人肝癌细胞与LAK细胞凋亡的超微结构比较*
作者：张锦 孙劲旅 陈海滨 周燕琼
单位：汕头大学医学院组织学与胚胎学教研室 广东省汕头市 515031
关键词：肝肿瘤；细胞株；LAK细胞；细胞凋亡
华人消化杂志981018Ultrastructural comparison of apoptosis of human hepatoma cells and LAK cells*
ZHANG Jin-Kun, SUN Jin-Lu, CHEN Hai-Bin and ZHOU Yan-Qiong
Department of Histology and Embryology, Shantou University Medical College, Shantou 515031, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Subject headings liver neoplasms; cell line; LAK cells; apoptosis
Abstract
AIM To study the ultrastructure of apoptosis of human hepatoma cell line BEL7402 and lymphokine activated killer (LAK) cells in vitro.
METHODS Mixed BEL7402 cells, dendritic cells isolated from human peripheral blood and human LAK (lymphokine & PHA activated killer) cells were cultured in RPMI 1640 supplemented with 100mL/L newborn calf serum (37℃， 50mL/L CO2 and 100% humidity, for 6h), while LAK cells alone were also cultured in the addendum cyclophosphamide under above mentioned cultural condition for 6h. The collected sediment cells for electron microscopy were fixed in 25g/L glutaraldehyde and 20g/L osmium. The specimens were embedded in the PDAP. Ultra-thin sections were routinely stained and observed under transmissional electron microscope.
, 百拇医药
RESULTS The nuclei of apoptotic BEL7402 cells and LAK cells were characterized by compaction and margination of chromatin and/or being followed by breaking up the nuclei into discrete fragments which were surrounded by a double-layered envelope. At the same time, some mitochondria also became denser. Then the condensed cell fragments budded out extracellularly forming the membrane bounded apoptotic bodies in some apoptotic BEL7402. Their changes of mitochondria and rough endoplasmic reticula were complex.
, http://www.100md.com
CONCLUSION The apoptotic BEL7402 cells and LAK cells have the basic characteristics of apoptosis, but their apoptotic morphologic induction was various, indicating that the organellae of the apoptotic splenocytes take part in the apoptotic processes actively.
中国图书资料分类号 R735.7
摘 要
目的 比较观察人肝癌细胞株BEL7402细胞与LAK细胞体外凋亡的超微结构.
方法 将BEL7402细胞、人血树突状细胞和人LAK细胞(淋巴因子和PHA激活的杀伤细胞)共同置于含100mL/L新生牛血清的1640培养液内，在37℃，50mL/L，CO2，饱湿条件下培养6h. 另将LAK细胞单独置于含有环磷酰胺的上述培养液内，在同样条件下培养6h. 收集沉淀细胞制备电镜样本. 细胞经25g/L戊二醛和20g/L锇酸双固定，PDAP包埋，超薄切片，常规染色，透射电镜观察.
, http://www.100md.com
结果 凋亡的BEL7402细胞与LAK细胞，其细胞核染色质浓缩、边集，核碎裂，离散的碎片外包以双层膜，一些线粒体也变得致密. 然而，在有些凋亡的BEL7402细胞内，可见浓缩的细胞碎片向细胞外出芽隆起，形成膜包的凋亡小体；其线粒体和粗面内质网的变化也较为复杂.
结论 凋亡的BEL7402细胞与LAK细胞均具有凋亡细胞的基本特征，但是两种凋亡细胞具体的形态表现不尽一致. 表明细胞内的主要细胞器主动参与了凋亡过程.
