骨桥蛋白在人肾、鼠肾中的表达
作者：姜学军 冯陶 常连胜 郭应禄
单位：100034 北京医科大学第一医院北京医科大学泌尿外科研究所
关键词：
中华医学杂志981132 骨桥蛋白(OPN)作为一种分泌型钙离子结合的、富含唾液酸的磷酸化糖蛋白，最早从骨的基质中分离出。近来的研究表明，OPN对草酸钙晶体的生长有抑制作用[1]。我们利用免疫组化和原位杂交技术，对OPN及其mRNA在人肾、正常大鼠肾脏和结石鼠肾的表达部位进行了研究，并探讨了其在尿石形成中的作用。
一、材料和方法
1.材料：将本院住院的6例肾肿瘤患者肿瘤肾脏切除后，立即取小块正常肾组织浸于4%的多聚甲醛(4℃)，6小时后系列乙醇脱水(乙醇稀释用0.1%DEPC处理过的三蒸水)，二甲苯透明、浸蜡制成蜡块。正常雄性SD大鼠10只，体重150～200 g，随机分为2组。实验组(结石组)饮水中加1%的乙二醇和1%的氯化铵，对照组不加，代谢笼饲养3周，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛腹主动脉灌注固定，(每只400 ml)，取肾脏制成蜡块。
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2.探针的制备：人OPN cDNA的质粒OP-10，经(5′端)Xho1和Xbal(3′端)酶切线性化。大鼠OPN cDNA质粒2B7经BamHⅠ(5′端)和Hind Ⅲ(3′端)酶切线性化体，外转录方法，用T3和T7启动子合成反义及正义地高辛标记。
3.免疫组织学化和原位杂交：LSAB方法进行免疫组织化学，用PBS代替一抗的切片作为阴性对照。原位杂交：5 μm石蜡切片，系列乙醇湿化入PBS，蛋白酶K(3 μg/ml)37℃放置30分钟，4%多聚甲醛固定10分钟，0.2 mol/L盐酸和0.1 mol三乙醇胺各10分钟，100%、90%、80%和70%乙醇各2分钟，风干，加含cRNA探针杂交液，50℃杂交16小时，TNE洗片，RNA酶消化37℃30分钟，2×SSC洗片，封闭液封闭30分钟，加抗地高辛抗体4℃过夜，后经NBT、BICP显色；加正义链探针的切片作为阴笥对照。
二、结果
, http://www.100md.com 间接免疫过氧化物酶染色，OPN在人肾近曲、远曲、亨利氏襻细段和集合管呈黄褐色染色；大鼠肾脏，OPN在远曲小管和集合管染色；结石鼠肾明显增强。未加抗体的组织切片无染色。OPN的mRNA主要染色于肾小管间质，髓质集合管呈散在染色。实验组和对照组大鼠肾均在远曲小管和集合管着色；结石鼠肾表达明显增强。碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体与探针地高辛结合，NBT、BICP显色呈蓝黑色；加正义链探针的组织切片无染色。
三、讨论
自H.Shiraga等[1]首先从正常人尿中通过亲和层析对Osteopontin进行了分离以后，人们对其肾脏的分布情况进行了研究[2]。在小鼠肾脏，OPN的表达比较恒定，主要见于亨利氏襻升支粗段和远曲小管[2]。而OPN在大鼠肾脏的表达，各种研究结果并不完全一致。Kohri等[3]的结果显示，正常和结石鼠肾，OPN及其mRNA均着色于肾脏的远曲小管，两者间区别在于染色的深浅不同。本结果表明，OPN及其mRNA均染色于远曲小管和集合管，与前述结果不尽一致。我们采用的灌注固定方法，能更好的防止OPN及RNA的降解。并且实验中用了两种不同的抗OPN的抗体。出现不同结果的原因，我们认为可能与下列因素有关：(1)不同种属间，OPN的表达存有区别；(2)正常肾脏与病变肾脏及不同肾脏病变，OPN的表达不尽相同[3，4]；(3)实验方法和条件不同也可能对结果产生一定的影响[4]。
, http://www.100md.com
对于人肾表达OPN的研究比较少，OPN在人结石肾组织中表达的研究更少见，这可能与取材较难有关。Brown等[5]报道OPN染色于远曲小管和髓质集合管，其mRNA只见于髓质的部分远曲小管上皮。本实验结果是，OPN在人肾的近曲、远曲、亨利氏襻和集合管，而其mRNA则表达于肾小管间质，只有部分上皮细胞有散在染色。不仅与前者结果不同，而且，与在大鼠肾脏的表达也不同。原因可能是，肾小春它部位OPN mRNA量较少，不能被原位杂交方法检测出。另一种可能是肾小管间质组织分泌的OPN，被肾小管上皮摄取，又排出到肾小管腔，最后成为尿液的成分。
