结肠灌洗脱落细胞端粒酶活性诊断结肠癌的价值*
作者：贾 林 李瑜元
单位：广东省广州市第一人民医院消化科 510180
关键词：结肠肿瘤/诊断；端粒酶/分析；结肠灌洗物；脱落细胞
华人消化杂志981110 Telomerase activity of exfoliated cancer cells in colonic luminal washings*
JIA Lin and LI Yu-Yuan
Department of Digestive Diseases, Guangzhou First Municipal Hospital, Guangzhou 510180, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Subject headings colonic neoplasms/diagnosis; telomerase/analysis; colonic luminal washings; exfoliated cancer cells
Abstract
AIM To detect the value of telomerase activity in exfoliated cancer cells in colonic luminal washings.
METHODS Telomerase activity in 16 cases of colorectal tumor, their corresponding normal tissues, exfoliated cancer cells in colonic luminal washings in 16 cases of colorectal tumor and 6 cases of irritable bowel syndrome (IBS) were detected by polymerase chain-based telomeric repeat amplification protocol (TRAP) respectively.
, http://www.100md.com
RESULTS Telomerase activity was strongly positive in 10, weak positive in 3 and negative in 3 cases of tumor tissues, while there was weak positive in 2 and negative in 14 cases in 16 matched normal colonic tissue specimens. The positive rates of telomerase activity in colorectal tumor tissues and normal colonic tissue specimens were 81.3% and 12.5% respectively (P<0.01). Telomerase activity was detected in washings from 5 (31.3%) of the 16 colon carcinoma cases but not in any cases with IBS. The sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of detection of telomerase activity in luminal exfoliated cancer cells were 31.3%, 100%, 100% and 64.7% respectively.
, 百拇医药
CONCLUSION Telomerase activity in exfoliated cancer cells in colonic luminal washings is a good marker for the detection of colon carcinoma.
中国图书资料分类号 R735.35
摘 要
目的 端粒酶作为核糖核酸蛋白酶能使端粒延长而克服细胞衰老，与细胞永生和癌变密切相关，正常的躯体细胞无端粒酶活性，大多人类原发肿瘤均可探及端粒酶阳性. 本研究旨在探讨结肠脱落细胞端粒酶检测对结肠癌的临床诊断价值.
方法 采用端粒重复序列扩增法(TRAP)检测16例结肠癌外科手术新鲜标本、相邻的正常组织及其肠腔灌洗物，6例IBS患者的结肠镜抽取物的端粒酶活性.
, 百拇医药
结果 结肠癌组织16例，端粒酶强阳性10例，弱阳性3例和阴性3例，阳性率为81.3%；结肠癌远端正常肠粘膜组织的端粒酶强阳性、弱阳性和阴性分别为0，2和14例，阳性率为12.5%，两组P<0.01. 结肠癌结肠灌洗液16例中有5例端粒酶阳性，而6例IBS结肠镜抽取液全部为端粒酶阴性，其诊断的敏感性和特异性分别为31.3%和100%，阳性预测值和阴性预测值分别为100%和64.7%.
结论 结肠灌洗脱落细胞的端粒酶检测对结肠癌有良好的诊断价值.
0 引言
结肠癌常见，早期诊治是改善预后的关键. 近年发现端粒酶活性检测对结肠良、恶性病变具有良好的诊断和鉴别诊断价值[1-3]，但国内尚未见肠脱落细胞端粒酶检测的研究报告. 我们检测16例结肠癌标本及其肠腔灌洗物的端粒酶活性，旨在探讨结肠脱落细胞端粒酶检测对结肠癌的诊断价值.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 1997-09/1998-04收取结肠癌外科手术新鲜标本16例，在切开肠腔取癌组织标本之前先用生理盐水稍微清洗以清除大便残余物，再用生理盐水500mL灌洗肠腔，取1mL灌洗液作细胞学检查，其余液体置3000r/min离心15min，立即置沉渣于液氮中保存待检(并与6例同期的IBS患者的结肠镜抽取液进行对照). 尔后切开标本肠腔，取结肠癌组织以及切除远端的正常肠粘膜组织各一块，约100mg，立即置于液氮中保存，以上标本均通过病理检查确定.
