人鼻咽癌自发性高淋巴道转移模型的建立及生物学特性研究
作者：黄剑 唐慰萍 姚运红 邓惠华 郑克勤 李飞虹 蔡琼珍 莫梅英
单位：524023 湛江，广东医学院病理学教研室(黄剑、唐慰萍、姚运红、邓惠华、李飞虹、蔡琼珍、莫梅英)，遗传学研究室(郑克勤)
关键词：鼻咽肿瘤；肿瘤转移；小鼠，裸
中华医学杂志/981002 【摘要】 目的 在裸鼠体内建立人鼻咽癌自发性高淋巴道转移模型，并研究该癌细胞的有关生物学特性。方法 将鼻咽癌单克隆细胞株(CNE-2Z-H5)移植于裸鼠皮下，待裸鼠发生转移时,取其淋巴结转移灶癌细胞再次移植裸鼠皮下传代，重复传9代后,观察各代裸鼠的转移率和转移途径；各代癌细胞体外增殖能力、癌细胞生长因子和受体表达的变化；裸鼠体内移植瘤增殖指数及瘤重和体积倍增时间的变化。结果 癌细胞在裸鼠体内传9代后,各代裸鼠的淋巴结转移率一直稳定在85%以上，且转移途径较为单一；各代癌细胞的体内外增殖能力不断增强。结论 建立了人鼻咽癌自发性高淋巴道转移模型；鼻咽癌细胞在裸鼠体内演进中转移能力和增殖能力均不断增强，两者关系密切。
, http://www.100md.com
A model of nasopharyngeal carcinoma with spontaneous highly lymphatic metastasis in nude mice and its biological characteristics
Huang Jian, Tang Weiping, Yao Yunhong, et al. Department of Pathology, Guangdong Medical College , Zhanjiang 524023
【Abstract】 Objectives To establish a model of nasopharyngeal carcinoma with spontaneous highly lymphatic metastasis in nude mice and to study its biological characteristics. Methods The clone cells of nasopharyngeal carcinoma(NPC), CNE-2Z-H5, were inoculated into nude mice.The cancer cells of lymph node metastatic foci were transplanted into nude mice again when the metastasis of nude mice were observed. After repetition of this procedure for 9 cycles, the metastatic rate and the metastatic paths were observed in nude mice of every passage; The changes were also observed in proliferation ability, expression of growth factor and its receptor in vitro, proliferation index(PI), and tumor weight and doubling time of the transplantable tumor in every passage in vivo. Results The lymphatic metastatic rates were higher than 85%.The metastatic paths were single, the proliferation ability was increased in cancer cells of every passage in vivo and vitro after passaging cancer cells of lymphatic metastatic foci for 9 cycles in nude mice. Conclusions A model of nasopharyngeal carcinoma with spontaneous highly lymphatic metastasis has been established in nude mice, and the possiblites of metastasis and proliferation are increased after progression of NPC cells in nude mice. There is a close relationship between the metastasis and proliferation in NPC.