0 引言
细胞凋亡是肿瘤细胞死亡的一种形式，而LAK细胞能诱导肿瘤细胞凋亡也已被人们所证实. 然而，在LAK细胞诱导肿瘤细胞凋亡的同时，自身也可能发生凋亡. 如何区分这两种凋亡细胞，是实验研究中令人关注的问题. 我们采用人血树突状细胞和LAK细胞诱导人肝癌细胞凋亡，在透射电镜下进行比较观察，并与环磷酰胺诱导的人LAK细胞凋亡相对照，以对这两种凋亡细胞的鉴别提供形态学依据，并进一步探讨凋亡肝癌细胞细胞器的形态学变化及其意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 ①人肝癌细胞株BEL7402引自中山医科大学实验动物中心，置于含100mL/L新生牛血清的1640培养液内，在37℃，50mL/L CO2，饱湿条件下传代培养，细胞贴壁生长. 收集对数生长期的细胞用于凋亡细胞诱导实验. ②人LAK细胞的诱导：将健康人外周血单个核细胞调整为2×106/L，加入γhIL-2 1000kU/L，PHA 20mg/L，置于上述培养条件下培养7d. 其间加药半保留换液扩增一次. ③人血树突状细胞的分离：将健康人外周血单个核细胞悬液采用不连续Percoll密度梯度离心分离，收集35%～50%界面层细胞，再反复Panning数次，经36h培养后，收集高度富集的人血树突状细胞组.
1.2 方法 凋亡细胞的诱导取人LAK细胞、BEL7402细胞和人血树突状细胞，按10∶1∶0.1的比例混合后，置于含100mL/L新生牛血清的1640培养液内，在37℃，50mL/L CO2，饱湿条件下培养6h. 另将LAK细胞单独置于含有环磷酰胺的上述培养液内，在同样条件下培养6h. 收集上述离心沉淀细胞，经25g/L戊二醛和20g/L锇酸双固定，PDAP包埋，超薄切片，常规电子染色，日立H300透射电镜观察、摄片.
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2 结果
2.1 凋亡细胞核 凋亡的BEL7402细胞和凋亡的LAK细胞均有明显的细胞核移位、其染色质凝聚，有的浓缩成团块状，有的呈新月形、弧形边集于核膜下，也有的固缩碎裂成小块. 而凋亡的BEL7402细胞的核变化更为多样，如染色质可呈环形致密带，围于中间电子密度较低的核质区周围，使核呈面包圈状；或呈多个环形，大小不一，有的中央还可见残留的核仁；或完全固缩成一个均质致密的团块，使核呈黑洞样(图1-3).
2.2 凋亡细胞质 两种凋亡细胞胞质中均呈现数量不等的小空泡. 在凋亡的LAK细胞，除有时可见小而致密线粒体外，细胞器一般无明显改变(图3). 而在凋亡的BEL7402细胞，线粒体呈现多种形态，有的保持正常结构，有的皱缩变小，出现电子密度较高的致密小体，有的嵴紊乱，断裂、空泡化，也有的线粒体肿胀等，但界膜一般保存完好. 粗面内质网的变化也不一，可出现增生肥大，也可出现不同程度的退行性变，甚至呈现肿胀和空泡化的改变(图2).
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2.3 凋亡小体 凋亡的LAK细胞常在细胞内分解成数个凋亡小体，而且凋亡小体内多为单独的细胞核成分. 可观察浓缩、边集的染色质内含电子密度较低的核基质，外包以完整的双层膜(图4). 而在凋亡的BEL7402细胞，则多见浓缩的细胞碎片向细胞外出芽隆起，形成膜包的凋亡小体. 出芽部分的内含物较为复杂，有的只有单独的细胞质成分，内含退变的细胞器；有的则含有细胞核和细胞质两种成分. 同一细胞可有多个出芽隆起，形成多个包有不同内含物的、形态大小不一凋亡小体(图1).
图1 透射电镜，6h LD组，示凋亡的BEL7402细胞裂解成数个膜包的凋亡小体，内含浓缩的细胞核和细胞质. ×7000
图2 透射电镜，2.5h LD组，示凋亡BEL7402细胞核固缩成黑洞样，隆起的胞质正在形成膜包的凋亡小体，内含线粒体和内质网等细胞器. ×10 000
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图3 透射电镜，示凋亡的LAK细胞，其染色质浓缩成新月形边集于核膜下，中间的核质区电子密度相对较低. ×7000
图4 透射电镜，示凋亡的LAK细胞，正在细胞内分解成数个凋亡小体，而且凋亡小体内为单独的细胞核成分. ×7000
2.4 凋亡细胞的其他变化 两种凋亡细胞的体积较未凋亡细胞明显缩小，细胞表面的微绒毛减少或消失. 在凋亡的LAK细胞，细胞一般变圆或接近圆形和卵圆形. 而在凋亡的BEL7402细胞，细胞变为不规则形，细胞膜常皱缩，有时可见小泡. 在人LAK细胞、BEL7402细胞和人血树突状细胞混合培养实验内形成的凋亡的LAK细胞与在单独置于含有环磷酰胺的培养液内形成的凋亡的LAK细胞相比较，其形态无明显差别.