1.2 方法 采用Kim端粒重复序列扩增法(TRAP)进行端粒酶活性的检测. ①端粒酶蛋白的抽提：取100mg的冰冻组织迅速在无钙、无镁的冷PBS缓冲液中冲洗2次，尔后在冷PBS缓冲液中匀浆，离心，沉淀物再用冷洗液离心沉淀1次后，加入冷裂解缓冲液冰浴30min，再予高速离心(15000g)，4℃，30min，所获上清即为端粒酶蛋白抽提液，置于-80℃保存待检. ②抽提液的蛋白浓度测定：使用DC蛋白分析盒(BID-RAD)进行蛋白浓度检测，并分别稀释至6.00，0.60和0.06g/L三个梯度. ③端粒酶活性检测：使用TRAP-ezeTM端粒酶测定盒(Oncor，美国)采用TRAP方法进行检测，12.5μL的反应体系中含有0.5μL的提取液，加入TS引物和TRAP引物混合物(BP引物，K1引物和TSK1，模板)，先于30℃下温浴30min后马上转至94℃，进行PCR扩增(35个循环). PCR产物经125g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，使用银染方法显色，如显示间隔6个碱基对阶梯状阳性条带时表明端粒酶阳性.
, 百拇医药
端粒酶检测采用半定量方法，提取液只在6g/L 时才端粒酶阳性者定为弱阳性(+)；而稀释至0.6g/L端粒酶仍为阳性者定为中度阳性(++)；稀释至0.06g/L时端粒酶仍显阳性者定为强阳性(+++)；以上浓度均检测不到端粒酶活性者称为阴性(-).
统计学处理 样本率比较采用卡方检验，如P<0.05，表明有显著性差异. 结肠灌洗液的诊断价值分析采用敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值等指标表示.
2 结果
2.1 结肠癌标本的诊断价值 结肠癌组织16例端粒酶强阳性、弱阳性和阴性分别为10，3和3例，阳性率为81.3%；而结肠癌切除标本的远端正常肠粘膜组织的端粒酶强阳性、弱阳性和阴性分别为0，2和14例，阳性率为12.5%，两组阳性率比较有极显著性差异(P<0.01，表1).
表1 结肠癌组织端粒酶活性
, 百拇医药
(n) 标本
n
端粒酶活性
阳性率(%)
强阳性
弱阳性
阴性
结肠癌
16
10
3
3
81.3b
, 百拇医药
正常大肠粘膜
16
0
2
14
12.5
bP<0.01，vs 正常大肠粘膜.
2.2 结肠灌洗液的诊断价值 结肠癌灌洗液16例中，有5例端粒酶阳性，而6例IBS结肠镜抽取液全部为端粒酶阴性，结肠灌洗液端粒酶检测的敏感性和特异性分别为31.3%和100%；阳性预测值和阴性预测值分别为100%和64.7%，表明结肠灌洗液端粒酶检测对结肠癌有良好的诊断价值(表2).
表2 结肠癌灌洗液端粒酶的活性 端粒酶
, 百拇医药
结 肠 癌
合计
阳性
阴性
阳性
5(a)
0(b)
5(a+b)
阴性
11(c)
6(d)
17(c+d)
合计
, http://www.100md.com
16(a+c)
6(b+d)
22(n)
敏感性：a/(a+c)=31.3%；阳性预测值：a/(a+b)=100%
特异性：d/(d+b)=100%；阴性预测值：c/(c+d)=64.7%
3 讨论
端粒是存在于人类和真核生物细胞染色体末端的蛋白质DNA结构，通过给染色体提供一保护性“帽”，具有维持染色体末端稳定核防止复制时染色体缩短的功能. 而端粒酶作为核糖核酸蛋白酶，起着RNA模板和逆转录酶的作用，把5＇ -TTAGGG-3＇转移至染色体端粒引物的3＇末端，使端粒延长而克服细胞衰老. 近年提出的“端粒-端粒酶假说”认为细胞端粒酶活性上调与细胞永生和癌变密切相关. 现大量研究已确立正常躯体细胞无端粒酶活性，大多人类原发肿瘤均可探及端粒酶阳性，而相应良性病变则呈端粒酶阴性或少数呈弱阳性，并可作为部分肿瘤的早期诊断和预后判断指标，从而端粒酶检测具有较大的临床应用价值，其中各种分泌液(如胰液、胆汁、脑脊液和乳汁)，排泄物(如尿液)，病理性液体(如渗出液、腹水等)和冲洗或刷洗物(如口腔和胃肠道等)的端粒酶检测为恶性肿瘤的早期诊断提供了便利[1，2].
