胃肿瘤_诊断_端粒酶_分析_肿瘤细胞，培养的

改进TRAP-PCR检测端粒酶活性对早期胃癌的诊断*

http://www.100md.com 《世界华人消化杂志》 1998年第11期

     作者：李正生¹ 朱正纲¹ 尹浩然¹ 陈诗书² 林言箴¹

    单位：上海第二医科大学 ¹附属瑞金医院普外科 ²人类基因治疗研究中心上海市 200025

    关键词：胃肿瘤/诊断；端粒酶/分析；肿瘤细胞，培养的；聚合酶链反应；实体瘤/诊断

    华人消化杂志981105 Modified TRAP-PCR in detection of telomerase activity in early diagnosis of stomach tumors^*

    LI Zheng-Sheng¹, ZHU Zheng-Gang¹, YIN Hao-Ran¹, CHEN Shi-Shu² and LIN Yan-Zhen¹
, 百拇医药
    ¹Department of Surgery, Ruijin Hospital, ²Research Center for Human Gene Therapy, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China

    Subject headings stomach neoplasms/diagnosis; telomerase/analysis; tumor cells, cultured; polymerase chain reaction; solid tumors/diagnosis

    Abstract

    AIM To study modified TRAP-PCR in detection of telomerase activity in early diagnosis of stomach tumors.
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    METHODS By the modified method of TRAP-PCR, telomerase activity was assessed in cultures of tumor cell lines as well as in tripsized gastric cancer tissue.

    RESULTS The overall rate of telomerase expression was 93% (25/27) in tumor tissues,and no expression was observed in samples of normal mucosa (0/20). Telomerase expression was present in all MKN28, MKN45, HHCL, SGC7901 and Tca8113 tumor cell lines. Telomerase activity was detectable when the number of tumor cells exceeded 200.
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    CONCLUSION High telomerase expression is specific in all solid tumors so that its detection might bear great importance in the early diagnosis of various malignancies.

    中国图书资料分类号 R735.2

    摘要

    目的探索端粒酶活性早期诊断恶性实体瘤的新方法.

    方法通过胃癌组织的分离和肿瘤细胞系的培养，用改良TRAP-PCR方法，来检测其端粒酶的活性.

    结果胃癌组织及肿瘤细胞系的端粒酶总表达率93%(25/27)，其中细胞系MKN28，MKN45，HHCL，SGC7901及Tca8113均为阳性表达；胃癌远隔的正常粘膜标本表达率为0%(0/20)；其中有200个肿瘤细胞存在便可测得其端粒酶的活性.
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    结论胃癌组织及肿瘤细胞系的端粒酶表达，具有很强的肿瘤特异性和较高的表达率；改进TRAP-PCR方法具有提高恶性实体瘤早期诊断的潜在价值.

    0 引言

    端粒酶是特异地合成染色体DNA两端的端粒的蛋白质—RNA复合体逆转录酶. 1994年，Kim et al^[1]创用了TRAP(telomeric repeat amplification protocal)—PCR方法，对多种类人的肿瘤细胞的端粒酶活性进行了检测，发现90%以上肿瘤细胞具有端粒酶活性，因此认为其对肿瘤的发生发展机制，早期诊断和治疗恶性实体瘤具有重要意义. 虽然国外有大量关于恶性肿瘤端粒酶活性检测的报道^[2]，但胃癌端粒酶活性检测报道不多，国内还未见报道. 还有一些细胞系如MKN28，MKN45，HHCL，SGC7901及Tca8113，其端粒酶活性国内外还无检测的报道. 另外，由于该方法使用同位素标记放射自显影，有放射性污染的弊端，而如用溴乙锭(EB)染色，则欠灵敏. 因此我们在TRAP-PCR的基础上，采用硝酸银染色并改进其他一些实验参数，以期提供恶性肿瘤临床早期诊断及追踪恶性肿瘤的有效方法，以及为下一步将端粒酶作为恶性肿瘤治疗的分子靶进行肿瘤基因治疗打下基础.
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    1 材料和方法

