梗阻性黄疸大鼠肝细胞膜Na+/K+ATP酶的变化
作者：吴问汉 黄莚庭
单位：100034 北京医科大学第一医院外科
关键词：
中华医学杂志981126 我们从分子生物学角度探讨了胆道梗阻及缓解过程中肝脏代谢胆红素机制，以了解梗组缓期肝功能和黄疸消退的规律。
一、材料与方法
1.动物分组：同种同系雄性Wistar鼠260只，体重300～350 g，随机分成13个组，每组20只：(1)对照组；92)胆道梗阻组，按梗组1、3、5、7、14、26天，分为6组；(3)胆道梗组缓组，于梗组1、7、14天缓解，缓解第1、7天取材，计6组。；(3)胆道梗阻缓解组，于梗组1、7、14天缓解，缓解第1、7天取材，计6组。
2.建立梗组性黄疸大鼠模型：胆总和结扎胆道梗阻模型：取Wistar鼠，上腹正中切口进腹，在近十二指肠侧双重结扎胆总管，按时取材。对照组：手术过程相同，但不结扎胆管，于术后第2天取材。
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3.建立梗阻胆道缓解模型：取梗阻性黄疸鼠，原切口进腹，显露梗阻近端扩张胆管及幽门下2.0 cm十二指肠，取内径0.5～1.0 mm透明资料管行梗阻近端-十二指肠搭桥易合，分别于术后1、7天取材。
4.肝细胞膜Na+/K+-ATP酶测定：采用Mayahara-Fujinoto及Kobayashi法。取实验鼠，开腹取新鲜肝脏，固定于2%戊二醛-0.1 mol/L二甲胂酸缓冲液内，经0.1 mol/L二甲胂酸缓冲液洗 后，在振动切片机上切片，孵育液内孵育，再经二甲胂酸冲液洗后，用戊二醛重固定。入锇酸-二甲胂酸缓冲液内后固定。逐级丙酮脱水，环氧树脂618倒扣包埋，聚合，超薄切片机切片，醋酸铀和硝酸铅重染色，JEM100CX-Ⅱ型透射电镜下观察。CMIAS图像分析仪测定Na+/K+ATP酶相对含量，以相对灰度比值表示。采用无底物孵育作为方法对照。
5.统计学处理；方差齐者用方差分析，方差不齐用秩和检验。
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二、结果
1.正常时，肝细胞膜Na+/K+ATP酶含量阳性，与无底物对照组相比，P<0.05。
2.正常状态下，肝细胞膜Na+/K+ATP酶分布不均匀，肝血窦面高于肝毛细胆管面(P<0.05)，肝毛细胆管面高于肝细胞间面(P<0.05)。
3.正常及胆道梗阻条件下，肝细胞膜Na+/K+ATP酶见表1。
4.胆道梗阻及缓解，肝细胞膜Na+/K+ATP酶变化见表2～4。
表1 正常及胆道梗阻时肝细胞膜血窦面、肝细胞间面和
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毛细胆管面Na+/K+ATP酶的变化(相对灰度比值，
±s) 组别
鼠数
肝血窦面
肝细胞间面
肝毛细胆管面
对照组
20
57±8
41±6
45±6
正常组
, 百拇医药
20
108±17
74±9
90±8
梗阻组
1天组
20
132±14
80±8
14±9
3天
20
117±21
, 百拇医药
75±9
115±8
5天
20
117±13
70±8
111±27
7天
20
90±14
65±13
78±15
14天
, 百拇医药
20
84±10
60±7
65±15
28天
20
84±8
60±13
60±16
注：肝血窦面：梗阻后7、14和28天组与前5组比；肝细胞面：梗阻后14、28天组与前4组比；肝毛细胆管面：梗阻后14、28天组与前4组比，均P<0.05表2 胆道便阻1天缓解时肝细胞膜Na+/K+ATP酶的变化(相对灰度比值，±s) 组别
, http://www.100md.com
鼠数
肝血窦面
肝细胞间面
肝毛细胆管面
正常组
20
108±17
74±9
90±8
梗阻1天
20
132±14*
80±8
, 百拇医药
140±9*
缓解1天
20