, 百拇医药
【Key words】 Nasopharyngeal neoplasm Neoplasm metastasis Mice, nude
(Natl Med J China, 1998, 78：725-728)
目前鼻咽癌淋巴道转移模型的报道尚少。为此，我们对人低分化鼻咽癌细胞系(CNE-2Z)进行克隆，得到21个克隆株,并对这21个克隆株通过初步的体内外实验筛选，得到一具有淋巴道转移趋向的鼻咽癌克隆株(CNE-2Z-H5)[1，2]。在此基础上，本实验通过裸鼠体内连续9次淋巴结转移灶癌细胞的筛选，得到一高淋巴道转移能力的肿瘤细胞亚群，建立了人鼻咽癌淋巴道转移模型，并对该肿瘤细胞亚群的生物学特性进行了研究。
材料和方法
一、实验动物及克隆株
, 百拇医药
均为NIH系裸小鼠(NU/NU),生长繁殖于本室裸鼠净化繁殖室的无特殊病原体环境中，鼠龄为1～2个月,体重15～25 g,雌雄兼用。实验动物饲养于隔离室恒温环境的层流架中，饲以灭菌的水和饲料。克隆株CNE-2Z-H5由本校细胞室提供。
二、自发性高淋巴道转移模型的建立
复苏的克隆株H5传代培养5天后，用胰酶与乙二胺四乙酸二钠(EDTA)混合液消化，制成细胞悬液，每只裸鼠以1×106/0.3 ml细胞数,按无菌操作的要求,直接穿刺注射于裸鼠近前腋处皮下,此为原代移植瘤。待裸鼠发生淋巴结转移时,将部分肉眼可见裸鼠淋巴结转移灶癌组织取出,并回复培养，将回复培养的癌细胞按上述细胞浓度,再次移植裸鼠背部皮下,此为第1代淋巴结转移灶移植瘤，将其余回复培养的癌细胞，用于相关生物学特性的检测。按上述方法，重复9次用上代裸鼠淋巴结转移灶癌细胞传代,即共为9代。
三、各代癌细胞增殖能力的检测
, 百拇医药
1.各代体外培养的癌细胞吸光度(A)值测定：取各代回复培养的转移灶癌细胞,按5x104/ml的细胞浓度,加入96孔培养板，每孔0.2 ml(含1x104细胞/孔)，37 ℃、5% CO2孵育1～6天后,弃去培养液,用吸湿纸吸干残液后,各孔加入0.1ml 0.5%的结晶紫染色5分钟,用温磷酸盐缓冲液洗3次,用吸湿纸吸干残液后,每孔加入1%醋酸酒精,置振荡器振荡5分钟后,即用酶标仪(570nm波长)测定各孔的A值。
2.流式细胞术测定癌细胞增殖指数(PI)：将各代移植瘤回复培养的癌细胞数调整在1×105/mL左右,溴化乙啶(EB)染色,以EB染色的人外周血淋巴细胞做为标准对照样品,上机检测后,根据电脑显示的各项细胞周期参数,按公式：(S+G2+M/G0/1+S+G2+M)×100%，计算细胞PI值。
, http://www.100md.com 3.各代移植瘤瘤重和体积倍增时间的计算：按近似公式，瘤重(W)＝b×a2/2,b为肿瘤长径，a为肿瘤短径。体积倍增时间(TD)＝0.1Xt/logDt-logDo，Do为第一次测得的肿瘤直径,Dt为经过t时间后肿瘤直径。
4.转化生长因子(TGFa)、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板源性生长因子受体(PDGFR)的检测： 将每代裸鼠转移灶癌细胞回复培养,传1～3代后收积癌细胞,按常规ABC方法进行免疫细胞化学染色。结果判定：将胞浆及胞膜明显棕黄色的细胞计为阳性细胞，每代癌细胞共染5张切片，每张切片在高倍镜下随机计数500个细胞，统计其阳性细胞数。试剂来源:TGFa单克隆抗体,Oncogene Science产品,稀释度为1:10;EGF(R)多克隆抗体,Santa Cruz产品,稀释度为1:10;PDGF(R)多克隆抗体,Santa Cruz产品,稀释度为1：10；ABCKit为Vector产品。上述试剂均购自北京中山生物技术有限公司。
, http://www.100md.com 5.癌细胞遗传学特性检测：取生长旺盛的原代克隆株H5及淋巴结转移灶第九代回复培养细胞，分瓶后20～24小时加入秋水仙胺至终浓度为0.05～0.08 μg/ml，继续培养2～3小时，然后常规消化收获细胞，经低渗、固定后滴片，60℃烤片过夜后G显带。在油镜下两种细胞各随机计数100个界线明显的分裂相，另选择分散良好显带清晰的分裂相各20个，进行油镜下核型分析或显微摄影后照片上核型分析。
6.统计学处理：各代移植瘤转移率比较采用四格表精确概率法，其它各项目的差异比较均采用t检验，用POMS医学统计学程序处理。
结果
一、 各代裸鼠的转移情况