, 百拇医药
国内外研究发现结直肠癌组织的端粒酶阳性率波于53.1%～95.6%，均显著高于周围正常组织和肠道良性病变(肠息肉、炎症性肠病等)，并与肿瘤的分期和组织分型无关，故认为结肠粘膜端粒酶检测对结肠良、恶性病变具有良好的鉴别诊断价值和早期诊断价值[3-5]. 本组16例结肠癌组织的端粒酶阳性率为81.3%，介于以上报道之间，至于端粒酶阳性率结果各家报道差别较大的原因，主要与检测方法的差异、试剂来源未标准化密切相关.
结肠镜的临床普及使结肠疾患的诊治取得了较大进展，但结肠癌的早期诊断仍未得到解决，发现可靠的、非侵入性的检测手段为主要研究方向，因此结肠灌洗物的端粒酶检测为结肠癌的早期诊断提供了方向. 本研究通过检测16例结肠癌患者结肠灌洗物和6例IBS患者的结肠镜抽取液的端粒酶活性，结果发现结肠癌患者端粒酶阳性率为5/16(31.3%)，而6例结肠镜抽取液全部为端粒酶阴性，结肠灌洗液端粒酶检测的敏感性和特异性分别为31.3%和100%；阳性预测值和阴性预测值分别为100%和64.7%，表明结肠灌洗液端粒酶检测对结肠癌有良好的诊断价值，与Yoshida et al[3]的报道极为相似(15例结肠癌患者的结肠灌洗液端粒酶检测的敏感性、特异性和阳性预测值分别为60%，100%和100%，在炎症性肠病患者则均为阴性)，表明一旦结肠灌洗液的端粒酶出现阳性，则往往提示恶性病变，为结肠癌的早期诊断和高危患者的筛选提供了具有重大价值的指标. 至于联合检测粪检基因(如K-ras)或CD44[3]等指标能否提高结肠脱落细胞端粒酶检测的敏感性尚待进一步深入研究.
, 百拇医药
4 参考文献
1 贾林，李瑜元. 端粒-端粒酶的临床研究进展. 广州医药，1997；28(6)：7-8
2 Shay JW, Gazdar AF. Telomerase in the early detection of cancer. J Clin Pathol, 1997;50(2):106-109
3 Yoshida K, Sugino T, Goodison S, Warren BF, Nolan D, Wadsworth S et al. Detection of telomerase activity in exoliated cancer cells in colonic luminal washings and its related clinical implications. Br J Cancer, 1997;75(4):548-553
, 百拇医药
4 Chadeneau C, Hay K, Hirte HW, Gallinger S, Bacchettis. Telomerase activity associated with acquisition of malignancy in human colorectal cancer. Cancer Res, 1995;55(2):2533-2536
5 万德森，刘宗石，吴珊，潘志忠，周志伟，张桥 et al. 大肠癌端粒酶测定及其临床生物学意义研究的初步报告. 癌症，1998；17(1)：35-37
贾林，男，1964-11-05生，河南省方城县人，汉族. 1992年中山医科大学硕士，主治医师，中山医科大学消化内科博士研究生，主要从事肝硬变门脉高压、 肝性脑病和消化系肿瘤研究，已发表论文23篇.
*广州市卫生局科研基金资助，No.96020.
, 百拇医药
通讯作者 贾林，510180，广东省广州市第一人民医院消化科.