另我们观察到，草酸前体诱导大成石，肾小管OPN及其mRNA染色均增强。这可能表示，当肾小管上皮细胞受到草酸钙晶体刺激后，通过增加表达OPN的量，来保护肾脏免受晶体的沉积，防止肾脏结石的形成。
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
, 百拇医药
1 Shiraga H, Min W, VanDussen WJ, et al. Inhibition of calcium oxalate crystal growth in vitro by uropontin: Another member of the aspartic acid-rich protein superfamily. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89:462-430.
2 Lopez CA, Hoyer JR, Wilson PD, et al. Heterogeneity of osteopontin expression among nephrons in mouse kidneys and enhanced expression in sclerotic glomeruli. Lab Invest, 1993, 69: 355-363.
3 Kohri K, Nomura S, Kitamura Y, et al. Structure and expression of the mRNA encoding urinary stone protein (osteopontin). J Biol Chem, 1993, 268:15180-15184.
4 Kleinman JG, Beshensky A, Worcester EM, et al. Expression of osteopontin, a urinary inhibitor of stone mineral crystal growth, in rat kidney. Kidney Int, 1995, 47:1585-1596.
(收稿：1997-12-16 修回：1998-08-20), http://www.100md.com
单位：100034 北京医科大学第一医院北京医科大学泌尿外科研究所
关键词：
中华医学杂志981132 骨桥蛋白(OPN)作为一种分泌型钙离子结合的、富含唾液酸的磷酸化糖蛋白，最早从骨的基质中分离出。近来的研究表明，OPN对草酸钙晶体的生长有抑制作用[1]。我们利用免疫组化和原位杂交技术，对OPN及其mRNA在人肾、正常大鼠肾脏和结石鼠肾的表达部位进行了研究，并探讨了其在尿石形成中的作用。
一、材料和方法
1.材料：将本院住院的6例肾肿瘤患者肿瘤肾脏切除后，立即取小块正常肾组织浸于4%的多聚甲醛(4℃)，6小时后系列乙醇脱水(乙醇稀释用0.1%DEPC处理过的三蒸水)，二甲苯透明、浸蜡制成蜡块。正常雄性SD大鼠10只，体重150～200 g，随机分为2组。实验组(结石组)饮水中加1%的乙二醇和1%的氯化铵，对照组不加，代谢笼饲养3周，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛腹主动脉灌注固定，(每只400 ml)，取肾脏制成蜡块。
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2.探针的制备：人OPN cDNA的质粒OP-10，经(5′端)Xho1和Xbal(3′端)酶切线性化。大鼠OPN cDNA质粒2B7经BamHⅠ(5′端)和Hind Ⅲ(3′端)酶切线性化体，外转录方法，用T3和T7启动子合成反义及正义地高辛标记。
3.免疫组织学化和原位杂交：LSAB方法进行免疫组织化学，用PBS代替一抗的切片作为阴性对照。原位杂交：5 μm石蜡切片，系列乙醇湿化入PBS，蛋白酶K(3 μg/ml)37℃放置30分钟，4%多聚甲醛固定10分钟，0.2 mol/L盐酸和0.1 mol三乙醇胺各10分钟，100%、90%、80%和70%乙醇各2分钟，风干，加含cRNA探针杂交液，50℃杂交16小时，TNE洗片，RNA酶消化37℃30分钟，2×SSC洗片，封闭液封闭30分钟，加抗地高辛抗体4℃过夜，后经NBT、BICP显色；加正义链探针的切片作为阴笥对照。
二、结果