衰竭处死及自然死亡的动物均详细解剖，观察其转移情况，发生转移的淋巴结多为腋窝、腹股沟、肿瘤周边等处浅表淋巴结，内脏淋巴结较少发生转移，淋巴结大小不等，最大者可达1.2 cm3，为灰黄或灰白色,大部分中央发生坏死。随着淋巴结转移灶癌细胞在裸鼠体内的反复传代,其淋巴结转移率不断提高,当传至第四代时,裸鼠淋巴结转移率为100%(11/11)，连续传至第九代，裸鼠淋巴结转移率一直稳定在85%以上。各代裸鼠的肺转移率较低，大部分肺转移灶组织肉眼难以发现，只有通过肺组织连续切片才能确定，少数肺组织表面可见散在的、针尖大小的瘤结节，呈灰白色、半透明状。镜下见各代转移灶癌组织均为低分化鳞癌。所有实验动物的荷瘤时间均为60～70天。具体转移情况见表1
, 百拇医药
表1 各代裸鼠癌转移情况 裸鼠代数
裸鼠数
(只)
淋巴道
转移率(%)
肺转
移率(%)
原 代
11
46
18
第1代
7
, http://www.100md.com
6/7
4/7
第2代
12
92*
42
第3代
14
93*
29
第4代
11
100**
, http://www.100md.com
9
第5代
13
92*
15
第6代
12
92*
8
第7代
11
100**
9
, 百拇医药
第8代
14
86*
14
第9代
11
100**
0
注：和原代比较* P<0.05，**P <0.01 二、各代癌细胞体外生长时的A值变化
从表2可以看出，原代至第九代癌细胞的体外增殖能力呈增长趋势。
表2 各代癌细胞体外生长1～6天时的A值变化(
±s)
, 百拇医药
裸鼠代数
生长时间(天)
1
2
3
4
5
6
原 代
0.3±0.0
0.6±0.1
1.0±0.1
1.5±0.2
, 百拇医药
1.5±0.3
1.2±0.3
第1代
0.3±0.0
0.7±0.1
1.2±0.1
1.7±0.3
1.8±0.4
1.3±0.4
第2代
0.3±0.0
0.7±0.1
, 百拇医药
1.3±0.1
1.8±0.4
1.8±0.5
1.4±0.2
第3代
0.4±0.0
0.7±0.1
1.5±0.1
1.8±0.4
1.9±0.5
1.5±0.3
第4代
, http://www.100md.com
0.6±0.1
1.0±0.1
1.6±0.1
2.0±0.4
2.1±0.6
1.6±0.3
第5代
0.6±0.0
0.9±0.1
1.7±0.1
2.1±0.3
2.2±0.4
, http://www.100md.com
1.7±0.3
第6代
0.6±0.0
1.0±0.1
1.7±0.1
2.1±0.4
2.3±0.3
1.7±0.3
第7代
0.6±0.0
1.1±0.1
1.8±0.1
, 百拇医药
2.2±0.3
2.4±0.4
1.8±0.5
第8代
0.7±0.1
1.2±0.0
1.9±0.1
2.2±0.4
2.5±0.5
2.0±0.7
第9代
0.9±0.1
, 百拇医药
1.6±0.0
2.2±0.1
2.5±0.5
2.8±0.5
2.1±0.5
注：第4代至第9代细胞和原代细胞比较，差异有显著意义，P<0.05；第8代及第9代和第4代比较，差异亦有显著意义，P<0.05
三、裸鼠移植瘤癌细胞PI值及瘤重和体积倍增时间的变化
随着转移灶癌细胞在裸鼠体内的不断传代，各代裸鼠移植瘤癌细胞PI值及瘤重呈不断升高的趋势，瘤细胞的体积倍增时间呈不断下降的趋势，表3。表3 各代癌细胞PI值、移植瘤瘤重及体积倍增
, http://www.100md.com 时间的变化(±s) 裸鼠
代数
裸鼠
数(只)
PI值
肿瘤重
(g)
体积倍增
时间(天)
原 代
11
39±13
, 百拇医药
10±3
14.7±3.7
第1代
17
46±15
13±4
11.2±3.3*
第2代
12
50±21
14±4
10.1±2.3*
, 百拇医药
第3代
14
53±24
15±5*
9.8±2.5*
第4代
11
59±21*
15±5*
8.1±2.0*
第5代
, 百拇医药 13
60±23*
16±5*
7.2±2.6*
第6代
12
62±23*
16±5*
7.1±3.1*
第7代
11
, 百拇医药
63±26*
16±6*
6.8±2.9**
第8代
14
65±28*
17±6*
6.1±2.1**
第9代
11
67±24**
, 百拇医药
18±6**
5.8±1.9**
注：和原代比较* P<0.05，**P<0.01
四、各代癌细胞生长因子及受体的表达
各代癌细胞生长因子及受体表达的阳性反应产物位于细胞膜及胞浆内，和原代比较阳性反应的细胞不断增加，见表4。表4 各代癌细胞生长因子及受体的表达(细胞数，±s) 裸鼠代数
TGFa
EGFR
PDGFR
, 百拇医药
原 代
113±24
87±31
135±54
第1代
136±53
154±41
169±48