133±15*
85±8*
158±17*
缓解7天
20
139±24*
98±8*△
101±28*△
, http://www.100md.com
注：*与正常组比，△与梗阻1天组比，均P<0.05表3 胆道梗阻7天缓解时肝细胞膜Na+/K+ATP酶的变化(相对灰度比值，±s) 组别
鼠数
肝血窦面
肝细胞间面
肝毛细胆管面
正常
20
108±17
74±9
, http://www.100md.com
90±8
梗阻7天
20
90±14
65±13
78±15
缓解1天
20
100±9*
80±9*
81±16
缓解7天
, 百拇医药
20
110±8
71±12
89±13
注：*与梗阻7天组比，P<0.05表4 胆道梗阻14天缓解时肝细胞膜Na+/K+ATP酶的变化(相对灰度比值，±s) 组别
鼠数
肝血窦面
肝细胞间面
肝毛细胆管面
, http://www.100md.com 正常
20
108±17
74±9
90±8
梗阻14天
20
84±10*
60±7*
65±15*
缓解1天
20
, http://www.100md.com
86±14*
62±6*
68±19*
缓解7天
20
96±8*
65±6*△
85±7△
注：*与正常组比P<0.05，与缓解1天组比△P<0.05
三、讨论
, 百拇医药
Na+/K+ATP酶在肝细胞膜血窦面、肝细胞间面及毛细胆管面均存在，而肝血窦面Na+/K+ATP酶含量高于毛细胆管面[1]，本实验也证明了定点。在梗阻早期毛细胆管面酶含量明显高于血窦面。表明胆道梗阻时，胆道压力增高，肝细胞紧密连接减弱，分泌极性受到破坏，正常离子浓度梯度受到影响以及肝细胞膜流动性改变，使Na+/K+ATP酶含量增高。实验证明，毛细胆管面肝细胞膜酶含量增高和肝细胞钠钾泵激活可以仅通过改变膜流动性而增强，并不需要Na+/K+ATP酶位点的增多[2]。
持续的胆汁淤带可导致小胆管瘢痕形成而被阻断，进一步加重胆道梗阻；同时淤滞胆汁刺激小胆管周围炎症和纤维化，使肝窦压升高，引起肝实质灌流不良，造成局部微循环障碍，同时由于胆红素对肝线粒体的直接毒性作用，线粒体呼吸链及磷酸腺苷对氧的摄取利用受抑，肝脏生成ATP和酮体能力下降，使肝细胞能量代谢失调，Na+/K+ATP酶含量全面降低。Koyama等[3]认为胆道梗阻引起严重的肝功能损害，通常发生在完全梗阻后1～2周。在胆道梗阻早期缓解梗阻，Na+/K+ATP酶含量变化更敏感。当梗阻时间达到2周时，Na+/K+ATP酶含量受抑明显，梗阻缓解后酶含量仍能恢复，且随缓解时间延长，肝细胞膜Na+/K+ATP酶含量恢复明显，但缓解7天时仍低于正常组。
, 百拇医药
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Sulherland E, Dixon BS, Lefferl HL, et al. Biochemical localization of hepatic surface-membrane Na+/K+ATPase activity dcpcnds on membranc lipid fluidity. Med Sci, 1988,85：8673-8677.
2 Ayotte P, Plaa GL. Biliary excretion in sprague-dawley and gunn rats during manganese-bilirubin-induced cholestasia. Hepatology, 1988,8：1069-1078.
3 Koyama K, Takagi Y, Ito K, et al. Experimental and clinical sludies on the effecl of biliarydrainage in obstructive jaundice, Am J Surg, 1981,142：293-299.
