大鼠局灶性脑缺血后白细胞浸润及强力霉素干预效果的观察
作者：李光勤 董为伟
单位：400016 重庆医科大学附属第一医院神经内科
关键词：
中华医学杂志981130 已证实，在脑缺血区存在明显的白细胞浸润，并认为白细胞浸润是缺血性脑损害发生及发展的重要因素之一[1]。然而，有关脑缺血后白细胞浸润的时空规律及药物干预研究甚少。为此，我们对这两个方面进行了研究。
一、材料与方法
1.实验动物：选用健康雄性Wistar大鼠，体重250～300 g，由我校实验动物中心提供。
2.大鼠局灶脑缺血/再灌流模型：采用经颈外动脉插入线栓法，制成右侧大脑中动脉(MCA)闭塞/再通模型。
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3.实验分组(1) 白细胞浸润时间变化研究：包括持久性MCA闭塞(PMCAO)组及MCA闭塞(MCAO)3小时再灌流组，每一时相点4只大鼠。(2) 脑缺血区髓过氧化物酶(MPO)活性和强力霉素效果及机理研究：选脑缺血3小昌再灌流6小时(I3hR6h)作为观察时相点。进一步分为：假手术组、对照组、前用药组(MCAO前30分钟静脉注射强力霉素，剂量10 mg/kg)、再灌流用药组(再灌流后立即给予强力霉素)、强力霉素+钙剂组(MCAO前30分钟先注射强力霉素，接着注射葡萄糖酸钙，剂量50 mg/kg)及强力霉素+镁剂组(MCAO前30分钟先注射强力霉素，接着注射硫酸镁，剂量50 mg/kg)，每组6只大鼠。
4.观察指标：(1) 外周血白细胞(WBC)计数：取尾静脉血采用常规显微镜下计数。(2) 血清Ca2+、Mg2+浓度测定：取尾静脉血,用全自动生化仪(日立7170A)测定血清Ca2+、Mg2+含量。
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(3) 梗塞体积测定：用求积仪测定对照组及前用药组的脑梗塞体积百分比。(4) 大脑皮质rCBF测定：采用LDF-3型激光血流仪测定前囟后1 mm、右3.5 mm处大脑皮质的rCBF。测定MCAO前、I3h及R6h的rCBF。(5) 缺血脑组织MPO活性测定：采用文献方法测定MCA供血区脑组织的MPO活性。(6) MPO免疫组织化学染色：采用Lojda方法观察对照组及前用药组MPO活性染色的分布及数量变化(采用MAS-1图象分析系统计算灰阶)。[3] (7) 凋亡细胞免疫组织化学染色：采用TUNEL方法。于镜下直接计算病变侧的凋亡细胞数目。
二、结果
1.大鼠脑缺血/再灌流前后生理指标变化：对照组及前用药组大鼠I3hR6h前后血压、脉搏、外周血WBC计数及血清Ca2+、Mg2+含量均性变化均无显著意义。
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2.大鼠脑缺血区MPO活性的时间变化：大鼠PMCAO后脑缺血区MPO活性于6小时开始升高，8小时达高峰，12小时后逐渐下降，24小时又出现一小高峰，72小时后降至正常水平。MCAO3小时再通后脑组织MPO活性于再通后1小时开始升高，24小时达高峰，后逐渐下降，再通后5天降至正常水平，7天仍处于正常水平。提示模型不同脑缺血区白细胞浸润的时间变化规律也不相同。
3.强力霉素对大鼠CBF和梗塞体积及MPO活性的影响：大鼠I3h时MCA区大脑皮质rCBF明显降低，R6h后的rCBF较I3h有明显升高，但仍明显低于缺血前水平，脑缺血前给予强力霉素可显著提高大鼠I3h及R6h时的rCBF，但仍未达到缺血前水平。脑缺血前或再灌流后静脉给予强力霉素可显著降低大鼠I3hR6h的MPO活性分别为0.89±0.07及1.68±0.07 U/g，对照组为1.86±0.08 U/g两者比较，P<0.01)；镁剂可拮抗强力霉素对MPO活性的降低作用MPO为1.78±0.11 U/g，而钙剂无此作用MPO为0.87±0.06 U/g。脑缺血前给予强力霉素可显著缩小I3hR6h的梗塞体积百分比(0.19±0.02，对照组为0.33±0.04，两者比较P<0.01)，而再通后给药其梗塞体积百分比(0.30±0.03)无明显缩小。
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4.强力霉素对大鼠脑缺血区MPO染色及细胞凋亡的影响：大鼠I3hR6h脑组织切片的MPO活性染色及凋亡细胞检测发现两者均主要分布于梗塞灶的内侧区。脑缺血前应用强力霉素可显著减少MPO活性染色及凋亡细胞数目(凋亡细胞数为103±20，与对照组287±30相比，P<0.01)。
三、讨论
1.脑缺血后白细胞浸润的发生及时空关系：脑缺血后，血液中流动的白细胞在细胞粘附分子的介导下粘附于微血管内皮细胞，并移行于血管外，形成白细胞浸润[1]。脑缺血再灌流后，血液中的白细胞大量进入缺血区，进一步加重白细胞粘附及浸润。粘附浸润的白细胞可加重脑损害。实验研究发现缺血区白细胞浸润程度与梗塞灶大小之间存在相关关系。脑缺血后的白细胞浸润具有一定的时空关系，但不同动物及不同脑缺血模型的白细胞浸润的时空关系不同。我们的研究也证实这一点。