第2代
175±26
201±27
182±49
第3代
, 百拇医药
223±37
242±46*
243±31*
第4代
310±52*
328±64*
320±59**
第5代
331±62*
358±63*
345±56**
, 百拇医药
第6代
340±48*
334±54*
379±85**
第7代
350±62*
378±74*
420±89**
第8代
451±78**
434±69**
, http://www.100md.com
393±76**
第9代
476±93**
439±73**
427±95**
注：TGFa、EGFR及PDGFR的细胞总数均为500
五、原代及第9代癌细胞染色体分析
CNE-2Z-H5和第9代移植瘤癌细胞的染色体数目均呈非整倍性变化，为亚四倍体。CNE-2Z-H5的染色体数变化在83～93，众数为86～88。移植瘤染色体数变化在64～103，众数为80～83。CNE-2Z-H5和移植瘤细胞都有非常类似的一系列标记染色体，总数达20多条。它们的结构变化复杂，部分标记染色体显带后仍难以辨认，其具体来源未能完全确定。其中M1～M6、M8、M9、M12、M14、M16、M18、M19及M21～M23等几乎出现在每一个被分析的分裂相中。原代及第9代癌细胞染色体的结构方面尚未发现明显的不同。讨论
, 百拇医药
本结果可见，用淋巴结转移灶癌细胞接种之裸鼠，其淋巴结转移率高于原代裸鼠，随着其淋巴结转移灶癌细胞裸鼠体内不断筛选,各代裸鼠淋巴结转移率不断升高,连续传9代后，其高淋巴道转移特性一直较为稳定，而肺转移率则一直稳定在较低水平，说明在淋巴结转移灶中存在高淋巴道转移的肿瘤细胞亚群。从理论上说，单克隆肿瘤细胞来源的群体是一个基因型和表现型均完全相同的群体，然而,鼻咽癌克隆株的转移灶组织中出现了转移能力及途径均不相同的瘤细胞亚群，表明肿瘤细胞在裸鼠体内演进过程中，由于其遗传的不稳定性，一些瘤细胞可能出现基因结构和(或)蛋白产物表达的异常，出现了新的异质性群体[3]。因鼻咽癌克隆株H5裸鼠移植瘤的转移灶中存在高转移能力、不同转移途径的瘤细胞亚群[4]。该研究进一步证实:鼻咽癌克隆株H5裸鼠体内演进中,瘤细胞的转移能力不断增强,转移途径更为单一。可见，连续用淋巴结转移灶癌在裸鼠体内筛选的方法，可以提高肿瘤细胞的自发性转移率，并获得较为单一淋巴道转移途径的肿瘤细胞亚群。
我们进一步研究发现，随着鼻咽癌转移灶细胞在裸鼠体内的不断演进，肿瘤细胞的A值、增殖指数、移植瘤瘤重不断增加，体积倍增时间不断减少，表明肿瘤细胞在裸鼠体内及体外培养时的增殖能力均不断增强，且明显高于原代肿瘤细胞。提示，肿瘤细胞转移能力和增殖能力之间，关系十分密切。免疫组织化学半定量结果表明，随着转移灶细胞在裸鼠体内的不断演进，TGFa、EGFR及PDGFR的表达不断增强，并和肿瘤细胞的转移能力密切相关，肿瘤细胞转移能力越强,其TGFa、EGFR及PDGFR的表达亦高。
, 百拇医药
细胞遗传学研究表明，CNE-2Z-H5克隆株与高淋巴道转移的肿瘤细胞之间，细胞遗传学特性存在一定差异。克隆株细胞的染色体数目分布比较集中，染色体数目在83～93，众数为86～88，这是因为克隆株是从单个细胞增殖而来，细胞群体比较单纯的缘故。高淋巴道转移的肿瘤细胞则不同，表现在其染色体数目变化范围较大，众数也较分散，染色体数变化在64～103，众数为80～83，比克隆株要少5～6条。这种差别主要是由于克隆株在裸鼠体内经过多次淋巴结转移灶癌组织的筛选后，其遗传学特性可能发生改变，而这一细胞遗传学特性可能和其高转移特性密切相关。在染色体结构变化方面，两种细胞在G显带水平上都有一系列结构复杂的标记染色体，但两者尚无明显的差异，这可能是因为在细胞遗传学水平尚不能真正发现其标记染色体细微差别，有待于今后在分子细胞遗传学方法进行更深入的探讨。
参考文献
1 邓惠华, 胡新荣, 唐慰萍.人低分化鼻咽癌细胞克隆亚系的分离及生长特性观察.广东医学院学报, 1994,12：99-101.
, 百拇医药
2 胡新荣,邓惠华,李飞虹,等.低分化鼻咽癌细胞系(CNE-2Z-H5)及其21个克隆株的癌细胞电泳分析. 湛江医学院学报,1993,11：20-22.
3 Nicolson G L. Tumor cell instability, diversification, and progression to the metastatic phenotype: from oncogene to oncofetal exprssion. Cancer Res, 1987, 47:1473-1487.
4 黄剑，唐慰萍，姚运红，等.鼻咽癌克隆株裸鼠移植瘤自发性转移及群体增殖能力的研究.癌症，1996，15：1-3.
