胃粘膜上皮癌变过程中p53,p16基因的表达及其相关性研究*
作者：徐 虹1 周 琦2 严明珠1 王立东2
单位：1河南省肿瘤医院肿瘤研究所 河南省郑州市 450003；2河南医科大学癌症研究室
关键词：胃肿瘤/病理学；p53基因；p16基因；基因表达；胃粘膜/病理学
华人消化杂志981037Subject headings stomach neoplasms/pathology; p53 gene; p16 gene; gene expression; gastric mucosa/pathology;
中国图书资料分类号 R735.2
本文分析肿瘤抑制基因p53和p16在胃粘膜癌变过程中的表达，并探讨其意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 全部150例标本为1994/1997收集的胃粘膜活检组织和部分手术切除的癌组织. 肿瘤患者术前未接受放疗和化疗. 组织做常规组织学脱水，石蜡包埋和连续切片. 切片分别进行HE染色做组织病理学诊断和免疫组化研究，采用以往报道的胃粘膜病理学诊断标准[1]，将胃粘膜上皮分为正常(n=15)，慢性表浅性胃炎(n=27)，慢性萎缩性胃炎(n=28)，不典型增生(n=22)和腺癌(n=58).
1.2 方法 采用ABC法. 一抗(Ab-6)为鼠单克隆抗人P53蛋白抗体(Oncegene Science Inc U.S.A)，稀释倍数1∶500. 兔抗人P16多克隆抗体，N-20(DAco Inc. Canada)，稀释倍数1∶100. 试剂盒和DAB低物试剂盒(Vecter laboratories Inc. U.S.A). 实验步骤：切片脱蜡至水，0.1% H2O2室温孵育20min灭活内源性过氧化氢酶，正常马血清(1∶50)和正常人血清(1∶50)室温孵育20min，封闭非特异性反应，加一抗4℃孵育12h，2% BSA稀释生物素标记的二抗至1∶200，室温孵育45min，ABC室温孵育60min(使用前30min配制)，二氨基联苯胺(DAB和H2O2混合液孵育4min～10min，显微镜下观察结果.
, 百拇医药
2 结果
2.1 病理资料 150例标本中，胃粘膜上皮正常15例，慢性表浅性胃炎27例，慢性萎缩性胃炎28例，不典型增生22例，腺癌58例.
2.2 肿瘤抑制基因p53,p16在胃粘膜上皮细胞癌变过程中的表达变化 见表1.
表1 P53在胃粘膜各级病变中的表达变化n(%) 组织学类型
n
P53
P16
正常
15
0 ( 0.0)
, 百拇医药
13 (86.7)
浅表性胃炎
27
0 ( 0.0)
23 (85.0)
萎缩性胃炎
28
5 (17.9)
22 (78.6)c
不典型增生
22
7 (31.8)
, 百拇医药
7 (31.8)c
腺癌
58
30 (51.7)a
28 (48.3)
aP<0.05，vs 萎缩性胃炎组；cP<0.05，vs 正常组.
正常胃粘膜上皮无P53蛋白表达，慢性表浅性胃炎偶见散在的弱阳性细胞，萎缩性胃炎、不典型增生、胃腺癌均有不同程度的P53蛋白表达，表达率随病变加重而增高(分别为17.9%，31.8%，51.7%，腺癌与萎缩性胃炎比P<0.005，χ2检验)，P16蛋白在正常胃粘膜表达率最高(86%)，随病变进展表达率逐渐降低，以不典型增生降低幅度最大，到腺癌略有上升，但两者差异不显著. 不典型增生、腺癌与正常组比较差异有显著性意义(P<0.005，χ2检验). P53与P16阳性表达呈显著性相关(χ2检验，P<0.005)，30例P53阳性组织中，同时伴有P16表达的组织20例(67%)，而伴P16表达缺失的组织仅10例，前者高于后者(χ2检验，P<0.01).