2.抑制白细胞浸润对缺血性脑损害的影响：本研究发现，在大鼠MCA闭塞前应用强力霉素可显著减轻缺血区的白细胞浸润程度、提高CBF、减少凋亡细胞及缩小梗塞体积，也证实白细胞浸润及细胞凋亡主要位于梗塞灶周边。提示白细胞浸润可能与凋亡的发生有关。另外，在大鼠MCAO3h再通后给予强力霉素对再灌流6小时的梗塞体积并无缩小作用，提示强力霉素减轻缺血性脑损害具有一定的治疗时间窗。研究结果差异的原因可能有关：(1) 动物模型及研究方法的不同；(2) 脑缺血时间、程度及范围不同；(3) 抗白细胞浸润抗体或药物的剂量及用药时间的不同。
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3.强力霉素抑制白细胞浸润的机制：强力霉素，能透过血脑屏障，脑脊液中的浓度较高。强力霉素具有络合二价阳离子特性，能抑制人中性白细胞及单核细胞粘附，已证实强力霉素是通过结合Mg2+、Ca2+来抑制白细胞粘附的，在白细胞粘附中Mg2+比Ca2+起着更重要的作用[4]。本研究表明，镁剂可消除强力霉素对脑缺血区白细胞浸润的抑制作用，而钙剂作用不明显。
参考文献
1 Kochanek PM, Hallenbeck JM. Polymorphonuclear leukocytes and monocytes/macrophages in the pathogenesis of cerebral ischemia and stroke. Stroke 1992;23:1367-1379.
, http://www.100md.com 2 罗武生, 郭兆贵. 用髓过氧化物酶法定量测定心肌组织中的中性白细胞. 中国药理学通报，1990；6：264-266
3 陈啸梅, 周文郁, 彭俊云. 组织化学手册.北京：人民卫生出版社，1982.199.
4 Gabler W, Tsukuda N. The influence of divalent cations and doxycycline on iodoacetamide-inhibitable leukocyte adherence. Res Commun Chem Pathol Pharmacol，1991;74:131-140.
(收稿：1998-05-06 修回：1998-08-12), http://www.100md.com
单位：400016 重庆医科大学附属第一医院神经内科
关键词：
中华医学杂志981130 已证实，在脑缺血区存在明显的白细胞浸润，并认为白细胞浸润是缺血性脑损害发生及发展的重要因素之一[1]。然而，有关脑缺血后白细胞浸润的时空规律及药物干预研究甚少。为此，我们对这两个方面进行了研究。
一、材料与方法
1.实验动物：选用健康雄性Wistar大鼠，体重250～300 g，由我校实验动物中心提供。
2.大鼠局灶脑缺血/再灌流模型：采用经颈外动脉插入线栓法，制成右侧大脑中动脉(MCA)闭塞/再通模型。
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3.实验分组(1) 白细胞浸润时间变化研究：包括持久性MCA闭塞(PMCAO)组及MCA闭塞(MCAO)3小时再灌流组，每一时相点4只大鼠。(2) 脑缺血区髓过氧化物酶(MPO)活性和强力霉素效果及机理研究：选脑缺血3小昌再灌流6小时(I3hR6h)作为观察时相点。进一步分为：假手术组、对照组、前用药组(MCAO前30分钟静脉注射强力霉素，剂量10 mg/kg)、再灌流用药组(再灌流后立即给予强力霉素)、强力霉素+钙剂组(MCAO前30分钟先注射强力霉素，接着注射葡萄糖酸钙，剂量50 mg/kg)及强力霉素+镁剂组(MCAO前30分钟先注射强力霉素，接着注射硫酸镁，剂量50 mg/kg)，每组6只大鼠。
4.观察指标：(1) 外周血白细胞(WBC)计数：取尾静脉血采用常规显微镜下计数。(2) 血清Ca2+、Mg2+浓度测定：取尾静脉血,用全自动生化仪(日立7170A)测定血清Ca2+、Mg2+含量。
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(3) 梗塞体积测定：用求积仪测定对照组及前用药组的脑梗塞体积百分比。(4) 大脑皮质rCBF测定：采用LDF-3型激光血流仪测定前囟后1 mm、右3.5 mm处大脑皮质的rCBF。测定MCAO前、I3h及R6h的rCBF。(5) 缺血脑组织MPO活性测定：采用文献方法测定MCA供血区脑组织的MPO活性。(6) MPO免疫组织化学染色：采用Lojda方法观察对照组及前用药组MPO活性染色的分布及数量变化(采用MAS-1图象分析系统计算灰阶)。[3] (7) 凋亡细胞免疫组织化学染色：采用TUNEL方法。于镜下直接计算病变侧的凋亡细胞数目。