(收稿：1997-09-05 修回：1998-05-20), 百拇医药
单位：524023 湛江，广东医学院病理学教研室(黄剑、唐慰萍、姚运红、邓惠华、李飞虹、蔡琼珍、莫梅英)，遗传学研究室(郑克勤)
关键词：鼻咽肿瘤；肿瘤转移；小鼠，裸
中华医学杂志/981002 【摘要】 目的 在裸鼠体内建立人鼻咽癌自发性高淋巴道转移模型，并研究该癌细胞的有关生物学特性。方法 将鼻咽癌单克隆细胞株(CNE-2Z-H5)移植于裸鼠皮下，待裸鼠发生转移时,取其淋巴结转移灶癌细胞再次移植裸鼠皮下传代，重复传9代后,观察各代裸鼠的转移率和转移途径；各代癌细胞体外增殖能力、癌细胞生长因子和受体表达的变化；裸鼠体内移植瘤增殖指数及瘤重和体积倍增时间的变化。结果 癌细胞在裸鼠体内传9代后,各代裸鼠的淋巴结转移率一直稳定在85%以上，且转移途径较为单一；各代癌细胞的体内外增殖能力不断增强。结论 建立了人鼻咽癌自发性高淋巴道转移模型；鼻咽癌细胞在裸鼠体内演进中转移能力和增殖能力均不断增强，两者关系密切。
, http://www.100md.com
A model of nasopharyngeal carcinoma with spontaneous highly lymphatic metastasis in nude mice and its biological characteristics
Huang Jian, Tang Weiping, Yao Yunhong, et al. Department of Pathology, Guangdong Medical College , Zhanjiang 524023
【Abstract】 Objectives To establish a model of nasopharyngeal carcinoma with spontaneous highly lymphatic metastasis in nude mice and to study its biological characteristics. Methods The clone cells of nasopharyngeal carcinoma(NPC), CNE-2Z-H5, were inoculated into nude mice.The cancer cells of lymph node metastatic foci were transplanted into nude mice again when the metastasis of nude mice were observed. After repetition of this procedure for 9 cycles, the metastatic rate and the metastatic paths were observed in nude mice of every passage; The changes were also observed in proliferation ability, expression of growth factor and its receptor in vitro, proliferation index(PI), and tumor weight and doubling time of the transplantable tumor in every passage in vivo. Results The lymphatic metastatic rates were higher than 85%.The metastatic paths were single, the proliferation ability was increased in cancer cells of every passage in vivo and vitro after passaging cancer cells of lymphatic metastatic foci for 9 cycles in nude mice. Conclusions A model of nasopharyngeal carcinoma with spontaneous highly lymphatic metastasis has been established in nude mice, and the possiblites of metastasis and proliferation are increased after progression of NPC cells in nude mice. There is a close relationship between the metastasis and proliferation in NPC.