    1.1 材料 ①TRAP-PCR检测试剂：TRAP-eze^TM端粒酶检测试剂盒(Oncor公司)：包括1xCHAPS lysis buffer, 10xTRAP reaction buffer, 50xdNTP Mix, TS primer, primer Mix, PCR-grade water, TSR, control cell pellet. ②Taq酶(上海Promega公司). ③Ca²⁺，Mg²⁺-free PBS. ④DEPC(Sigma公司). ⑤PAGE电泳试剂(Amresco公司)：acrylamide, bis-acrylamide, TEMED, 过硫酸胺. ⑥银染试剂(购自上海华美公司)：包括乙醇，硝酸，硝酸银，碳酸钠，乙酸. ⑦细胞培养试剂：包括培养基RPMI-1640(Gibco公司)，DMEM(Gibco公司)，小牛血清(杭州四季清生物制品研究所)，青霉素和链霉素(Sigma公司)，谷氨酰胺(Gibco公司)，丙酮酸钠(Gibco公司). ⑧标本：胃癌手术标本20例及相应的远离癌灶的正常胃粘膜标本，取自上海第二医科大学瑞金医院普外科胃癌组. 新鲜手术切除的胃癌标本取下后，立即在无菌条件下取材送回实验室，分离组织细胞或于-70℃条件下保存. 细胞系：MKN28，MKN45，HHCL，Tca8113，293及HeLa细胞，为上海第二医科大学人类基因治疗研究中心提供，SGC7901(由上海消化外科研究所提供). ⑨主要仪器：包括PCR仪(PE公司，480型)，电泳仪(BIO-RAD公司)，匀浆器(瑞士)等.
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    1.2 方法

    1.2.1 实体组织分离及培养细胞收集将组织块用PBS冲洗干净后，于玻璃培养皿内用小剪刀将组织块剪成1mm³大小，移入10mL的小烧杯内，用匀浆器将组织块打碎，然后移入1.5mL Eppendorf管内，5000r/min，4℃条件下离心5min；弃上清，细胞沉淀以备裂解. 贴壁细胞培养至2×10⁵～1×10⁶，弃培养液，PBS洗2遍，再加约2mL PBS，0.2g/L胰酶消化，显微镜下观察贴壁细胞变圆后，弃消化液，加入PBS后将细胞打匀，吸入1.5mL Eppendorf管内，5000r/min，4℃条件下离心5min，弃上清，细胞沉淀以备裂解.

    1.2.2 改良TRAP-PCR方法综合TRAP-eze^TM试剂盒法及Kim创建的TRAP-PCR法，加以改良. ①细胞抽提物制备：收集10⁴～10⁶个细胞于1.5mL Eppendorf管中，4000r/min，离心5min，弃上清；加1XCHAPS(端粒酶抽提buffer)200μL，混匀，冰浴30min；4℃条件下12000r/min，离心30min；然后吸取上清做PCR反应或-70℃条件下保存. ②TRAP-PCR反应反应体系：TRAP-PCR buffer 5μL，TS引物(序列为AATCCGTCGAGCAGAGTT)1μL，引物Mix(包括CX引物；其中的内引物K1，是以TSK1为模板，扩增36bp的片段，作内参照)1μL，50XdNTP 1μL，Taq酶0.4μL，ddH₂O 39.6μL，细胞抽提物2μL，总体积50μL. 端粒酶介导的端粒加长反应：条件为30℃，15min，然后加50μL石蜡油，进行PCR反应，条件为：94℃，30s，50℃ 30s，72℃ 45s，35个循环；72℃ 10min，4℃. 最后加5μL上样液进行PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳. ③PAGE电泳，条件为：预电泳100V，30min；然后上样15μL～20μL，正式电泳100V，约2.5h，同时观察溴酚蓝刚刚跑出微型电泳板的下端时停止电泳. ④染色(硝酸银染色法)：100mL/L乙醇固定10min；10mL/L硝酸浸泡10min；0.012mol/L硝酸银(含1g/L甲醛)染色30min；0.28mol/L Na₂CO₃(含0.5g/L甲醛)显色，自然光下观察条带显现为止；100mL/L乙酸终止反应. 以上各步骤结束后均经蒸馏水漂洗数秒. 最后投影灯下拍照. ⑤端粒酶阳性结果：为扩增片断相差6bp的数个TTAGGG的DNA梯度(DNA ladder)片断，其中包括36bp的内参照片段(该条带的模板是TSK1，相应引物为K1，用以检测PCR扩增体系的稳定性，及判断扩增片段的大小). 阴性结果：为仅显示内参照片段.
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    2 结果

    2.1 胃癌组织在20例中有18例有端粒酶表达阳性，阳性率90%(图1). BormannⅠ型1例(0/1)，Ⅱ型5例(5/5)，Ⅲ型12例(11/12)，Ⅳ型2例(2/2)，各型间的表达率无显著性差异(P<0.05). 3个胃癌标本的端粒酶表达为阳性，其对应的正常粘膜为阴性(图2).

    2.2 细胞系细胞系MKN28，MKN45，HHCL，SGC7901，HeLa, Tca8113，293端粒酶表达均为阳性(图3). 最少约200个HeLa细胞，端粒酶活性可被测出(图4).

    图1 8个胃癌标本的端粒酶阳性表达扩增条带.

