCR产物并用计算机凝胶图象分析系统进行吸光度分析。
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5.FN基因表达的Northern印迹杂交分析：20 μg总RNA在1%琼脂糖凝胶中电泳后，将RNA转移至尼龙膜上，用32P-dCTP标记FN cDNA探针。去除尼龙膜上的同位素后，再与G3PDH cDNA探针杂交，检测尼龙膜上各样本总RNA的上样量。杂交结果用计算机图象分析系统进行吸光度分析。
6.统计学处理：两组间比较用t检验，数据以均数±标准差表示。
结果
1. 两种成纤维细胞的增殖状况：在AngⅡ刺激下，AT2-/-胎鼠成纤维细胞的增殖能力明显强于AT2+/+成纤维细胞(附表)。
2.成纤维细胞培养上清中FN含量：AT2受体基因缺失后，成纤维细胞在AngⅡ刺激下产生的FN量明显多于正常成纤维细胞(附表)，说明AT2受体的存在，对细胞分泌FN有一定抑制作用。
, 百拇医药
附表 胎鼠皮肤成纤维细胞增殖及分泌FN情况(
±s) 培养基
鼠数
成纤维细胞数量(A)
FN(A)
P
AT2+/+
AT2-/-
AT2+/+
AT2-/-
无血清
6
, 百拇医药
0.318
±0.017
0.321
±0.019
0.338
±0.029
0.334
±0.025
>0.05
无血清
+AngⅡ
6
0.389
, 百拇医药
±0.021
0.462
±0.026
0.429
±0.031
0.578
±0.040
<0.01
3.FN mRNA表达的RT-PCR检测结果：在AngⅡ刺激下，AT2-/-胎鼠皮肤成纤维细胞FN的mRNA水平明显高于AT2+/+成纤维细胞，表明AT2受体缺失后，AngⅡ刺激细胞FN基因表达的作用明显增强。AT2-/-和AT2+/+成纤维细胞FN的RT-PCR结果分别为(48±6)%、(30±5)%(P<0.01 图1)。
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1.marker 2.AT2+/+成纤维细胞，无血清DMEM培养基；3.AT2-/-成纤维细胞，无血清DMEM培养基；4.AT2+/+成纤维细胞，加AngⅡ；5.AT2-/-成纤维细胞，加AngⅡ图1 FN mRNA表达的RT-PCR检测结果
4. FN mRNA表达的Northern印迹杂交结果：AT2受体缺失后，AngⅡ诱导的成纤维细胞FN的mRNA水平明显升高，进一步证实了上述RT-PCR的实验结果。AT2-/-和AT2+/+成纤维细胞FN mRNA的水平分别为(34.1±4.1)%和(16.2±2.3)%(P<0.01 图2)。
注：1.AT2+/+成纤维细胞；2.AT2-/-成纤维细胞图2 FN mRNA表达的Northern印迹杂交结
讨论
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AT2受体能否多方面地拮抗AT1受体的功能，是当前肾素-血管紧张素系统研究面临的主要研究任务之一[7]。前期大量的研究已证实，AT1受体能促进细胞的增殖和细胞外基质的产生，作为AT1受体的对立面，AT2受体是否能够拮抗AT1受体介导的上述功能则目前尚少见研究报道。
肾素-血管紧张素系统是一个反馈调节系统，近年来，通过对肾素-血管紧张素系统的基因敲除研究也充分证实了这一点，如血管紧张素原、血管紧张素转化酶和AT1A受体基因缺失后均可引起肾素代偿性地产生增加[8]，由此，我们推测AT2受体缺失后AngⅡ刺激细胞的作用有可能也发生改变。我们首先观察了AT2受体缺失后对成纤维细胞增殖的作用，结果发现在AngⅡ刺激下，AT2-/-成纤维细胞的增殖能力明显强于AT2+/+成纤维细胞。纤维连接蛋白不仅是细胞外基质的重要成分，同时也是一种重要的调理素介质，通过与整合素(如VLA5等)结合，在介导细胞增殖和器官硬化的发生中起着重要作用，因此，我们选择了纤维连接蛋白作为研究对象，分别采用了RT-PCR(敏感)和Northern印迹杂交(特异性强)两种方法，观测了纤维连接蛋白的基因表达，同时应用ELISA的方法检测了成纤维细胞纤维连接蛋白的分泌，发现AT2受体缺失的成纤维细胞其产生的纤维连接蛋白，无论是在蛋白质还是mRNA水平均有明显增加。
, 百拇医药
本实验结果表明，AT2受体的存在，对AT1受体介导的细胞增殖和分泌纤维连接蛋白有一定的抑制作用，进而说明在细胞增殖和产生细胞外基质方面AT1和AT2受体间可能有拮抗作用。
本课题为国家自然科学优秀中青年专项基金资助项目(编号39421005)
参考文献
1 Celband CH, Zhu M, Lu D, et al. Functional interaction between neuronal AT1 and AT2 receptors. Endocrinology, 1997, 138:2195-2198.
