大肠癌前病变与癌及脱落细胞端粒酶分析
作者：仇生龙1 黄锦湫1 王裕发2 彭志海1
单位：上海市第一人民医院 1普外科 2中心实验室 200080
关键词：结直肠肿瘤；癌前状态；端粒酶
华人消化杂志981124 Analysis of telomerase activity in colorectal cancer, precancerous lesions and cancer washings
QIU Sheng-Long1, HUANG Jin-Qiu1, WANG Yu-Fa2 and PENG Zhi-Hai1
, http://www.100md.com
Department of 1General Surgery, and 2 Central Laboratory, Shanghai First Municipal People＇s Hospital, Shanghai 200080, China
Subject headings colorectal neoplasms; precancerous conditions; telomerase
Abstract
AIM To study the relations between telomerase activity and colorectal cancer and precancerous lesions.
METHODS Telomerase activity was examined in 36 colorectal carcinomas and 20 corresponding normal mucosa and 15 precancerous lesions, including exfoliated cells washed from colorectal colectomy specimens of 15 patients with colorectal cancer with telomerase repeat amplification protocol (TRAP).
, 百拇医药
RESULTS Telomerase activity was positive in 30 of the 36 colorectal carcinomas (83.3%), while there was no activity in 18 corresponding normal mucosa. The other two normal tissues had activity. In precancerous lesions, 7 of 9 (77.8%) adenomas and 4 of 6 (66.7%) polyps were positive. Eight of the 15 (53.3%) cancer washings were also positive. There was no relationship between Dukes＇ classification and telomerase activity (P>0.05).
CONCLUSION Telomerase activity analysis provides significant information to the early diagnosis, prognosis evaluation and recurrence after operation in colorectal cancer.
, http://www.100md.com
中国图书资料分类号 R735.34
摘 要
目的 探讨端粒酶活性与大肠癌及癌前病变关系.
方法 应用端粒酶反复扩增法(TRAP)对大肠癌36例，相应的正常对照肠粘膜20例、大肠腺瘤及息肉15例进行端粒酶活性检测. 同时检测大肠癌脱落细胞15例端粒酶活性.
结果 大肠癌36例中端粒酶活性表达30例(83.3%)，正常肠粘膜中18例无活性(90%)，剩余2例为阳性，15例大肠癌前病变中，腺瘤和息肉端粒酶活性分别为77.8%(7/9)和66.7%(4/6). 另外我们进一步检测15例大肠癌患者标本脱落细胞端粒酶活性，亦发现8例阳性(53.3%)，端粒酶活性与Dukes病理分期无明显相关性(P>0.05).
结论 端粒酶活性分析对大肠癌的早期诊断、预后监测及术后复发具有特殊价值.
, 百拇医药
0 引言
端粒是真核生物线性染色体末端一种特殊的异质化结构，在染色体的定位、复制、保护和控制细胞生长寿命等方面起重要作用. 端粒长度的维持需要端粒酶的激活，除生殖细胞和成熟干细胞外，正常人体细胞并没有端粒酶活性表达，而恶性肿瘤中端粒酶被激活，从而赋予癌细胞无尽的分裂能力. 我们采用端粒酶反复扩增法(TRAP)研究大肠癌、癌前病变中端粒酶活性，探讨端粒酶活性分析是否可以作为大肠癌诊断及治疗的一个非损伤性的方法.
1 对象和方法
1.1 对象 大肠癌切除标本36例，相应的对照肠粘膜20例，腺瘤和息肉15例及肠癌脱落细胞15例均来源于我院手术及纤维肠镜检查患者. 每例标本收集后，置生理盐水试管中，-80℃快速冰冻贮存备用，所有组织分析前均经病理证实.
1.2 方法 端粒酶提取物的制备：取标本约50mg置Eppedorf试管中，加入裂解液200μL，混匀后冰上孵育30min，取上清4℃离心，转速16000r/min，20min，收集上清液. 同时设阳性和阴性对照：分别为胚胎肾细胞株293和肺成纤维细胞(IMR90). PCR-ELISA半定量检测端粒酶活性：采用PCR-ELISA法(试剂盒由德国Boehringer Mannheim提供)，利用高灵敏度的光度酶免疫反应半定量检测端粒酶活性，避免了同位素危险. ①引物延伸：将反应液(Tris缓冲液，端粒酶提取物，引物，核苷酸，Taq酶)加入扩增管中，25℃，30min. 加热至94℃，5min以灭活端粒酶活性. ②PCR扩增：循环参数：94℃，30s；50℃，30s；72℃，90s；循环30次，最后72℃，继续反应10min. ③ELISA：将PCR产物变性后，与地高辛标记且对端粒重复片段特异的探针进行杂交，杂交产物通过生物素标记的引物固定在抗生物素蛋白包被的微孔上，用过氧化物酶结合的抗地高辛抗体检测经固定的PCR产物. 最后加入过氧化物酶的代谢底物MTB便可产生颜色反应. 将实验结果用酶标仪测定450nm吸光度值A. 颜色的深浅与端粒酶活性成正比.