, 百拇医药
【Key words】 Nasopharyngeal neoplasm Neoplasm metastasis Mice, nude
(Natl Med J China, 1998, 78：725-728)
目前鼻咽癌淋巴道转移模型的报道尚少。为此，我们对人低分化鼻咽癌细胞系(CNE-2Z)进行克隆，得到21个克隆株,并对这21个克隆株通过初步的体内外实验筛选，得到一具有淋巴道转移趋向的鼻咽癌克隆株(CNE-2Z-H5)[1，2]。在此基础上，本实验通过裸鼠体内连续9次淋巴结转移灶癌细胞的筛选，得到一高淋巴道转移能力的肿瘤细胞亚群，建立了人鼻咽癌淋巴道转移模型，并对该肿瘤细胞亚群的生物学特性进行了研究。
材料和方法
一、实验动物及克隆株
, 百拇医药
均为NIH系裸小鼠(NU/NU),生长繁殖于本室裸鼠净化繁殖室的无特殊病原体环境中，鼠龄为1～2个月,体重15～25 g,雌雄兼用。实验动物饲养于隔离室恒温环境的层流架中，饲以灭菌的水和饲料。克隆株CNE-2Z-H5由本校细胞室提供。
二、自发性高淋巴道转移模型的建立
复苏的克隆株H5传代培养5天后，用胰酶与乙二胺四乙酸二钠(EDTA)混合液消化，制成细胞悬液，每只裸鼠以1×106/0.3 ml细胞数,按无菌操作的要求,直接穿刺注射于裸鼠近前腋处皮下,此为原代移植瘤。待裸鼠发生淋巴结转移时,将部分肉眼可见裸鼠淋巴结转移灶癌组织取出,并回复培养，将回复培养的癌细胞按上述细胞浓度,再次移植裸鼠背部皮下,此为第1代淋巴结转移灶移植瘤，将其余回复培养的癌细胞，用于相关生物学特性的检测。按上述方法，重复9次用上代裸鼠淋巴结转移灶癌细胞传代,即共为9代。
三、各代癌细胞增殖能力的检测
, 百拇医药
1.各代体外培养的癌细胞吸光度(A)值测定：取各代回复培养的转移灶癌细胞,按5x104/ml的细胞浓度,加入96孔培养板，每孔0.2 ml(含1x104细胞/孔)，37 ℃、5% CO2孵育1～6天后,弃去培养液,用吸湿纸吸干残液后,各孔加入0.1ml 0.5%的结晶紫染色5分钟,用温磷酸盐缓冲液洗3次,用吸湿纸吸干残液后,每孔加入1%醋酸酒精,置振荡器振荡5分钟后,即用酶标仪(570nm波长)测定各孔的A值。
2.流式细胞术测定癌细胞增殖指数(PI)：将各代移植瘤回复培养的癌细胞数调整在1×105/mL左右,溴化乙啶(EB)染色,以EB染色的人外周血淋巴细胞做为标准对照样品,上机检测后,根据电脑显示的各项细胞周期参数,按公式：(S+G2+M/G0/1+S+G2+M)×100%，计算细胞PI值。
, http://www.100md.com 3.各代移植瘤瘤重和体积倍增时间的计算：按近似公式，瘤重(W)＝b×a2/2,b为肿瘤长径，a为肿瘤短径。体积倍增时间(TD)＝0.1Xt/logDt-logDo，Do为第一次测得的肿瘤直径,Dt为经过t时间后肿瘤直径。
4.转化生长因子(TGFa)、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板源性生长因子受体(PDGFR)的检测： 将每代裸鼠转移灶癌细胞回复培养,传1～3代后收积癌细胞,按常规ABC方法进行免疫细胞化学染色。结果判定：将胞浆及胞膜明显棕黄色的细胞计为阳性细胞，每代癌细胞共染5张切片，每张切片在高倍镜下随机计数500个细胞，统计其阳性细胞数。试剂来源:TGFa单克隆抗体,Oncogene Science产品,稀释度为1:10;EGF(R)多克隆抗体,Santa Cruz产品,稀释度为1:10;PDGF(R)多克隆抗体,Santa Cruz产品,稀释度为1：10；ABCKit为Vector产品。上述试剂均购自北京中山生物技术有限公司。
, http://www.100md.com 5.癌细胞遗传学特性检测：取生长旺盛的原代克隆株H5及淋巴结转移灶第九代回复培养细胞，分瓶后20～24小时加入秋水仙胺至终浓度为0.05～0.08 μg/ml，继续培养2～3小时，然后常规消化收获细胞，经低渗、固定后滴片，60℃烤片过夜后G显带。在油镜下两种细胞各随机计数100个界线明显的分裂相，另选择分散良好显带清晰的分裂相各20个，进行油镜下核型分析或显微摄影后照片上核型分析。
6.统计学处理：各代移植瘤转移率比较采用四格表精确概率法，其它各项目的差异比较均采用t检验，用POMS医学统计学程序处理。
结果
一、 各代裸鼠的转移情况