2 Kakuchi J, Ichiki T, Kiyama S, et al. Developmental expression of renal angiotensinⅡ receptor genes in the mouse. Kidney Int, 1995, 47:140-147.
, 百拇医药
3 Ichiki T, labosky PA, Shiota C, et al. Effects on blood pressure and exploratory behavior of mice lacking angiotensinⅡ receptor. Nature, 1995, 377：748-750.
4 Yamada T, Horiuchi M, Dzau VJ. et al. AngiotensinⅡtype 2 receptor mediates programmed cell death. Proc Natl Acad Sci, 1996, 93:156-160.
5 Hogan B, Beddington R, Costantini F, et al. Mouse embryo fibroblasts as feeder layers. In: Hogan B, Beddington R, Costantini F, eds. Manipulating the mouse embryo, 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994, F260.
, 百拇医药
6 李文歌，陈香美，程庆砾，等.用共培养体系观察缺氧肾小管上皮细胞对成纤维细胞的调节作用. 中华内科杂志，1996，35: 810-813.
7 Douglas JG. The curtain rise on the renin-angiotensin system: AT2 receptors are in the spotlight. J Clin Invest, 1996, 97:1787.
8 陈香美，李文歌. 肾素-血管紧张素系统基因打靶研究现状. 中华肾脏病杂志，1996，12:383-385.
(收稿：1997-09-08 修回：1998-08-03), 百拇医药
单位：100853 北京，中国人民解放军总医院肾科，中国人民解放军肾病中心重点实验室。
关键词：受体，血管紧张素；成纤维细胞；血管紧张素Ⅱ
中华医学杂志/981005 【摘要】 目的 研究血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2)对1型受体(AT1)介导的细胞增殖和纤维连接蛋白分泌的影响。方法 分别从AT2受体基因缺失和正常基因型的16天孕龄胎鼠培养皮肤成纤维细胞，观察两种成纤维细胞在血管紧张素Ⅱ(10-8mol/L)刺激下细胞增殖和产生纤维连接蛋白的情况。结果 在血管紧张素Ⅱ刺激下，AT2受体缺失组的成纤维细胞(0.462±0.026)增殖能力明显强于正常组成纤维细胞(0.389±0.021，P<0.01)，纤维连接蛋白基因及蛋白质表达与正常组成纤维细胞比较显著增加，(34.1±4.1)%、(16.2±2.3)%(P<0.01)。结论 AT2受体对AT1受体介导的细胞增殖和分泌纤维连接蛋白有一定的抑制作用。
, 百拇医药
AngiotensinⅡtype 2 receptor inhibits type 1 receptor-induced cell proliferation and fibronectin release in mouse fibroblasts
Li Wenge, Chen Xiangmei, Ye Yizhou, et al.
Department of Nephrology, General Hospital of PLA, Center of Nephrology and Key Laboratory of PLA, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To investigate the effects of angiotensinⅡtype 2 receptor (AT2) on the cell proliferation and fibronectin release induced by angiotensinⅡtype 1 receptor (AT1). Method Fibroblats were cultured from embryonic skin of AT2 receptor gene knocked-out mice (AT2-/-) and wild-type mice (AT2+/+) after 16 days of gestation, respectively. Cell proliferation and fibronectin release were examined in the fibroblasts treated with 10-8mol/L angiotensinⅡ. Results Cell proliferation rate was increased more markedly in the AT2-/- fibroblasts than in the AT2+/+ fibroblasts after treament with angiotensinⅡ(0.462±0.026 VS 0.389±0.021，P<0.01). Also, fibronectin release and its gene expression were significantly enhanced in the AT2-/- fibroblasts as compared with the AT2+/+ fibroblasts when exposed to angiotensinⅡ(34.1±4.1)%vs(16.2±2.3)%，P<0.01). Conclusion The AT2 receptor can inhibit the cell proliferation and fibronectin release induced by the AT1 receptor.