3 讨论
我们采用人血树突状细胞联合LAK细胞来诱导人肝癌细胞凋亡，其原因有二：一是诱导7d的LAK细胞以CTL细胞表型特征为主，诱导肝癌细胞凋亡的活性较强；二是树突状细胞是一种抗原呈递能力极强的免疫辅助细胞，表面有许多树枝状突起，大大增加了细胞的表面积，有利用于接触抗原；又因其表面持续表达大量的MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ和B7等分子和其他辅助分子，能有效地与肿瘤抗原结合并呈递肿瘤抗原[1]，有利于LAK细胞识别肿瘤细胞膜上的共同决定簇，启动LAK细胞杀伤肿瘤细胞. 此外，树突状细胞还能与LAK形成细胞簇，形成树突状细胞与LAK功能活动的微环境[2]. 实验表明，人血树突状细胞联合LAK细胞能诱导人肝癌细胞凋亡，而与此同时，部分LAK细胞自身也随之凋亡，因而在同一标本中可观察到凋亡的BEL7402细胞和凋亡的LAK细胞. 两种细胞均具有凋亡细胞的基本形态特征，如显示了染色质浓缩边集成半月形的早期凋亡改变，核固缩、核碎裂直至凋亡小体形成的晚期凋亡改变. 又显示了胞体缩小，细胞表面的微绒毛减少或消失；线粒体出现致密性改变，而细胞膜保持完好等典型的凋亡形态变化[3].
, 百拇医药
然而，两种凋亡细胞比较，BEL7402细胞的改变更为复杂. 细胞核浓缩、碎裂的形态较为多样，这可能是由于肿瘤细胞发生凋亡时，裂解的DNA片断的长度不一定全部为180～200个碱基对(bp)的倍数，而可以出现在30～300bp之间. 如此，在DNA凝胶电泳上不能形成“梯子状”(ladder)[4，5]，而因倍数不同使形态上出现大小不一的碎块. 加上体外凋亡小体的去向不能像体内那样主要由吞噬细胞吞噬清除，而是最终肿胀裂解，这就导致了凋亡碎片的形态更加多种多样，极其不规则. 至于我们在片中未见到凋亡的树突状细胞，是因在本实验条件下树突状细胞未出现凋亡，还是因树突状细胞在标本中所占比例甚微，加上超薄切片的局限性而未能切到，尚待进一步探讨.
其次，在BEL7402细胞中，细胞器的变化，特别是线粒体的变化表现得相当复杂，这可能与BEL7402细胞的细胞器比较发达，而在凋亡过程中，细胞内的主要细胞器主动参与了凋亡过程有关. 如在凋亡基因调控方面，bcl-2基因家族在决定细胞生存和死亡问题上起重要作用. 而bcl-2主要分布在线粒体膜上，bcl-2家族的成员之一的Bax单独作用可加速凋亡发生，加上其他凋亡信号，导致线粒体发生一系列变化. 诸如线粒体膜电位的改变，通透性的增加，能量代谢障碍等[6]，以至于在形态上出现脂质化的致密小体，嵴紊乱、断裂、空泡化及线粒体肿胀等，但界膜一般保存完好[7，8]. 至于粗面内质网，是一种功能活跃的细胞器，在凋亡发生早期，粗面内质网的增生肥大可能与弥补丧失的细胞成分有关，以后又可能与分割和包裹细胞的各种成分、凋亡相关蛋白和凋亡相关蛋白抑制物的合成等因素有关[9，10]. 但凋亡的信号同样可使粗面内质网产生脱颗粒，退化变性及空泡化等一系列改变.