衰竭处死及自然死亡的动物均详细解剖，观察其转移情况，发生转移的淋巴结多为腋窝、腹股沟、肿瘤周边等处浅表淋巴结，内脏淋巴结较少发生转移，淋巴结大小不等，最大者可达1.2 cm3，为灰黄或灰白色,大部分中央发生坏死。随着淋巴结转移灶癌细胞在裸鼠体内的反复传代,其淋巴结转移率不断提高,当传至第四代时,裸鼠淋巴结转移率为100%(11/11)，连续传至第九代，裸鼠淋巴结转移率一直稳定在85%以上。各代裸鼠的肺转移率较低，大部分肺转移灶组织肉眼难以发现，只有通过肺组织连续切片才能确定，少数肺组织表面可见散在的、针尖大小的瘤结节，呈灰白色、半透明状。镜下见各代转移灶癌组织均为低分化鳞癌。所有实验动物的荷瘤时间均为60～70天。具体转移情况见表1
, 百拇医药
表1 各代裸鼠癌转移情况 裸鼠代数
裸鼠数
(只)
淋巴道
转移率(%)
肺转
移率(%)
原 代
11
46
18
第1代
7
, http://www.100md.com
6/7
4/7
第2代
12
92*
42
第3代
14
93*
29
第4代
11
100**
, http://www.100md.com
9
第5代
13
92*
15
第6代
12
92*
8
第7代
11
100**
9
, 百拇医药
第8代
14
86*
14
第9代
11
100**
0
注：和原代比较* P<0.05，**P <0.01 二、各代癌细胞体外生长时的A值变化
从表2可以看出，原代至第九代癌细胞的体外增殖能力呈增长趋势。
表2 各代癌细胞体外生长1～6天时的A值变化(
±s), 百拇医药
裸鼠代数
生长时间(天)
1
2
3
4
5
6
原 代
0.3±0.0
0.6±0.1
1.0±0.1
1.5±0.2
, 百拇医药
1.5±0.3
1.2±0.3
第1代
0.3±0.0
0.7±0.1
1.2±0.1
1.7±0.3
1.8±0.4
1.3±0.4
第2代
0.3±0.0
0.7±0.1
, 百拇医药
1.3±0.1
1.8±0.4
1.8±0.5
1.4±0.2
第3代
0.4±0.0
0.7±0.1
1.5±0.1
1.8±0.4
1.9±0.5
1.5±0.3
第4代
, http://www.100md.com
0.6±0.1
1.0±0.1
1.6±0.1
2.0±0.4
2.1±0.6
1.6±0.3
第5代
0.6±0.0
0.9±0.1
1.7±0.1
2.1±0.3
2.2±0.4
, http://www.100md.com
1.7±0.3
第6代
0.6±0.0
1.0±0.1
1.7±0.1
2.1±0.4
2.3±0.3
1.7±0.3
第7代
0.6±0.0
1.1±0.1
1.8±0.1
, 百拇医药
2.2±0.3
2.4±0.4
1.8±0.5
第8代
0.7±0.1
1.2±0.0
1.9±0.1
2.2±0.4
2.5±0.5
2.0±0.7
第9代
0.9±0.1
, 百拇医药
1.6±0.0
2.2±0.1
2.5±0.5
2.8±0.5
2.1±0.5
注：第4代至第9代细胞和原代细胞比较，差异有显著意义，P<0.05；第8代及第9代和第4代比较，差异亦有显著意义，P<0.05
三、裸鼠移植瘤癌细胞PI值及瘤重和体积倍增时间的变化
随着转移灶癌细胞在裸鼠体内的不断传代，各代裸鼠移植瘤癌细胞PI值及瘤重呈不断升高的趋势，瘤细胞的体积倍增时间呈不断下降的趋势，表3。表3 各代癌细胞PI值、移植瘤瘤重及体积倍增
, http://www.100md.com 时间的变化(
±s) 裸鼠代数
裸鼠
数(只)
PI值
肿瘤重
(g)
体积倍增
时间(天)
原 代
11
39±13
, 百拇医药
10±3
14.7±3.7
第1代
17
46±15
13±4
11.2±3.3*
第2代
12
50±21
14±4
10.1±2.3*
, 百拇医药
第3代
14
53±24
15±5*
9.8±2.5*
第4代
11
59±21*
15±5*
8.1±2.0*
第5代
, 百拇医药 13
60±23*
16±5*
7.2±2.6*
第6代
12
62±23*
16±5*
7.1±3.1*
第7代
11
, 百拇医药
63±26*
16±6*
6.8±2.9**
第8代
14
65±28*
17±6*
6.1±2.1**
第9代
11
67±24**
, 百拇医药
18±6**
5.8±1.9**
注：和原代比较* P<0.05，**P<0.01
四、各代癌细胞生长因子及受体的表达
各代癌细胞生长因子及受体表达的阳性反应产物位于细胞膜及胞浆内，和原代比较阳性反应的细胞不断增加，见表4。表4 各代癌细胞生长因子及受体的表达(细胞数，
±s) 裸鼠代数TGFa
EGFR
PDGFR
, 百拇医药
原 代
113±24
87±31
135±54
第1代
136±53
154±41
169±48
第2代
175±26
201±27
182±49
第3代
, 百拇医药