, http://www.100md.com 间接免疫过氧化物酶染色，OPN在人肾近曲、远曲、亨利氏襻细段和集合管呈黄褐色染色；大鼠肾脏，OPN在远曲小管和集合管染色；结石鼠肾明显增强。未加抗体的组织切片无染色。OPN的mRNA主要染色于肾小管间质，髓质集合管呈散在染色。实验组和对照组大鼠肾均在远曲小管和集合管着色；结石鼠肾表达明显增强。碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体与探针地高辛结合，NBT、BICP显色呈蓝黑色；加正义链探针的组织切片无染色。
三、讨论
自H.Shiraga等[1]首先从正常人尿中通过亲和层析对Osteopontin进行了分离以后，人们对其肾脏的分布情况进行了研究[2]。在小鼠肾脏，OPN的表达比较恒定，主要见于亨利氏襻升支粗段和远曲小管[2]。而OPN在大鼠肾脏的表达，各种研究结果并不完全一致。Kohri等[3]的结果显示，正常和结石鼠肾，OPN及其mRNA均着色于肾脏的远曲小管，两者间区别在于染色的深浅不同。本结果表明，OPN及其mRNA均染色于远曲小管和集合管，与前述结果不尽一致。我们采用的灌注固定方法，能更好的防止OPN及RNA的降解。并且实验中用了两种不同的抗OPN的抗体。出现不同结果的原因，我们认为可能与下列因素有关：(1)不同种属间，OPN的表达存有区别；(2)正常肾脏与病变肾脏及不同肾脏病变，OPN的表达不尽相同[3，4]；(3)实验方法和条件不同也可能对结果产生一定的影响[4]。
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对于人肾表达OPN的研究比较少，OPN在人结石肾组织中表达的研究更少见，这可能与取材较难有关。Brown等[5]报道OPN染色于远曲小管和髓质集合管，其mRNA只见于髓质的部分远曲小管上皮。本实验结果是，OPN在人肾的近曲、远曲、亨利氏襻和集合管，而其mRNA则表达于肾小管间质，只有部分上皮细胞有散在染色。不仅与前者结果不同，而且，与在大鼠肾脏的表达也不同。原因可能是，肾小春它部位OPN mRNA量较少，不能被原位杂交方法检测出。另一种可能是肾小管间质组织分泌的OPN，被肾小管上皮摄取，又排出到肾小管腔，最后成为尿液的成分。
另我们观察到，草酸前体诱导大成石，肾小管OPN及其mRNA染色均增强。这可能表示，当肾小管上皮细胞受到草酸钙晶体刺激后，通过增加表达OPN的量，来保护肾脏免受晶体的沉积，防止肾脏结石的形成。
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
, 百拇医药
1 Shiraga H, Min W, VanDussen WJ, et al. Inhibition of calcium oxalate crystal growth in vitro by uropontin: Another member of the aspartic acid-rich protein superfamily. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89:462-430.
2 Lopez CA, Hoyer JR, Wilson PD, et al. Heterogeneity of osteopontin expression among nephrons in mouse kidneys and enhanced expression in sclerotic glomeruli. Lab Invest, 1993, 69: 355-363.
3 Kohri K, Nomura S, Kitamura Y, et al. Structure and expression of the mRNA encoding urinary stone protein (osteopontin). J Biol Chem, 1993, 268:15180-15184.
4 Kleinman JG, Beshensky A, Worcester EM, et al. Expression of osteopontin, a urinary inhibitor of stone mineral crystal growth, in rat kidney. Kidney Int, 1995, 47:1585-1596.
(收稿：1997-12-16 修回：1998-08-20), http://www.100md.com