, http://www.100md.com
在凋亡细胞的形态改变上，BEL7402细胞也较LAK细胞更不规则，这可能与BEL7402细胞的细胞骨架和核骨架的多样化改变有关[11]，甚至与细胞骨架和核骨架的破坏有关. 在肝癌生物治疗研究中，效应细胞可导致肝癌细胞凋亡，但效应细胞本身也可发生凋亡. 由于两种凋亡细胞具体的形态表现不尽一致，因而在电镜下易于区分开来.
张锦，女，1943-03-07生，广东省澄海市人，汉族. 1965年南京铁道医学院本科毕业，教授. 主要从事免疫细胞及其抗肿瘤研究，曾获省部级科技成果进步奖二等奖，发表论文40篇.
*广东省高教厅自然科学重点资助项目
通讯作者 张锦，515031，汕头大学医学院组织学与胚胎学教研室广东省汕头市新陵路3号.
, http://www.100md.com *Supported by Natural Scientific Foundation of The Higher Education Office of Guangdong Province, No.19952901
Correspondence to:Prof. ZHANG Jin-Kun, Department of Histology and Embryology, Shantou University Medical College, 3 Xinlinglu, Shantou 515031, Guangdong Province, China
Tel. +86*754*8551151-2087， Fax. +86*754*8557562
收稿日期 1998-07-05
4 参考文献
, http://www.100md.com
1 Girolomoni G, Ricciardi-Castagnoli P. Dendritic cells hold promise for immunotherapy. Immunol Today, 1997;18(3):102-104
2 张锦，陈海滨，王骏，谢庆东. 人血树突状细胞形成细胞簇功能的体外观察. 解剖学杂志，1997；20(2)：160-164
3 Kerr JF, Winterford CM, Harmon BV. Apoptosis: its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 1994;73(8):2013-2026
4 Cohen GM, Sun XM, Snowden RT, Dinsdale D, Skilleter DN. Key morphological features of apoptosis may occur in the absence of inter-nucleosomal DNA fragmentation. Biochem J, 1992;286(Pt2):331-334
, 百拇医药
5 Collins RJ, Harmokn BV, Gobe GC, Kerr JF. Internucleosomal DNA Cleavage should not be the sole criterion for identifying apoptosis. Int J Radiat Biol, 1992;61(4):451-453
6 Marchetti P, Castedo M, Susin SA, Zamzami N, Hirsch T, Macho A et al. Mitochondrial Permeability transition is a central coordinating event of apoptosis. J Exp Med, 1996;184(3):1155-1160
7 Kroemer G, Petit P, Zamzami N, Vayssiere JL, Mignotte B. The biochemistry of programmed cell death. FASEB J, 1995;9(13):1277-1287
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8 Howie SE, Harrison DJ, Wyllie AH. Lymphocyte apoptosis-mechanisms and implications in disease. Immunol Rev, 1994;142(1):141-156
9 Waring P. DNA fragmentation induced in macrophages by gliotoxin does not require protein synthesis and is preceded by raised inositol triphosphate levels. J Biol Chem, 1990;265(24):14476-14480
10 Ijiri K, Potten CS. Further studies on the response of intestinal crypt cells of different hierarchical status to eighteen different cytotoxic agents. Br J Cancer, 1987;55(2):113-123
11 Tinnemans MM, Lenders MH, ten veid GP, Ramaker FC, Schutte B. Alteration in cytoskeletal and nuclear matrix-associated proteins during apoptosis. Eur J Cell Biol, 1995;68(1):35-46, 百拇医药
单位：汕头大学医学院组织学与胚胎学教研室 广东省汕头市 515031
关键词：肝肿瘤；细胞株；LAK细胞；细胞凋亡
华人消化杂志981018Ultrastructural comparison of apoptosis of human hepatoma cells and LAK cells*
ZHANG Jin-Kun, SUN Jin-Lu, CHEN Hai-Bin and ZHOU Yan-Qiong
Department of Histology and Embryology, Shantou University Medical College, Shantou 515031, Guangdong Province, China
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Subject headings liver neoplasms; cell line; LAK cells; apoptosis
Abstract
AIM To study the ultrastructure of apoptosis of human hepatoma cell line BEL7402 and lymphokine activated killer (LAK) cells in vitro.