    图2 1，2，3分别为4，5，6癌灶的远端正常粘膜.

    图3 1，2，3，4，5，6，7，N分别为MKN28，MKN45，HHCL，SGC7901，Tca8113，HeLa及293细胞系及阴性对照的端粒酶扩增条带.
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    图4 1，2，3，4，5，6分别为50，100，200，1000，5000，10000及100000个HeLa细胞的端粒酶表达扩增条带.

    3 讨论

    端粒酶活性与恶性肿瘤细胞的发生及生长、增殖有密切关系，因此肿瘤细胞端粒酶活性检测具有重要意义^[3，4]. 自从1989年Morin首次在人类肿瘤细胞系HeLa细胞中发现有端粒酶活性以来，国外陆续有大量关于人类肿瘤细胞中存在端粒酶活性的报道，其表达率绝大部分在85%左右，有的甚至高达98%^[1，5，6]. 然而，除外生殖细胞(精子和卵子细胞)和极少数的干细胞(骨髓造血干细胞)及外周血中的淋巴细胞(端粒酶活性较低)，其他正常人体细胞均未发现有端粒酶活性，而且良性瘤细胞中的端粒酶表达率也极低. Hiyama et al^[7]报道了一组胃癌端粒酶表达率在85%，与本组相近(90%). 而本组相应病例的远离癌灶的正常胃粘膜均无端粒酶表达(0/20). 可见端粒酶活性具有很高的肿瘤特异性和表达率. 比较而言，p53表达虽然也有很高的肿瘤特异性，但其表达率相对要低的多(40%～70%). 说明就特异性、灵敏度和表达率而言，肿瘤细胞端粒酶活性检测，比p53检测的临床应用价值可能更大.
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    本组20例胃癌标本中，一方面由于阳性率太高(90%)，另一方面由于样本不够大，因此端粒酶的表达率与临床病理学资料进行统计学分析，均未获显著性差异结果. 虽然大部分的人类肿瘤细胞的端粒酶活性已被国外学者检测^[1]，但仍有一些细胞株如MKN28，MKN45，HHCL，SGC7901及Tca8113等，其端粒酶的表达情况还不太清楚，不利于有些实验的进行. 因此本实验对这些细胞株的端粒酶进行了检测，结果均有端粒酶表达，提示可针对如上细胞系进行端粒酶检测的诊断治疗研究.

    在方法学上，虽然Kim首先应用了TRAP-PCR方法检测端粒酶，大幅度提高了灵敏度，但存在同位素污染的弊端. 如果用溴乙锭(EB)染色，则其灵敏度又嫌不高. 因此本组采用银染方法用于TRAP-PCR的标记染色，既解决了同位素的放射性污染问题，又比EB染色的灵敏度更高；而且，仅200个肿瘤细胞的端粒酶活性即可被测出，显示了高度灵敏性. 另外，硝酸银染色仅在可见光下即可观察，实验结果还可经凝胶干燥后长期保存. 因此，该方法有望成为恶性实体瘤早期诊断、高危患者筛选及微转移癌灶的追踪等的一种新的分子生物学方法.
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    4 参考文献

    1 Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, HO PL et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994;266(23):2011-2015

    2 Counter CM, Gupta J, Harley CB. Telomerase activity in normal leukocytes and in hematologic malignancies. Blood, 1995;85(9):2315-2320

    3 Parkinson EK, Newbold F, Keith WN. The genetic basis of human keratinocyte immortalisation in squoamous cell carcinoma development: the role of telomerase reactivation. Eur J Cancer, 1997;33(5):727-734
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    4 Feng JL, Funk WD, Wang SS. The RNA component of human telomerase. Science, 1995;269(1):1236-1241

    5 Shay JW, Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer, 1997;33(5):787-791

    6 Kim NW. Clinical implication of telomerase in cancer. Eur J Cancer, 1997;33(5):781-786

    7 Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res, 1995;55:3258-3262
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    李正生，男，1962-12-17生，汉族. 1982年河南省许昌卫校医学专业毕业，1998年上海第二医科大学外科学博士，主要从事肿瘤的基因诊断及治疗研究，发表文章6篇.

    ^*国家自然科学基金资助课题，No.39770725.

    通讯作者李正生，200025，上海第二医科大学附属瑞金医院普外科，上海市瑞金二路197号.

    ^*Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39770725.

    Correspondence to:LI Zheng-Sheng, Department of Surgery, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, 197 Ruijin 2nd Road, Shanghai 200025, China

    Tel. +86*21*64373909

    收稿日期 1998-07-07, 百拇医药(李正生1 朱正纲1 尹浩然1 陈诗书2 林言箴1)

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