*Supported by the fund of scientific research of Guangzhou Minispal Bureall of Health
Correspondence to:JIA Lin, Department of Digestive Diseases, Guangzhou First Municipal Hospital, Guangzhou 510180, Guangdong Province, China
收稿日期 1998-06-29, http://www.100md.com
单位：广东省广州市第一人民医院消化科 510180
关键词：结肠肿瘤/诊断；端粒酶/分析；结肠灌洗物；脱落细胞
华人消化杂志981110 Telomerase activity of exfoliated cancer cells in colonic luminal washings*
JIA Lin and LI Yu-Yuan
Department of Digestive Diseases, Guangzhou First Municipal Hospital, Guangzhou 510180, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Subject headings colonic neoplasms/diagnosis; telomerase/analysis; colonic luminal washings; exfoliated cancer cells
Abstract
AIM To detect the value of telomerase activity in exfoliated cancer cells in colonic luminal washings.
METHODS Telomerase activity in 16 cases of colorectal tumor, their corresponding normal tissues, exfoliated cancer cells in colonic luminal washings in 16 cases of colorectal tumor and 6 cases of irritable bowel syndrome (IBS) were detected by polymerase chain-based telomeric repeat amplification protocol (TRAP) respectively.
, http://www.100md.com
RESULTS Telomerase activity was strongly positive in 10, weak positive in 3 and negative in 3 cases of tumor tissues, while there was weak positive in 2 and negative in 14 cases in 16 matched normal colonic tissue specimens. The positive rates of telomerase activity in colorectal tumor tissues and normal colonic tissue specimens were 81.3% and 12.5% respectively (P<0.01). Telomerase activity was detected in washings from 5 (31.3%) of the 16 colon carcinoma cases but not in any cases with IBS. The sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of detection of telomerase activity in luminal exfoliated cancer cells were 31.3%, 100%, 100% and 64.7% respectively.
, 百拇医药
CONCLUSION Telomerase activity in exfoliated cancer cells in colonic luminal washings is a good marker for the detection of colon carcinoma.
中国图书资料分类号 R735.35
摘 要
目的 端粒酶作为核糖核酸蛋白酶能使端粒延长而克服细胞衰老，与细胞永生和癌变密切相关，正常的躯体细胞无端粒酶活性，大多人类原发肿瘤均可探及端粒酶阳性. 本研究旨在探讨结肠脱落细胞端粒酶检测对结肠癌的临床诊断价值.
方法 采用端粒重复序列扩增法(TRAP)检测16例结肠癌外科手术新鲜标本、相邻的正常组织及其肠腔灌洗物，6例IBS患者的结肠镜抽取物的端粒酶活性.
, 百拇医药
结果 结肠癌组织16例，端粒酶强阳性10例，弱阳性3例和阴性3例，阳性率为81.3%；结肠癌远端正常肠粘膜组织的端粒酶强阳性、弱阳性和阴性分别为0，2和14例，阳性率为12.5%，两组P<0.01. 结肠癌结肠灌洗液16例中有5例端粒酶阳性，而6例IBS结肠镜抽取液全部为端粒酶阴性，其诊断的敏感性和特异性分别为31.3%和100%，阳性预测值和阴性预测值分别为100%和64.7%.
结论 结肠灌洗脱落细胞的端粒酶检测对结肠癌有良好的诊断价值.
0 引言
结肠癌常见，早期诊治是改善预后的关键. 近年发现端粒酶活性检测对结肠良、恶性病变具有良好的诊断和鉴别诊断价值[1-3]，但国内尚未见肠脱落细胞端粒酶检测的研究报告. 我们检测16例结肠癌标本及其肠腔灌洗物的端粒酶活性，旨在探讨结肠脱落细胞端粒酶检测对结肠癌的诊断价值.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 1997-09/1998-04收取结肠癌外科手术新鲜标本16例，在切开肠腔取癌组织标本之前先用生理盐水稍微清洗以清除大便残余物，再用生理盐水500mL灌洗肠腔，取1mL灌洗液作细胞学检查，其余液体置3000r/min离心15min，立即置沉渣于液氮中保存待检(并与6例同期的IBS患者的结肠镜抽取液进行对照). 尔后切开标本肠腔，取结肠癌组织以及切除远端的正常肠粘膜组织各一块，约100mg，立即置于液氮中保存，以上标本均通过病理检查确定.