二、结果
1.大鼠脑缺血/再灌流前后生理指标变化：对照组及前用药组大鼠I3hR6h前后血压、脉搏、外周血WBC计数及血清Ca2+、Mg2+含量均性变化均无显著意义。
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2.大鼠脑缺血区MPO活性的时间变化：大鼠PMCAO后脑缺血区MPO活性于6小时开始升高，8小时达高峰，12小时后逐渐下降，24小时又出现一小高峰，72小时后降至正常水平。MCAO3小时再通后脑组织MPO活性于再通后1小时开始升高，24小时达高峰，后逐渐下降，再通后5天降至正常水平，7天仍处于正常水平。提示模型不同脑缺血区白细胞浸润的时间变化规律也不相同。
3.强力霉素对大鼠CBF和梗塞体积及MPO活性的影响：大鼠I3h时MCA区大脑皮质rCBF明显降低，R6h后的rCBF较I3h有明显升高，但仍明显低于缺血前水平，脑缺血前给予强力霉素可显著提高大鼠I3h及R6h时的rCBF，但仍未达到缺血前水平。脑缺血前或再灌流后静脉给予强力霉素可显著降低大鼠I3hR6h的MPO活性分别为0.89±0.07及1.68±0.07 U/g，对照组为1.86±0.08 U/g两者比较，P<0.01)；镁剂可拮抗强力霉素对MPO活性的降低作用MPO为1.78±0.11 U/g，而钙剂无此作用MPO为0.87±0.06 U/g。脑缺血前给予强力霉素可显著缩小I3hR6h的梗塞体积百分比(0.19±0.02，对照组为0.33±0.04，两者比较P<0.01)，而再通后给药其梗塞体积百分比(0.30±0.03)无明显缩小。
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4.强力霉素对大鼠脑缺血区MPO染色及细胞凋亡的影响：大鼠I3hR6h脑组织切片的MPO活性染色及凋亡细胞检测发现两者均主要分布于梗塞灶的内侧区。脑缺血前应用强力霉素可显著减少MPO活性染色及凋亡细胞数目(凋亡细胞数为103±20，与对照组287±30相比，P<0.01)。
三、讨论
1.脑缺血后白细胞浸润的发生及时空关系：脑缺血后，血液中流动的白细胞在细胞粘附分子的介导下粘附于微血管内皮细胞，并移行于血管外，形成白细胞浸润[1]。脑缺血再灌流后，血液中的白细胞大量进入缺血区，进一步加重白细胞粘附及浸润。粘附浸润的白细胞可加重脑损害。实验研究发现缺血区白细胞浸润程度与梗塞灶大小之间存在相关关系。脑缺血后的白细胞浸润具有一定的时空关系，但不同动物及不同脑缺血模型的白细胞浸润的时空关系不同。我们的研究也证实这一点。
2.抑制白细胞浸润对缺血性脑损害的影响：本研究发现，在大鼠MCA闭塞前应用强力霉素可显著减轻缺血区的白细胞浸润程度、提高CBF、减少凋亡细胞及缩小梗塞体积，也证实白细胞浸润及细胞凋亡主要位于梗塞灶周边。提示白细胞浸润可能与凋亡的发生有关。另外，在大鼠MCAO3h再通后给予强力霉素对再灌流6小时的梗塞体积并无缩小作用，提示强力霉素减轻缺血性脑损害具有一定的治疗时间窗。研究结果差异的原因可能有关：(1) 动物模型及研究方法的不同；(2) 脑缺血时间、程度及范围不同；(3) 抗白细胞浸润抗体或药物的剂量及用药时间的不同。
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3.强力霉素抑制白细胞浸润的机制：强力霉素，能透过血脑屏障，脑脊液中的浓度较高。强力霉素具有络合二价阳离子特性，能抑制人中性白细胞及单核细胞粘附，已证实强力霉素是通过结合Mg2+、Ca2+来抑制白细胞粘附的，在白细胞粘附中Mg2+比Ca2+起着更重要的作用[4]。本研究表明，镁剂可消除强力霉素对脑缺血区白细胞浸润的抑制作用，而钙剂作用不明显。
参考文献
1 Kochanek PM, Hallenbeck JM. Polymorphonuclear leukocytes and monocytes/macrophages in the pathogenesis of cerebral ischemia and stroke. Stroke 1992;23:1367-1379.
, http://www.100md.com 2 罗武生, 郭兆贵. 用髓过氧化物酶法定量测定心肌组织中的中性白细胞. 中国药理学通报，1990；6：264-266
3 陈啸梅, 周文郁, 彭俊云. 组织化学手册.北京：人民卫生出版社，1982.199.
4 Gabler W, Tsukuda N. The influence of divalent cations and doxycycline on iodoacetamide-inhibitable leukocyte adherence. Res Commun Chem Pathol Pharmacol，1991;74:131-140.
(收稿：1998-05-06 修回：1998-08-12), http://www.100md.com