(收稿：1997-07-28 修回：1998-06-20), http://www.100md.com
单位：100034 北京医科大学第一医院外科
关键词：
中华医学杂志981126 我们从分子生物学角度探讨了胆道梗阻及缓解过程中肝脏代谢胆红素机制，以了解梗组缓期肝功能和黄疸消退的规律。
一、材料与方法
1.动物分组：同种同系雄性Wistar鼠260只，体重300～350 g，随机分成13个组，每组20只：(1)对照组；92)胆道梗阻组，按梗组1、3、5、7、14、26天，分为6组；(3)胆道梗组缓组，于梗组1、7、14天缓解，缓解第1、7天取材，计6组。；(3)胆道梗阻缓解组，于梗组1、7、14天缓解，缓解第1、7天取材，计6组。
2.建立梗组性黄疸大鼠模型：胆总和结扎胆道梗阻模型：取Wistar鼠，上腹正中切口进腹，在近十二指肠侧双重结扎胆总管，按时取材。对照组：手术过程相同，但不结扎胆管，于术后第2天取材。
, http://www.100md.com
3.建立梗阻胆道缓解模型：取梗阻性黄疸鼠，原切口进腹，显露梗阻近端扩张胆管及幽门下2.0 cm十二指肠，取内径0.5～1.0 mm透明资料管行梗阻近端-十二指肠搭桥易合，分别于术后1、7天取材。
4.肝细胞膜Na+/K+-ATP酶测定：采用Mayahara-Fujinoto及Kobayashi法。取实验鼠，开腹取新鲜肝脏，固定于2%戊二醛-0.1 mol/L二甲胂酸缓冲液内，经0.1 mol/L二甲胂酸缓冲液洗 后，在振动切片机上切片，孵育液内孵育，再经二甲胂酸冲液洗后，用戊二醛重固定。入锇酸-二甲胂酸缓冲液内后固定。逐级丙酮脱水，环氧树脂618倒扣包埋，聚合，超薄切片机切片，醋酸铀和硝酸铅重染色，JEM100CX-Ⅱ型透射电镜下观察。CMIAS图像分析仪测定Na+/K+ATP酶相对含量，以相对灰度比值表示。采用无底物孵育作为方法对照。
5.统计学处理；方差齐者用方差分析，方差不齐用秩和检验。
, http://www.100md.com
二、结果
1.正常时，肝细胞膜Na+/K+ATP酶含量阳性，与无底物对照组相比，P<0.05。
2.正常状态下，肝细胞膜Na+/K+ATP酶分布不均匀，肝血窦面高于肝毛细胆管面(P<0.05)，肝毛细胆管面高于肝细胞间面(P<0.05)。
3.正常及胆道梗阻条件下，肝细胞膜Na+/K+ATP酶见表1。
4.胆道梗阻及缓解，肝细胞膜Na+/K+ATP酶变化见表2～4。
表1 正常及胆道梗阻时肝细胞膜血窦面、肝细胞间面和
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毛细胆管面Na+/K+ATP酶的变化(相对灰度比值，
±s) 组别鼠数
肝血窦面
肝细胞间面
肝毛细胆管面
对照组
20
57±8
41±6
45±6
正常组
, 百拇医药
20
108±17
74±9
90±8
梗阻组
1天组
20
132±14
80±8
14±9
3天
20
117±21
, 百拇医药
75±9
115±8
5天
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117±13
70±8
111±27
7天
20
90±14
65±13
78±15
14天
, 百拇医药
20
84±10
60±7
65±15
28天
20
84±8
60±13
60±16
注：肝血窦面：梗阻后7、14和28天组与前5组比；肝细胞面：梗阻后14、28天组与前4组比；肝毛细胆管面：梗阻后14、28天组与前4组比，均P<0.05表2 胆道便阻1天缓解时肝细胞膜Na+/K+ATP酶的变化(相对灰度比值，
±s) 组别, http://www.100md.com
鼠数
肝血窦面
肝细胞间面
肝毛细胆管面
正常组
20
108±17
74±9
90±8
梗阻1天
20
132±14*
80±8
, 百拇医药
140±9*
缓解1天
20
133±15*
85±8*
158±17*
缓解7天
20
139±24*