, 百拇医药
3 讨论
人体p53基因位于染色体17P13，它存在5个高度进化保守区，是人类肿瘤中p53基因突变的热点区. 野生型p53基因是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起着重要作用[2]. p16是一种新的肿瘤抑癌基因，它位于染色体9P21，因其对多种肿瘤有抑制作用而被称为多种肿瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor 1, MTS1). 最近研究发现，p16基因及其产物在人类许多原发肿瘤和细胞株中发生缺失[3]. 本研究对胃粘膜上皮基因表达状况的检测显示：除正常胃粘膜和表浅性胃炎外，其余各级病变均有p53基因表达，其表达率以胃癌组织最高(51.7%)，其次是不典型增生(31.8%)，这一现象提示p53基因异常在胃癌形成过程中起着重要作用，其异常表达出现在胃粘膜癌变的早期阶段. 而P16蛋白在正常胃粘膜上皮中呈高表达(86.6%，13/15)，随着病变的发展，其表达呈下降趋势，表现为程度不同的蛋白水平表达缺失，这种蛋白表达水平的降低以不典型增生病变最为明显(表达率31.8%，7/22)，至癌阶段略有回升，但较正常上皮、浅表性胃炎和萎缩性胃炎比仍呈明显的低表达状态. 本研究观察到的原发性胃癌组织切片肿瘤抑制基因p53与p16的相关性主要表现在P53阳性组织大多同时伴有P16蛋白表达. Takashi et al[4]对5种具有紊乱的Rb和P53蛋白的细胞株分析显示，所有5种细胞株均检测到高水平的P16，这些现象提示P16可被P53负性调节，P53功能失活可激活P16 mRNA的转录和(或)降低P16 mRNA的稳定性. 因此，癌基因的激活，抑癌基因的失活最终导致细胞周期失控，细胞无限制生长，可能是肿瘤发生的内在原因.
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助课题，No.39670296.
通讯作者 徐虹
收稿日期 1998-07-30
4 参考文献
1 Wang LD, Stephanie TS, Zhou Q, Goldstein S, Hong JY, Shao P et al. Changes in P53 and cyelin D1 protein levels and cell proliferation in different stages of human esophageal and gastric cardie carcinogenesis. Int J Cancer, 1994;59(2):514-517
2 Fuju Chang, Stina Syrianen, Kari Syrjanen. Implications of the P53 tumor-suppressor gene in clinical oncology. J Clin Oncol, 1995;13(4):1009
, 百拇医药
3 周琦，邹建湘，陈玉龙，王立东，李永欣，郭花芹 et al. 肿瘤抑癌基因p16和Rb在胃上皮癌变过程中的表达. 新消化病学杂志，1997；5(11)：705-706
4 Takashi Matozaki, Choitsu Sakamoto, Toshiya Suzuki, Kohei Matsuda, Tohru Uchida, Osamu Nakano et al. p53 gene mutations in human gastric cancer. Wild-Type P53 but not mutant P53 suppresses growth of human gastric cancer cell. Cancer Res, 1992;52(16):4335-4341, 百拇医药(徐 虹1 周 琦2 严明珠1 王立东2)
单位：1河南省肿瘤医院肿瘤研究所 河南省郑州市 450003；2河南医科大学癌症研究室
关键词：胃肿瘤/病理学；p53基因；p16基因；基因表达；胃粘膜/病理学
华人消化杂志981037Subject headings stomach neoplasms/pathology; p53 gene; p16 gene; gene expression; gastric mucosa/pathology;
中国图书资料分类号 R735.2
本文分析肿瘤抑制基因p53和p16在胃粘膜癌变过程中的表达，并探讨其意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 全部150例标本为1994/1997收集的胃粘膜活检组织和部分手术切除的癌组织. 肿瘤患者术前未接受放疗和化疗. 组织做常规组织学脱水，石蜡包埋和连续切片. 切片分别进行HE染色做组织病理学诊断和免疫组化研究，采用以往报道的胃粘膜病理学诊断标准[1]，将胃粘膜上皮分为正常(n=15)，慢性表浅性胃炎(n=27)，慢性萎缩性胃炎(n=28)，不典型增生(n=22)和腺癌(n=58).
1.2 方法 采用ABC法. 一抗(Ab-6)为鼠单克隆抗人P53蛋白抗体(Oncegene Science Inc U.S.A)，稀释倍数1∶500. 兔抗人P16多克隆抗体，N-20(DAco Inc. Canada)，稀释倍数1∶100. 试剂盒和DAB低物试剂盒(Vecter laboratories Inc. U.S.A). 实验步骤：切片脱蜡至水，0.1% H2O2室温孵育20min灭活内源性过氧化氢酶，正常马血清(1∶50)和正常人血清(1∶50)室温孵育20min，封闭非特异性反应，加一抗4℃孵育12h，2% BSA稀释生物素标记的二抗至1∶200，室温孵育45min，ABC室温孵育60min(使用前30min配制)，二氨基联苯胺(DAB和H2O2混合液孵育4min～10min，显微镜下观察结果.
, 百拇医药
2 结果
2.1 病理资料 150例标本中，胃粘膜上皮正常15例，慢性表浅性胃炎27例，慢性萎缩性胃炎28例，不典型增生22例，腺癌58例.
2.2 肿瘤抑制基因p53,p16在胃粘膜上皮细胞癌变过程中的表达变化 见表1.