, 百拇医药
统计学处理 采用χ2检验.
2 结果
2.1 大肠癌端粒酶活性检出率 端粒酶活性是根据标本450nm吸光度值A，如果A>0.2，则被确认为阳性. 36例大肠癌组织中阳性率为83.3%(30/36)，20例正常对照肠粘膜仅2例为阳性，15例大肠癌前病变中，腺瘤和息肉端粒酶活性分别为77.8%(7/9)和66.7%(4/6). 端粒酶活性与Dukes病理分期无明显相关性(P>0.05，表1).
表1 大肠癌端粒酶活性与Dukes病理分期
(n,%)
Dukes分期
n
端粒酶阳性数
, http://www.100md.com
A
7
5 (71.4%)
B
5
4 (80.0%)
C
19
16 (84.2%)
D
5
5 (100.0%)
2.2 大肠癌标本脱落细胞端粒酶活性 为了评估肠腔脱落细胞端粒酶活性价值，我们对15例肠癌切除标本用生理盐水冲洗，离心后进行PCR-ELISA分析，结果提示有8例表现出端粒酶活性.
, 百拇医药
3 讨论
端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合物(RNP)，它以自身RNA组分为模板，合成端粒序列(人为TTAGGG)并添加到染色体末端，稳定染色体，阻止细胞分裂衰亡. Counter et al[1]认为端粒酶的表达是众多肿瘤发展所需要，是肿瘤无限制生长能力的关键步骤. 大肠癌是我国常见恶性肿瘤之一，近年来发病率有上升趋势，手术、化疗、放疗已大大改善了患者的预后. 然而，大肠癌的早期诊断仍是一个棘手问题. 应寻找一个可靠、非侵害性方法用与大肠癌的诊断与治疗.
端粒酶活性已被广泛地用于检测各种各样癌细胞[2]，人类肿瘤中胃癌85%，肝癌85%，神经细胞肿瘤94%，肺癌80%，乳房癌93%，前列腺癌85%. 相反端粒酶活性并不出现在正常成人干细胞中. 本组大肠癌端粒酶活性为83.3%，且端粒酶活性与Dukes分期无明显相关性(P>0.05). Tahara et al[3]报道20例大肠癌中约95%可表达端粒酶，这结果高于本实验结果. 但所有正常组织中无端粒酶活性表达，本组2例正常组织出现端粒酶活性，结果可能与正常组织存在恶变或人种间存在一定差异有关.
, http://www.100md.com
Yoshida et al[4]的研究中大肠癌端粒酶活性表达高达92%，溃疡性结肠炎7例有3例，Crohn病5例有1例，本组15例大肠癌前病变中9例腺瘤中有7例，6例息肉中有4例检测到端粒酶活性. Hiyama et al[5]对胃癌进行端粒酶活性与生存率关系研究发现，阳性患者临床表现为瘤体较大、进展期胃癌及胃癌转移者，同时早期胃癌的端粒酶阳性率明显高于晚期胃癌. 这些结果暗示端粒酶活性在胃肠癌早期形成阶段已经存在，为消化道肿瘤监测提供了可靠的指标. 通过15例大肠癌切除标本冲洗物分析，其中8例表达端粒酶活性，因此该方法可用于大肠癌高危人群的普查及作为一种非创伤性大肠癌的辅助诊治手段.
4 参考文献
1 Counter CM, Hirte HW. Bacchetti S, Harley CB. Telomerase activity in human ovarin carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA, 1994;91(8):2900-2904
, 百拇医药
2 Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, HO PLC et al. Specific association of human telomerase activity with immoratal cells and cancer. Science, 1994;266(5193):2011-2015
3 Tahara H, Kuniyasu H, Yasui W, Yokozaki H, Shay JW, Ide T et al. Telomerase activity in preneoplastic and neoplastic gastric and colorectal lesions. Clin Cancer Res, 1995;1(29):1245-1251
4 Yoshida K, Sugino T, Goodison S, Warren BF, Nolan D, Wadsworth S et al. Detection of telomerase activity in exfoliated cancer cells in colonic luminal washings and its related clinical implications. Br J Cancer, 1997;75(4):548-553
, 百拇医药
5 Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N, Hiyama K, Imamura Y, Murakami Y et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res, 1995;55(15):3258-3262
通讯作者 仇生龙，200080，上海市第一人民医院普外科.