1.2 方法 采用Kim端粒重复序列扩增法(TRAP)进行端粒酶活性的检测. ①端粒酶蛋白的抽提：取100mg的冰冻组织迅速在无钙、无镁的冷PBS缓冲液中冲洗2次，尔后在冷PBS缓冲液中匀浆，离心，沉淀物再用冷洗液离心沉淀1次后，加入冷裂解缓冲液冰浴30min，再予高速离心(15000g)，4℃，30min，所获上清即为端粒酶蛋白抽提液，置于-80℃保存待检. ②抽提液的蛋白浓度测定：使用DC蛋白分析盒(BID-RAD)进行蛋白浓度检测，并分别稀释至6.00，0.60和0.06g/L三个梯度. ③端粒酶活性检测：使用TRAP-ezeTM端粒酶测定盒(Oncor，美国)采用TRAP方法进行检测，12.5μL的反应体系中含有0.5μL的提取液，加入TS引物和TRAP引物混合物(BP引物，K1引物和TSK1，模板)，先于30℃下温浴30min后马上转至94℃，进行PCR扩增(35个循环). PCR产物经125g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，使用银染方法显色，如显示间隔6个碱基对阶梯状阳性条带时表明端粒酶阳性.
, 百拇医药
端粒酶检测采用半定量方法，提取液只在6g/L 时才端粒酶阳性者定为弱阳性(+)；而稀释至0.6g/L端粒酶仍为阳性者定为中度阳性(++)；稀释至0.06g/L时端粒酶仍显阳性者定为强阳性(+++)；以上浓度均检测不到端粒酶活性者称为阴性(-).
统计学处理 样本率比较采用卡方检验，如P<0.05，表明有显著性差异. 结肠灌洗液的诊断价值分析采用敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值等指标表示.
2 结果
2.1 结肠癌标本的诊断价值 结肠癌组织16例端粒酶强阳性、弱阳性和阴性分别为10，3和3例，阳性率为81.3%；而结肠癌切除标本的远端正常肠粘膜组织的端粒酶强阳性、弱阳性和阴性分别为0，2和14例，阳性率为12.5%，两组阳性率比较有极显著性差异(P<0.01，表1).
表1 结肠癌组织端粒酶活性
, 百拇医药
(n) 标本
n
端粒酶活性
阳性率(%)
强阳性
弱阳性
阴性
结肠癌
16
10
3
3
81.3b
, 百拇医药
正常大肠粘膜
16
0
2
14
12.5
bP<0.01，vs 正常大肠粘膜.
2.2 结肠灌洗液的诊断价值 结肠癌灌洗液16例中，有5例端粒酶阳性，而6例IBS结肠镜抽取液全部为端粒酶阴性，结肠灌洗液端粒酶检测的敏感性和特异性分别为31.3%和100%；阳性预测值和阴性预测值分别为100%和64.7%，表明结肠灌洗液端粒酶检测对结肠癌有良好的诊断价值(表2).
表2 结肠癌灌洗液端粒酶的活性 端粒酶
, 百拇医药
结 肠 癌
合计
阳性
阴性
阳性
5(a)
0(b)
5(a+b)
阴性
11(c)
6(d)
17(c+d)
合计
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16(a+c)
6(b+d)
22(n)
敏感性：a/(a+c)=31.3%；阳性预测值：a/(a+b)=100%
特异性：d/(d+b)=100%；阴性预测值：c/(c+d)=64.7%
3 讨论
端粒是存在于人类和真核生物细胞染色体末端的蛋白质DNA结构，通过给染色体提供一保护性“帽”，具有维持染色体末端稳定核防止复制时染色体缩短的功能. 而端粒酶作为核糖核酸蛋白酶，起着RNA模板和逆转录酶的作用，把5＇ -TTAGGG-3＇转移至染色体端粒引物的3＇末端，使端粒延长而克服细胞衰老. 近年提出的“端粒-端粒酶假说”认为细胞端粒酶活性上调与细胞永生和癌变密切相关. 现大量研究已确立正常躯体细胞无端粒酶活性，大多人类原发肿瘤均可探及端粒酶阳性，而相应良性病变则呈端粒酶阴性或少数呈弱阳性，并可作为部分肿瘤的早期诊断和预后判断指标，从而端粒酶检测具有较大的临床应用价值，其中各种分泌液(如胰液、胆汁、脑脊液和乳汁)，排泄物(如尿液)，病理性液体(如渗出液、腹水等)和冲洗或刷洗物(如口腔和胃肠道等)的端粒酶检测为恶性肿瘤的早期诊断提供了便利[1，2].