表1 P53在胃粘膜各级病变中的表达变化n(%) 组织学类型
n
P53
P16
正常
15
0 ( 0.0)
, 百拇医药
13 (86.7)
浅表性胃炎
27
0 ( 0.0)
23 (85.0)
萎缩性胃炎
28
5 (17.9)
22 (78.6)c
不典型增生
22
7 (31.8)
, 百拇医药
7 (31.8)c
腺癌
58
30 (51.7)a
28 (48.3)
aP<0.05，vs 萎缩性胃炎组；cP<0.05，vs 正常组.
正常胃粘膜上皮无P53蛋白表达，慢性表浅性胃炎偶见散在的弱阳性细胞，萎缩性胃炎、不典型增生、胃腺癌均有不同程度的P53蛋白表达，表达率随病变加重而增高(分别为17.9%，31.8%，51.7%，腺癌与萎缩性胃炎比P<0.005，χ2检验)，P16蛋白在正常胃粘膜表达率最高(86%)，随病变进展表达率逐渐降低，以不典型增生降低幅度最大，到腺癌略有上升，但两者差异不显著. 不典型增生、腺癌与正常组比较差异有显著性意义(P<0.005，χ2检验). P53与P16阳性表达呈显著性相关(χ2检验，P<0.005)，30例P53阳性组织中，同时伴有P16表达的组织20例(67%)，而伴P16表达缺失的组织仅10例，前者高于后者(χ2检验，P<0.01).
, 百拇医药
3 讨论
人体p53基因位于染色体17P13，它存在5个高度进化保守区，是人类肿瘤中p53基因突变的热点区. 野生型p53基因是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起着重要作用[2]. p16是一种新的肿瘤抑癌基因，它位于染色体9P21，因其对多种肿瘤有抑制作用而被称为多种肿瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor 1, MTS1). 最近研究发现，p16基因及其产物在人类许多原发肿瘤和细胞株中发生缺失[3]. 本研究对胃粘膜上皮基因表达状况的检测显示：除正常胃粘膜和表浅性胃炎外，其余各级病变均有p53基因表达，其表达率以胃癌组织最高(51.7%)，其次是不典型增生(31.8%)，这一现象提示p53基因异常在胃癌形成过程中起着重要作用，其异常表达出现在胃粘膜癌变的早期阶段. 而P16蛋白在正常胃粘膜上皮中呈高表达(86.6%，13/15)，随着病变的发展，其表达呈下降趋势，表现为程度不同的蛋白水平表达缺失，这种蛋白表达水平的降低以不典型增生病变最为明显(表达率31.8%，7/22)，至癌阶段略有回升，但较正常上皮、浅表性胃炎和萎缩性胃炎比仍呈明显的低表达状态. 本研究观察到的原发性胃癌组织切片肿瘤抑制基因p53与p16的相关性主要表现在P53阳性组织大多同时伴有P16蛋白表达. Takashi et al[4]对5种具有紊乱的Rb和P53蛋白的细胞株分析显示，所有5种细胞株均检测到高水平的P16，这些现象提示P16可被P53负性调节，P53功能失活可激活P16 mRNA的转录和(或)降低P16 mRNA的稳定性. 因此，癌基因的激活，抑癌基因的失活最终导致细胞周期失控，细胞无限制生长，可能是肿瘤发生的内在原因.
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助课题，No.39670296.
通讯作者 徐虹
收稿日期 1998-07-30
4 参考文献
1 Wang LD, Stephanie TS, Zhou Q, Goldstein S, Hong JY, Shao P et al. Changes in P53 and cyelin D1 protein levels and cell proliferation in different stages of human esophageal and gastric cardie carcinogenesis. Int J Cancer, 1994;59(2):514-517
2 Fuju Chang, Stina Syrianen, Kari Syrjanen. Implications of the P53 tumor-suppressor gene in clinical oncology. J Clin Oncol, 1995;13(4):1009
, 百拇医药
3 周琦，邹建湘，陈玉龙，王立东，李永欣，郭花芹 et al. 肿瘤抑癌基因p16和Rb在胃上皮癌变过程中的表达. 新消化病学杂志，1997；5(11)：705-706
4 Takashi Matozaki, Choitsu Sakamoto, Toshiya Suzuki, Kohei Matsuda, Tohru Uchida, Osamu Nakano et al. p53 gene mutations in human gastric cancer. Wild-Type P53 but not mutant P53 suppresses growth of human gastric cancer cell. Cancer Res, 1992;52(16):4335-4341, 百拇医药(徐 虹1 周 琦2 严明珠1 王立东2)