METHODS Mixed BEL7402 cells, dendritic cells isolated from human peripheral blood and human LAK (lymphokine & PHA activated killer) cells were cultured in RPMI 1640 supplemented with 100mL/L newborn calf serum (37℃， 50mL/L CO2 and 100% humidity, for 6h), while LAK cells alone were also cultured in the addendum cyclophosphamide under above mentioned cultural condition for 6h. The collected sediment cells for electron microscopy were fixed in 25g/L glutaraldehyde and 20g/L osmium. The specimens were embedded in the PDAP. Ultra-thin sections were routinely stained and observed under transmissional electron microscope.
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RESULTS The nuclei of apoptotic BEL7402 cells and LAK cells were characterized by compaction and margination of chromatin and/or being followed by breaking up the nuclei into discrete fragments which were surrounded by a double-layered envelope. At the same time, some mitochondria also became denser. Then the condensed cell fragments budded out extracellularly forming the membrane bounded apoptotic bodies in some apoptotic BEL7402. Their changes of mitochondria and rough endoplasmic reticula were complex.
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CONCLUSION The apoptotic BEL7402 cells and LAK cells have the basic characteristics of apoptosis, but their apoptotic morphologic induction was various, indicating that the organellae of the apoptotic splenocytes take part in the apoptotic processes actively.
中国图书资料分类号 R735.7
摘 要
目的 比较观察人肝癌细胞株BEL7402细胞与LAK细胞体外凋亡的超微结构.
方法 将BEL7402细胞、人血树突状细胞和人LAK细胞(淋巴因子和PHA激活的杀伤细胞)共同置于含100mL/L新生牛血清的1640培养液内，在37℃，50mL/L，CO2，饱湿条件下培养6h. 另将LAK细胞单独置于含有环磷酰胺的上述培养液内，在同样条件下培养6h. 收集沉淀细胞制备电镜样本. 细胞经25g/L戊二醛和20g/L锇酸双固定，PDAP包埋，超薄切片，常规染色，透射电镜观察.
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结果 凋亡的BEL7402细胞与LAK细胞，其细胞核染色质浓缩、边集，核碎裂，离散的碎片外包以双层膜，一些线粒体也变得致密. 然而，在有些凋亡的BEL7402细胞内，可见浓缩的细胞碎片向细胞外出芽隆起，形成膜包的凋亡小体；其线粒体和粗面内质网的变化也较为复杂.
结论 凋亡的BEL7402细胞与LAK细胞均具有凋亡细胞的基本特征，但是两种凋亡细胞具体的形态表现不尽一致. 表明细胞内的主要细胞器主动参与了凋亡过程.
0 引言
细胞凋亡是肿瘤细胞死亡的一种形式，而LAK细胞能诱导肿瘤细胞凋亡也已被人们所证实. 然而，在LAK细胞诱导肿瘤细胞凋亡的同时，自身也可能发生凋亡. 如何区分这两种凋亡细胞，是实验研究中令人关注的问题. 我们采用人血树突状细胞和LAK细胞诱导人肝癌细胞凋亡，在透射电镜下进行比较观察，并与环磷酰胺诱导的人LAK细胞凋亡相对照，以对这两种凋亡细胞的鉴别提供形态学依据，并进一步探讨凋亡肝癌细胞细胞器的形态学变化及其意义.
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1 材料和方法
1.1 材料 ①人肝癌细胞株BEL7402引自中山医科大学实验动物中心，置于含100mL/L新生牛血清的1640培养液内，在37℃，50mL/L CO2，饱湿条件下传代培养，细胞贴壁生长. 收集对数生长期的细胞用于凋亡细胞诱导实验. ②人LAK细胞的诱导：将健康人外周血单个核细胞调整为2×106/L，加入γhIL-2 1000kU/L，PHA 20mg/L，置于上述培养条件下培养7d. 其间加药半保留换液扩增一次. ③人血树突状细胞的分离：将健康人外周血单个核细胞悬液采用不连续Percoll密度梯度离心分离，收集35%～50%界面层细胞，再反复Panning数次，经36h培养后，收集高度富集的人血树突状细胞组.