, 百拇医药
【Key words】 Receptor angiotensin Fibroblasts Angiotensin Ⅱ
(Natl Med J China, 1998, 78：738-740)
血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)1型(AT1)和2型(AT2)受体间的拮抗作用是目前肾素-血管紧张素系统的研究热点之一[1]。对AT2受体的早期研究发现，在哺乳类动物中，AT2受体基因的表达具有独特性，即在胚胎的各种组织中存在着丰富的AT2受体mRNA，出生后则急剧下降[2]，因此许多学者推测AT2受体可能主要与组织器官的发育有关。对AT2受体的基因敲除(gene knock out)研究发现，在AT2受体基因缺失小鼠中，收缩压和舒张压均有一定程度的升高[3]。最近，利用细胞转基因技术研究亦发现，将构建的AT2受体基因表达载体导入细胞内，AT2受体表达的增高能拮抗宿主细胞的增殖、诱发细胞的凋亡[4]。
, 百拇医药
本研究通过从AT2受体基因缺失和正常胎鼠培养皮肤成纤维细胞，观察了AT2受体缺失对AT1受体介导的成纤维细胞增殖和分泌纤维连接蛋白(FN)的影响。
材料与方法
一、材料
AT2受体基因缺失(以AT2-/-表示)小鼠和用于产生AT2基因缺失的正常小鼠(AT2+/+，C57BL/6系)均由美国Vanderbilt大学生化系Inagami[3]教授馈赠。
二、方法
1.胎鼠皮肤成纤维细胞的培养和鉴定[5，6]：以10周龄AT2-/-雄性和雌性小鼠交配，雌鼠怀孕16天时断颈处死，取出胎鼠，培养AT2-/-成纤维细胞。同时培养AT2+/+胎鼠皮肤成纤维细胞作为实验对照。两种成纤维细胞经α平滑肌肌动蛋白和波形蛋白(vimentin)抗体鉴定，纯度分别是97%和96%。
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2.细胞增殖检测：将AT2-/-和AT2+/+两种胎鼠皮肤成纤维细胞按3×103个细胞/孔种植于96孔细胞培养板，采用四甲基偶氮多胍(MTT, 5mg/ml)掺入法检测细胞的增殖状况。
3.细胞培养上清中FN的测定：将成纤维细胞按5×103个细胞/孔种植于96孔细胞培养板，至24小时换为无血清DMEM培养基，12小时移弃，再分别加入无血清DMEM和含10-8mol/L AngⅡ的无血清DMEM培养基，48小时收集培养上清，采用双抗体夹心ELISA方法测定上清中FN的含量。
4.FN基因表达的逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测：用RNAzolBTM液分别从AT2-/-和AT2+/+两种胎鼠皮肤成纤维细胞提取总RNA，取10 μg总RNA进行逆转录，取1 μl逆转录产物进行PCR扩增，FN正义引物序列为：5′-GATGTGGATGTCGATTCCAT-3′(20bp)，反义序列为：5′-GATCTCTGGTCCATGAAGAT-3′ (20bp)，退火温度为50℃，扩增长度为1 107 bp，同时加入三磷酸甘油醛脱氢酶(G3PDH)引物作为内参照进行共同扩增反应。在1%琼脂糖凝胶中电泳观察PCR产物并用计算机凝胶图象分析系统进行吸光度分析。
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5.FN基因表达的Northern印迹杂交分析：20 μg总RNA在1%琼脂糖凝胶中电泳后，将RNA转移至尼龙膜上，用32P-dCTP标记FN cDNA探针。去除尼龙膜上的同位素后，再与G3PDH cDNA探针杂交，检测尼龙膜上各样本总RNA的上样量。杂交结果用计算机图象分析系统进行吸光度分析。
6.统计学处理：两组间比较用t检验，数据以均数±标准差表示。
结果
1. 两种成纤维细胞的增殖状况：在AngⅡ刺激下，AT2-/-胎鼠成纤维细胞的增殖能力明显强于AT2+/+成纤维细胞(附表)。
2.成纤维细胞培养上清中FN含量：AT2受体基因缺失后，成纤维细胞在AngⅡ刺激下产生的FN量明显多于正常成纤维细胞(附表)，说明AT2受体的存在，对细胞分泌FN有一定抑制作用。
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附表 胎鼠皮肤成纤维细胞增殖及分泌FN情况(
±s) 培养基鼠数
成纤维细胞数量(A)
FN(A)
P
AT2+/+
AT2-/-
AT2+/+
AT2-/-
无血清
6
, 百拇医药
0.318
±0.017
0.321
±0.019
0.338
±0.029
0.334
±0.025
>0.05
无血清
+AngⅡ
6
0.389
, 百拇医药
±0.021
0.462
±0.026
0.429
±0.031
0.578
±0.040
<0.01
3.FN mRNA表达的RT-PCR检测结果：在AngⅡ刺激下，AT2-/-胎鼠皮肤成纤维细胞FN的mRNA水平明显高于AT2+/+成纤维细胞，表明AT2受体缺失后，AngⅡ刺激细胞FN基因表达的作用明显增强。AT2-/-和AT2+/+成纤维细胞FN的RT-PCR结果分别为(48±6)%、(30±5)%(P<0.01 图1)。