Correspondence to:QIU Sheng-Long, Department of General Surgery, Shanghai First Municipal People＇s Hospital, Shanghai 200080, China
收稿日期 1998-06-29, 百拇医药(仇生龙1 黄锦湫1 王裕发2 彭志海1)
单位：上海市第一人民医院 1普外科 2中心实验室 200080
关键词：结直肠肿瘤；癌前状态；端粒酶
华人消化杂志981124 Analysis of telomerase activity in colorectal cancer, precancerous lesions and cancer washings
QIU Sheng-Long1, HUANG Jin-Qiu1, WANG Yu-Fa2 and PENG Zhi-Hai1
, http://www.100md.com
Department of 1General Surgery, and 2 Central Laboratory, Shanghai First Municipal People＇s Hospital, Shanghai 200080, China
Subject headings colorectal neoplasms; precancerous conditions; telomerase
Abstract
AIM To study the relations between telomerase activity and colorectal cancer and precancerous lesions.
METHODS Telomerase activity was examined in 36 colorectal carcinomas and 20 corresponding normal mucosa and 15 precancerous lesions, including exfoliated cells washed from colorectal colectomy specimens of 15 patients with colorectal cancer with telomerase repeat amplification protocol (TRAP).
, 百拇医药
RESULTS Telomerase activity was positive in 30 of the 36 colorectal carcinomas (83.3%), while there was no activity in 18 corresponding normal mucosa. The other two normal tissues had activity. In precancerous lesions, 7 of 9 (77.8%) adenomas and 4 of 6 (66.7%) polyps were positive. Eight of the 15 (53.3%) cancer washings were also positive. There was no relationship between Dukes＇ classification and telomerase activity (P>0.05).
CONCLUSION Telomerase activity analysis provides significant information to the early diagnosis, prognosis evaluation and recurrence after operation in colorectal cancer.
, http://www.100md.com
中国图书资料分类号 R735.34
摘 要
目的 探讨端粒酶活性与大肠癌及癌前病变关系.
方法 应用端粒酶反复扩增法(TRAP)对大肠癌36例，相应的正常对照肠粘膜20例、大肠腺瘤及息肉15例进行端粒酶活性检测. 同时检测大肠癌脱落细胞15例端粒酶活性.
结果 大肠癌36例中端粒酶活性表达30例(83.3%)，正常肠粘膜中18例无活性(90%)，剩余2例为阳性，15例大肠癌前病变中，腺瘤和息肉端粒酶活性分别为77.8%(7/9)和66.7%(4/6). 另外我们进一步检测15例大肠癌患者标本脱落细胞端粒酶活性，亦发现8例阳性(53.3%)，端粒酶活性与Dukes病理分期无明显相关性(P>0.05).
结论 端粒酶活性分析对大肠癌的早期诊断、预后监测及术后复发具有特殊价值.
, 百拇医药
0 引言
端粒是真核生物线性染色体末端一种特殊的异质化结构，在染色体的定位、复制、保护和控制细胞生长寿命等方面起重要作用. 端粒长度的维持需要端粒酶的激活，除生殖细胞和成熟干细胞外，正常人体细胞并没有端粒酶活性表达，而恶性肿瘤中端粒酶被激活，从而赋予癌细胞无尽的分裂能力. 我们采用端粒酶反复扩增法(TRAP)研究大肠癌、癌前病变中端粒酶活性，探讨端粒酶活性分析是否可以作为大肠癌诊断及治疗的一个非损伤性的方法.
1 对象和方法
1.1 对象 大肠癌切除标本36例，相应的对照肠粘膜20例，腺瘤和息肉15例及肠癌脱落细胞15例均来源于我院手术及纤维肠镜检查患者. 每例标本收集后，置生理盐水试管中，-80℃快速冰冻贮存备用，所有组织分析前均经病理证实.
1.2 方法 端粒酶提取物的制备：取标本约50mg置Eppedorf试管中，加入裂解液200μL，混匀后冰上孵育30min，取上清4℃离心，转速16000r/min，20min，收集上清液. 同时设阳性和阴性对照：分别为胚胎肾细胞株293和肺成纤维细胞(IMR90). PCR-ELISA半定量检测端粒酶活性：采用PCR-ELISA法(试剂盒由德国Boehringer Mannheim提供)，利用高灵敏度的光度酶免疫反应半定量检测端粒酶活性，避免了同位素危险. ①引物延伸：将反应液(Tris缓冲液，端粒酶提取物，引物，核苷酸，Taq酶)加入扩增管中，25℃，30min. 加热至94℃，5min以灭活端粒酶活性. ②PCR扩增：循环参数：94℃，30s；50℃，30s；72℃，90s；循环30次，最后72℃，继续反应10min. ③ELISA：将PCR产物变性后，与地高辛标记且对端粒重复片段特异的探针进行杂交，杂交产物通过生物素标记的引物固定在抗生物素蛋白包被的微孔上，用过氧化物酶结合的抗地高辛抗体检测经固定的PCR产物. 最后加入过氧化物酶的代谢底物MTB便可产生颜色反应. 将实验结果用酶标仪测定450nm吸光度值A. 颜色的深浅与端粒酶活性成正比.