1.2 方法 凋亡细胞的诱导取人LAK细胞、BEL7402细胞和人血树突状细胞，按10∶1∶0.1的比例混合后，置于含100mL/L新生牛血清的1640培养液内，在37℃，50mL/L CO2，饱湿条件下培养6h. 另将LAK细胞单独置于含有环磷酰胺的上述培养液内，在同样条件下培养6h. 收集上述离心沉淀细胞，经25g/L戊二醛和20g/L锇酸双固定，PDAP包埋，超薄切片，常规电子染色，日立H300透射电镜观察、摄片.
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2 结果
2.1 凋亡细胞核 凋亡的BEL7402细胞和凋亡的LAK细胞均有明显的细胞核移位、其染色质凝聚，有的浓缩成团块状，有的呈新月形、弧形边集于核膜下，也有的固缩碎裂成小块. 而凋亡的BEL7402细胞的核变化更为多样，如染色质可呈环形致密带，围于中间电子密度较低的核质区周围，使核呈面包圈状；或呈多个环形，大小不一，有的中央还可见残留的核仁；或完全固缩成一个均质致密的团块，使核呈黑洞样(图1-3).
2.2 凋亡细胞质 两种凋亡细胞胞质中均呈现数量不等的小空泡. 在凋亡的LAK细胞，除有时可见小而致密线粒体外，细胞器一般无明显改变(图3). 而在凋亡的BEL7402细胞，线粒体呈现多种形态，有的保持正常结构，有的皱缩变小，出现电子密度较高的致密小体，有的嵴紊乱，断裂、空泡化，也有的线粒体肿胀等，但界膜一般保存完好. 粗面内质网的变化也不一，可出现增生肥大，也可出现不同程度的退行性变，甚至呈现肿胀和空泡化的改变(图2).
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2.3 凋亡小体 凋亡的LAK细胞常在细胞内分解成数个凋亡小体，而且凋亡小体内多为单独的细胞核成分. 可观察浓缩、边集的染色质内含电子密度较低的核基质，外包以完整的双层膜(图4). 而在凋亡的BEL7402细胞，则多见浓缩的细胞碎片向细胞外出芽隆起，形成膜包的凋亡小体. 出芽部分的内含物较为复杂，有的只有单独的细胞质成分，内含退变的细胞器；有的则含有细胞核和细胞质两种成分. 同一细胞可有多个出芽隆起，形成多个包有不同内含物的、形态大小不一凋亡小体(图1).
图1 透射电镜，6h LD组，示凋亡的BEL7402细胞裂解成数个膜包的凋亡小体，内含浓缩的细胞核和细胞质. ×7000
图2 透射电镜，2.5h LD组，示凋亡BEL7402细胞核固缩成黑洞样，隆起的胞质正在形成膜包的凋亡小体，内含线粒体和内质网等细胞器. ×10 000
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图3 透射电镜，示凋亡的LAK细胞，其染色质浓缩成新月形边集于核膜下，中间的核质区电子密度相对较低. ×7000
图4 透射电镜，示凋亡的LAK细胞，正在细胞内分解成数个凋亡小体，而且凋亡小体内为单独的细胞核成分. ×7000
2.4 凋亡细胞的其他变化 两种凋亡细胞的体积较未凋亡细胞明显缩小，细胞表面的微绒毛减少或消失. 在凋亡的LAK细胞，细胞一般变圆或接近圆形和卵圆形. 而在凋亡的BEL7402细胞，细胞变为不规则形，细胞膜常皱缩，有时可见小泡. 在人LAK细胞、BEL7402细胞和人血树突状细胞混合培养实验内形成的凋亡的LAK细胞与在单独置于含有环磷酰胺的培养液内形成的凋亡的LAK细胞相比较，其形态无明显差别.