, 百拇医药
国内外研究发现结直肠癌组织的端粒酶阳性率波于53.1%～95.6%，均显著高于周围正常组织和肠道良性病变(肠息肉、炎症性肠病等)，并与肿瘤的分期和组织分型无关，故认为结肠粘膜端粒酶检测对结肠良、恶性病变具有良好的鉴别诊断价值和早期诊断价值[3-5]. 本组16例结肠癌组织的端粒酶阳性率为81.3%，介于以上报道之间，至于端粒酶阳性率结果各家报道差别较大的原因，主要与检测方法的差异、试剂来源未标准化密切相关.
结肠镜的临床普及使结肠疾患的诊治取得了较大进展，但结肠癌的早期诊断仍未得到解决，发现可靠的、非侵入性的检测手段为主要研究方向，因此结肠灌洗物的端粒酶检测为结肠癌的早期诊断提供了方向. 本研究通过检测16例结肠癌患者结肠灌洗物和6例IBS患者的结肠镜抽取液的端粒酶活性，结果发现结肠癌患者端粒酶阳性率为5/16(31.3%)，而6例结肠镜抽取液全部为端粒酶阴性，结肠灌洗液端粒酶检测的敏感性和特异性分别为31.3%和100%；阳性预测值和阴性预测值分别为100%和64.7%，表明结肠灌洗液端粒酶检测对结肠癌有良好的诊断价值，与Yoshida et al[3]的报道极为相似(15例结肠癌患者的结肠灌洗液端粒酶检测的敏感性、特异性和阳性预测值分别为60%，100%和100%，在炎症性肠病患者则均为阴性)，表明一旦结肠灌洗液的端粒酶出现阳性，则往往提示恶性病变，为结肠癌的早期诊断和高危患者的筛选提供了具有重大价值的指标. 至于联合检测粪检基因(如K-ras)或CD44[3]等指标能否提高结肠脱落细胞端粒酶检测的敏感性尚待进一步深入研究.
, 百拇医药
4 参考文献
1 贾林，李瑜元. 端粒-端粒酶的临床研究进展. 广州医药，1997；28(6)：7-8
2 Shay JW, Gazdar AF. Telomerase in the early detection of cancer. J Clin Pathol, 1997;50(2):106-109
3 Yoshida K, Sugino T, Goodison S, Warren BF, Nolan D, Wadsworth S et al. Detection of telomerase activity in exoliated cancer cells in colonic luminal washings and its related clinical implications. Br J Cancer, 1997;75(4):548-553
, 百拇医药
4 Chadeneau C, Hay K, Hirte HW, Gallinger S, Bacchettis. Telomerase activity associated with acquisition of malignancy in human colorectal cancer. Cancer Res, 1995;55(2):2533-2536
5 万德森，刘宗石，吴珊，潘志忠，周志伟，张桥 et al. 大肠癌端粒酶测定及其临床生物学意义研究的初步报告. 癌症，1998；17(1)：35-37
贾林，男，1964-11-05生，河南省方城县人，汉族. 1992年中山医科大学硕士，主治医师，中山医科大学消化内科博士研究生，主要从事肝硬变门脉高压、 肝性脑病和消化系肿瘤研究，已发表论文23篇.
*广州市卫生局科研基金资助，No.96020.
, 百拇医药
通讯作者 贾林，510180，广东省广州市第一人民医院消化科.
*Supported by the fund of scientific research of Guangzhou Minispal Bureall of Health
Correspondence to:JIA Lin, Department of Digestive Diseases, Guangzhou First Municipal Hospital, Guangzhou 510180, Guangdong Province, China
收稿日期 1998-06-29, http://www.100md.com