223±37
242±46*
243±31*
第4代
310±52*
328±64*
320±59**
第5代
331±62*
358±63*
345±56**
, 百拇医药
第6代
340±48*
334±54*
379±85**
第7代
350±62*
378±74*
420±89**
第8代
451±78**
434±69**
, http://www.100md.com
393±76**
第9代
476±93**
439±73**
427±95**
注：TGFa、EGFR及PDGFR的细胞总数均为500
五、原代及第9代癌细胞染色体分析
CNE-2Z-H5和第9代移植瘤癌细胞的染色体数目均呈非整倍性变化，为亚四倍体。CNE-2Z-H5的染色体数变化在83～93，众数为86～88。移植瘤染色体数变化在64～103，众数为80～83。CNE-2Z-H5和移植瘤细胞都有非常类似的一系列标记染色体，总数达20多条。它们的结构变化复杂，部分标记染色体显带后仍难以辨认，其具体来源未能完全确定。其中M1～M6、M8、M9、M12、M14、M16、M18、M19及M21～M23等几乎出现在每一个被分析的分裂相中。原代及第9代癌细胞染色体的结构方面尚未发现明显的不同。讨论
, 百拇医药
本结果可见，用淋巴结转移灶癌细胞接种之裸鼠，其淋巴结转移率高于原代裸鼠，随着其淋巴结转移灶癌细胞裸鼠体内不断筛选,各代裸鼠淋巴结转移率不断升高,连续传9代后，其高淋巴道转移特性一直较为稳定，而肺转移率则一直稳定在较低水平，说明在淋巴结转移灶中存在高淋巴道转移的肿瘤细胞亚群。从理论上说，单克隆肿瘤细胞来源的群体是一个基因型和表现型均完全相同的群体，然而,鼻咽癌克隆株的转移灶组织中出现了转移能力及途径均不相同的瘤细胞亚群，表明肿瘤细胞在裸鼠体内演进过程中，由于其遗传的不稳定性，一些瘤细胞可能出现基因结构和(或)蛋白产物表达的异常，出现了新的异质性群体[3]。因鼻咽癌克隆株H5裸鼠移植瘤的转移灶中存在高转移能力、不同转移途径的瘤细胞亚群[4]。该研究进一步证实:鼻咽癌克隆株H5裸鼠体内演进中,瘤细胞的转移能力不断增强,转移途径更为单一。可见，连续用淋巴结转移灶癌在裸鼠体内筛选的方法，可以提高肿瘤细胞的自发性转移率，并获得较为单一淋巴道转移途径的肿瘤细胞亚群。
我们进一步研究发现，随着鼻咽癌转移灶细胞在裸鼠体内的不断演进，肿瘤细胞的A值、增殖指数、移植瘤瘤重不断增加，体积倍增时间不断减少，表明肿瘤细胞在裸鼠体内及体外培养时的增殖能力均不断增强，且明显高于原代肿瘤细胞。提示，肿瘤细胞转移能力和增殖能力之间，关系十分密切。免疫组织化学半定量结果表明，随着转移灶细胞在裸鼠体内的不断演进，TGFa、EGFR及PDGFR的表达不断增强，并和肿瘤细胞的转移能力密切相关，肿瘤细胞转移能力越强,其TGFa、EGFR及PDGFR的表达亦高。
, 百拇医药
细胞遗传学研究表明，CNE-2Z-H5克隆株与高淋巴道转移的肿瘤细胞之间，细胞遗传学特性存在一定差异。克隆株细胞的染色体数目分布比较集中，染色体数目在83～93，众数为86～88，这是因为克隆株是从单个细胞增殖而来，细胞群体比较单纯的缘故。高淋巴道转移的肿瘤细胞则不同，表现在其染色体数目变化范围较大，众数也较分散，染色体数变化在64～103，众数为80～83，比克隆株要少5～6条。这种差别主要是由于克隆株在裸鼠体内经过多次淋巴结转移灶癌组织的筛选后，其遗传学特性可能发生改变，而这一细胞遗传学特性可能和其高转移特性密切相关。在染色体结构变化方面，两种细胞在G显带水平上都有一系列结构复杂的标记染色体，但两者尚无明显的差异，这可能是因为在细胞遗传学水平尚不能真正发现其标记染色体细微差别，有待于今后在分子细胞遗传学方法进行更深入的探讨。
参考文献
1 邓惠华, 胡新荣, 唐慰萍.人低分化鼻咽癌细胞克隆亚系的分离及生长特性观察.广东医学院学报, 1994,12：99-101.
, 百拇医药
2 胡新荣,邓惠华,李飞虹,等.低分化鼻咽癌细胞系(CNE-2Z-H5)及其21个克隆株的癌细胞电泳分析. 湛江医学院学报,1993,11：20-22.
3 Nicolson G L. Tumor cell instability, diversification, and progression to the metastatic phenotype: from oncogene to oncofetal exprssion. Cancer Res, 1987, 47:1473-1487.
4 黄剑，唐慰萍，姚运红，等.鼻咽癌克隆株裸鼠移植瘤自发性转移及群体增殖能力的研究.癌症，1996，15：1-3.
(收稿：1997-09-05 修回：1998-05-20), 百拇医药