3 讨论
我们采用人血树突状细胞联合LAK细胞来诱导人肝癌细胞凋亡，其原因有二：一是诱导7d的LAK细胞以CTL细胞表型特征为主，诱导肝癌细胞凋亡的活性较强；二是树突状细胞是一种抗原呈递能力极强的免疫辅助细胞，表面有许多树枝状突起，大大增加了细胞的表面积，有利用于接触抗原；又因其表面持续表达大量的MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ和B7等分子和其他辅助分子，能有效地与肿瘤抗原结合并呈递肿瘤抗原[1]，有利于LAK细胞识别肿瘤细胞膜上的共同决定簇，启动LAK细胞杀伤肿瘤细胞. 此外，树突状细胞还能与LAK形成细胞簇，形成树突状细胞与LAK功能活动的微环境[2]. 实验表明，人血树突状细胞联合LAK细胞能诱导人肝癌细胞凋亡，而与此同时，部分LAK细胞自身也随之凋亡，因而在同一标本中可观察到凋亡的BEL7402细胞和凋亡的LAK细胞. 两种细胞均具有凋亡细胞的基本形态特征，如显示了染色质浓缩边集成半月形的早期凋亡改变，核固缩、核碎裂直至凋亡小体形成的晚期凋亡改变. 又显示了胞体缩小，细胞表面的微绒毛减少或消失；线粒体出现致密性改变，而细胞膜保持完好等典型的凋亡形态变化[3].
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然而，两种凋亡细胞比较，BEL7402细胞的改变更为复杂. 细胞核浓缩、碎裂的形态较为多样，这可能是由于肿瘤细胞发生凋亡时，裂解的DNA片断的长度不一定全部为180～200个碱基对(bp)的倍数，而可以出现在30～300bp之间. 如此，在DNA凝胶电泳上不能形成“梯子状”(ladder)[4，5]，而因倍数不同使形态上出现大小不一的碎块. 加上体外凋亡小体的去向不能像体内那样主要由吞噬细胞吞噬清除，而是最终肿胀裂解，这就导致了凋亡碎片的形态更加多种多样，极其不规则. 至于我们在片中未见到凋亡的树突状细胞，是因在本实验条件下树突状细胞未出现凋亡，还是因树突状细胞在标本中所占比例甚微，加上超薄切片的局限性而未能切到，尚待进一步探讨.
其次，在BEL7402细胞中，细胞器的变化，特别是线粒体的变化表现得相当复杂，这可能与BEL7402细胞的细胞器比较发达，而在凋亡过程中，细胞内的主要细胞器主动参与了凋亡过程有关. 如在凋亡基因调控方面，bcl-2基因家族在决定细胞生存和死亡问题上起重要作用. 而bcl-2主要分布在线粒体膜上，bcl-2家族的成员之一的Bax单独作用可加速凋亡发生，加上其他凋亡信号，导致线粒体发生一系列变化. 诸如线粒体膜电位的改变，通透性的增加，能量代谢障碍等[6]，以至于在形态上出现脂质化的致密小体，嵴紊乱、断裂、空泡化及线粒体肿胀等，但界膜一般保存完好[7，8]. 至于粗面内质网，是一种功能活跃的细胞器，在凋亡发生早期，粗面内质网的增生肥大可能与弥补丧失的细胞成分有关，以后又可能与分割和包裹细胞的各种成分、凋亡相关蛋白和凋亡相关蛋白抑制物的合成等因素有关[9，10]. 但凋亡的信号同样可使粗面内质网产生脱颗粒，退化变性及空泡化等一系列改变.
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在凋亡细胞的形态改变上，BEL7402细胞也较LAK细胞更不规则，这可能与BEL7402细胞的细胞骨架和核骨架的多样化改变有关[11]，甚至与细胞骨架和核骨架的破坏有关. 在肝癌生物治疗研究中，效应细胞可导致肝癌细胞凋亡，但效应细胞本身也可发生凋亡. 由于两种凋亡细胞具体的形态表现不尽一致，因而在电镜下易于区分开来.
张锦，女，1943-03-07生，广东省澄海市人，汉族. 1965年南京铁道医学院本科毕业，教授. 主要从事免疫细胞及其抗肿瘤研究，曾获省部级科技成果进步奖二等奖，发表论文40篇.
*广东省高教厅自然科学重点资助项目
通讯作者 张锦，515031，汕头大学医学院组织学与胚胎学教研室广东省汕头市新陵路3号.
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Correspondence to:Prof. ZHANG Jin-Kun, Department of Histology and Embryology, Shantou University Medical College, 3 Xinlinglu, Shantou 515031, Guangdong Province, China
Tel. +86*754*8551151-2087， Fax. +86*754*8557562
收稿日期 1998-07-05
4 参考文献
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