98±8*△
101±28*△
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注：*与正常组比，△与梗阻1天组比，均P<0.05表3 胆道梗阻7天缓解时肝细胞膜Na+/K+ATP酶的变化(相对灰度比值，
±s) 组别鼠数
肝血窦面
肝细胞间面
肝毛细胆管面
正常
20
108±17
74±9
, http://www.100md.com
90±8
梗阻7天
20
90±14
65±13
78±15
缓解1天
20
100±9*
80±9*
81±16
缓解7天
, 百拇医药
20
110±8
71±12
89±13
注：*与梗阻7天组比，P<0.05表4 胆道梗阻14天缓解时肝细胞膜Na+/K+ATP酶的变化(相对灰度比值，
±s) 组别鼠数
肝血窦面
肝细胞间面
肝毛细胆管面
, http://www.100md.com 正常
20
108±17
74±9
90±8
梗阻14天
20
84±10*
60±7*
65±15*
缓解1天
20
, http://www.100md.com
86±14*
62±6*
68±19*
缓解7天
20
96±8*
65±6*△
85±7△
注：*与正常组比P<0.05，与缓解1天组比△P<0.05
三、讨论
, 百拇医药
Na+/K+ATP酶在肝细胞膜血窦面、肝细胞间面及毛细胆管面均存在，而肝血窦面Na+/K+ATP酶含量高于毛细胆管面[1]，本实验也证明了定点。在梗阻早期毛细胆管面酶含量明显高于血窦面。表明胆道梗阻时，胆道压力增高，肝细胞紧密连接减弱，分泌极性受到破坏，正常离子浓度梯度受到影响以及肝细胞膜流动性改变，使Na+/K+ATP酶含量增高。实验证明，毛细胆管面肝细胞膜酶含量增高和肝细胞钠钾泵激活可以仅通过改变膜流动性而增强，并不需要Na+/K+ATP酶位点的增多[2]。
持续的胆汁淤带可导致小胆管瘢痕形成而被阻断，进一步加重胆道梗阻；同时淤滞胆汁刺激小胆管周围炎症和纤维化，使肝窦压升高，引起肝实质灌流不良，造成局部微循环障碍，同时由于胆红素对肝线粒体的直接毒性作用，线粒体呼吸链及磷酸腺苷对氧的摄取利用受抑，肝脏生成ATP和酮体能力下降，使肝细胞能量代谢失调，Na+/K+ATP酶含量全面降低。Koyama等[3]认为胆道梗阻引起严重的肝功能损害，通常发生在完全梗阻后1～2周。在胆道梗阻早期缓解梗阻，Na+/K+ATP酶含量变化更敏感。当梗阻时间达到2周时，Na+/K+ATP酶含量受抑明显，梗阻缓解后酶含量仍能恢复，且随缓解时间延长，肝细胞膜Na+/K+ATP酶含量恢复明显，但缓解7天时仍低于正常组。
, 百拇医药
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Sulherland E, Dixon BS, Lefferl HL, et al. Biochemical localization of hepatic surface-membrane Na+/K+ATPase activity dcpcnds on membranc lipid fluidity. Med Sci, 1988,85：8673-8677.
2 Ayotte P, Plaa GL. Biliary excretion in sprague-dawley and gunn rats during manganese-bilirubin-induced cholestasia. Hepatology, 1988,8：1069-1078.
3 Koyama K, Takagi Y, Ito K, et al. Experimental and clinical sludies on the effecl of biliarydrainage in obstructive jaundice, Am J Surg, 1981,142：293-299.
(收稿：1997-07-28 修回：1998-06-20), http://www.100md.com