, 百拇医药
统计学处理 采用χ2检验.
2 结果
2.1 大肠癌端粒酶活性检出率 端粒酶活性是根据标本450nm吸光度值A，如果A>0.2，则被确认为阳性. 36例大肠癌组织中阳性率为83.3%(30/36)，20例正常对照肠粘膜仅2例为阳性，15例大肠癌前病变中，腺瘤和息肉端粒酶活性分别为77.8%(7/9)和66.7%(4/6). 端粒酶活性与Dukes病理分期无明显相关性(P>0.05，表1).
表1 大肠癌端粒酶活性与Dukes病理分期
(n,%)
Dukes分期
n
端粒酶阳性数
, http://www.100md.com
A
7
5 (71.4%)
B
5
4 (80.0%)
C
19
16 (84.2%)
D
5
5 (100.0%)
2.2 大肠癌标本脱落细胞端粒酶活性 为了评估肠腔脱落细胞端粒酶活性价值，我们对15例肠癌切除标本用生理盐水冲洗，离心后进行PCR-ELISA分析，结果提示有8例表现出端粒酶活性.
, 百拇医药
3 讨论
端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合物(RNP)，它以自身RNA组分为模板，合成端粒序列(人为TTAGGG)并添加到染色体末端，稳定染色体，阻止细胞分裂衰亡. Counter et al[1]认为端粒酶的表达是众多肿瘤发展所需要，是肿瘤无限制生长能力的关键步骤. 大肠癌是我国常见恶性肿瘤之一，近年来发病率有上升趋势，手术、化疗、放疗已大大改善了患者的预后. 然而，大肠癌的早期诊断仍是一个棘手问题. 应寻找一个可靠、非侵害性方法用与大肠癌的诊断与治疗.
端粒酶活性已被广泛地用于检测各种各样癌细胞[2]，人类肿瘤中胃癌85%，肝癌85%，神经细胞肿瘤94%，肺癌80%，乳房癌93%，前列腺癌85%. 相反端粒酶活性并不出现在正常成人干细胞中. 本组大肠癌端粒酶活性为83.3%，且端粒酶活性与Dukes分期无明显相关性(P>0.05). Tahara et al[3]报道20例大肠癌中约95%可表达端粒酶，这结果高于本实验结果. 但所有正常组织中无端粒酶活性表达，本组2例正常组织出现端粒酶活性，结果可能与正常组织存在恶变或人种间存在一定差异有关.
, http://www.100md.com
Yoshida et al[4]的研究中大肠癌端粒酶活性表达高达92%，溃疡性结肠炎7例有3例，Crohn病5例有1例，本组15例大肠癌前病变中9例腺瘤中有7例，6例息肉中有4例检测到端粒酶活性. Hiyama et al[5]对胃癌进行端粒酶活性与生存率关系研究发现，阳性患者临床表现为瘤体较大、进展期胃癌及胃癌转移者，同时早期胃癌的端粒酶阳性率明显高于晚期胃癌. 这些结果暗示端粒酶活性在胃肠癌早期形成阶段已经存在，为消化道肿瘤监测提供了可靠的指标. 通过15例大肠癌切除标本冲洗物分析，其中8例表达端粒酶活性，因此该方法可用于大肠癌高危人群的普查及作为一种非创伤性大肠癌的辅助诊治手段.
4 参考文献
1 Counter CM, Hirte HW. Bacchetti S, Harley CB. Telomerase activity in human ovarin carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA, 1994;91(8):2900-2904
, 百拇医药
2 Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, HO PLC et al. Specific association of human telomerase activity with immoratal cells and cancer. Science, 1994;266(5193):2011-2015
3 Tahara H, Kuniyasu H, Yasui W, Yokozaki H, Shay JW, Ide T et al. Telomerase activity in preneoplastic and neoplastic gastric and colorectal lesions. Clin Cancer Res, 1995;1(29):1245-1251
4 Yoshida K, Sugino T, Goodison S, Warren BF, Nolan D, Wadsworth S et al. Detection of telomerase activity in exfoliated cancer cells in colonic luminal washings and its related clinical implications. Br J Cancer, 1997;75(4):548-553
, 百拇医药
5 Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N, Hiyama K, Imamura Y, Murakami Y et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res, 1995;55(15):3258-3262
通讯作者 仇生龙，200080，上海市第一人民医院普外科.
Correspondence to:QIU Sheng-Long, Department of General Surgery, Shanghai First Municipal People＇s Hospital, Shanghai 200080, China
收稿日期 1998-06-29, 百拇医药(仇生龙1 黄锦湫1 王裕发2 彭志海1)