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1.marker 2.AT2+/+成纤维细胞，无血清DMEM培养基；3.AT2-/-成纤维细胞，无血清DMEM培养基；4.AT2+/+成纤维细胞，加AngⅡ；5.AT2-/-成纤维细胞，加AngⅡ图1 FN mRNA表达的RT-PCR检测结果
4. FN mRNA表达的Northern印迹杂交结果：AT2受体缺失后，AngⅡ诱导的成纤维细胞FN的mRNA水平明显升高，进一步证实了上述RT-PCR的实验结果。AT2-/-和AT2+/+成纤维细胞FN mRNA的水平分别为(34.1±4.1)%和(16.2±2.3)%(P<0.01 图2)。
注：1.AT2+/+成纤维细胞；2.AT2-/-成纤维细胞图2 FN mRNA表达的Northern印迹杂交结
讨论
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AT2受体能否多方面地拮抗AT1受体的功能，是当前肾素-血管紧张素系统研究面临的主要研究任务之一[7]。前期大量的研究已证实，AT1受体能促进细胞的增殖和细胞外基质的产生，作为AT1受体的对立面，AT2受体是否能够拮抗AT1受体介导的上述功能则目前尚少见研究报道。
肾素-血管紧张素系统是一个反馈调节系统，近年来，通过对肾素-血管紧张素系统的基因敲除研究也充分证实了这一点，如血管紧张素原、血管紧张素转化酶和AT1A受体基因缺失后均可引起肾素代偿性地产生增加[8]，由此，我们推测AT2受体缺失后AngⅡ刺激细胞的作用有可能也发生改变。我们首先观察了AT2受体缺失后对成纤维细胞增殖的作用，结果发现在AngⅡ刺激下，AT2-/-成纤维细胞的增殖能力明显强于AT2+/+成纤维细胞。纤维连接蛋白不仅是细胞外基质的重要成分，同时也是一种重要的调理素介质，通过与整合素(如VLA5等)结合，在介导细胞增殖和器官硬化的发生中起着重要作用，因此，我们选择了纤维连接蛋白作为研究对象，分别采用了RT-PCR(敏感)和Northern印迹杂交(特异性强)两种方法，观测了纤维连接蛋白的基因表达，同时应用ELISA的方法检测了成纤维细胞纤维连接蛋白的分泌，发现AT2受体缺失的成纤维细胞其产生的纤维连接蛋白，无论是在蛋白质还是mRNA水平均有明显增加。
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本实验结果表明，AT2受体的存在，对AT1受体介导的细胞增殖和分泌纤维连接蛋白有一定的抑制作用，进而说明在细胞增殖和产生细胞外基质方面AT1和AT2受体间可能有拮抗作用。
本课题为国家自然科学优秀中青年专项基金资助项目(编号39421005)
参考文献
1 Celband CH, Zhu M, Lu D, et al. Functional interaction between neuronal AT1 and AT2 receptors. Endocrinology, 1997, 138:2195-2198.
2 Kakuchi J, Ichiki T, Kiyama S, et al. Developmental expression of renal angiotensinⅡ receptor genes in the mouse. Kidney Int, 1995, 47:140-147.
, 百拇医药
3 Ichiki T, labosky PA, Shiota C, et al. Effects on blood pressure and exploratory behavior of mice lacking angiotensinⅡ receptor. Nature, 1995, 377：748-750.
4 Yamada T, Horiuchi M, Dzau VJ. et al. AngiotensinⅡtype 2 receptor mediates programmed cell death. Proc Natl Acad Sci, 1996, 93:156-160.
5 Hogan B, Beddington R, Costantini F, et al. Mouse embryo fibroblasts as feeder layers. In: Hogan B, Beddington R, Costantini F, eds. Manipulating the mouse embryo, 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994, F260.
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6 李文歌，陈香美，程庆砾，等.用共培养体系观察缺氧肾小管上皮细胞对成纤维细胞的调节作用. 中华内科杂志，1996，35: 810-813.
7 Douglas JG. The curtain rise on the renin-angiotensin system: AT2 receptors are in the spotlight. J Clin Invest, 1996, 97:1787.
8 陈香美，李文歌. 肾素-血管紧张素系统基因打靶研究现状. 中华肾脏病杂志，1996，12:383-385.
(收稿：1997-09-08 修回：1998-08-03), 百拇医药