去势对老龄雄性大鼠骨骼重建及生物力学的影响
作者：陈晖 韩祖斌 林华
单位：南京市鼓楼医院
关键词：雄性大鼠 去势 骨重建 生物力学
江苏医药990108 摘要 观察了老龄雄性大鼠去势后骨骼重建的变化，并对其生物力学性能作了检测。结果老龄雄性大鼠去势4个月后，骨形成功能减退，而骨吸收仍然活跃，其松质骨和皮质骨骨量、生物力学性能均降低，且以松质骨改变更为明显，是男性骨质疏松症较理想的动物模型。
近年来国外统计资料显示，男性骨质疏松骨折发病率较人们想象的高得多，并呈逐年上升趋势[1]。男性骨质疏松研究方面，雄激素与骨质疏松的关系以及替代治疗的有效性也是众多学者关心的问题。雄激素缺乏不但本身是男性骨质疏松症主要病因之一，而且也参与其他危险因素所导致骨质疏松的病理过程，如老龄、皮质激素过量、酗酒等[2，3]。有统计资料认为，临床约5%～33%的骨质疏松性椎体骨折病人存在低性腺功能，而髋部骨折的病人中低性腺功能可能更为普遍[4]。可见雄激素与骨质疏松症有着相当密切的关系。本实验对老龄雄性大鼠行去势手术后观察其骨重建状态、骨骼生物力学变化，以期探讨雄激素缺乏所导致的骨重建缺陷及雄激素减少对骨骼生物力学的影响。
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材料与方法
一、实验动物及检测标本
21只SD大鼠，雄性、14月龄、体重360～440g。随机分为两组，一组11只手术切除双侧睾丸，另一组10只行假手术。同等条件下饲养，4个月后腹主动脉放血致死，分离出血浆，留取双侧股骨、胫骨和第三腰椎(L3)。所有标本置低温冰箱保存。
二、检测项目
1.血浆睾酮测定(放免法)。
2.骨量测定：
(1)皮质骨骨量：SPA法左股骨中点骨密度(BMD)
(2)松质骨骨量：QCT法测L3骨矿含量(BMC)
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3.骨骼形态学观察：
(1)光镜观察：取左胫骨干骺端，纵向切开，人工制成30μm骨磨片，1%甲苯胺蓝染色。另取右股骨中点截面制成30μm骨磨片，半自动图像分析系统测量并计算出各种骨组织形态学参数。
(2)透射电镜观察：取右胫骨干骺端3×3mm组织块制成超薄切片。
4.骨骼生物力学测定：
采用股骨三点弯曲试验和椎体纵向压缩试验[5，6]。
三、统计学处理
各参数值均以
±s表示，并采用t检验分析。
, http://www.100md.com
结 果
一、血浆睾酮浓度改变
去势组血浆睾酮浓度均低于0.7nmol/L。假手术组睾酮平均浓度为3.07±1.59nmol/L。说明双侧睾丸切除能有效降低血浆睾酮浓度，造成雄激素缺乏。
二、股骨与椎体骨量变化见表1。
表1股骨椎体骨量测定
假手术组
(n＝10)
去势组
(n＝11)
股骨BMD(g/cm2)
, http://www.100md.com
0.406±0.010
0.389±0.008*
L3BMC(mg/cm3)
82.3±11.5
51.9±8.7*
*P<0.001，VS假手术组
三、骨骼形态学改变
1.去势对胫骨干骺端骨组织形态学的影响见表2。
表2骨组织形态计量学各参考数值测定
假手术组
, 百拇医药
(n＝10)
去势组
(n＝11)
骨小梁面积百分数(%)
14.2±4.4
8.2±1.7***
骨小梁厚度(μm)
75.2±10.8
57.9±9.5**
骨小梁数目(＃/mm)
2.3±0.5
, 百拇医药
1.7±0.3**
骨吸收周长百分数(%)
1.5±0.5
2.3±0.6*
类骨质周长百分数(%)
5.7±1.2
6.5±0.9
类骨质厚度(μm)
8.8±1.1
8.3±0.9
*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001， VS假手术组
, 百拇医药
2.去势对皮质骨结构的影响见表3。
表3股骨中点横截面结构测量
假手术组
(n＝10)
去势组
(n＝11)
皮质厚度(μm)
777±99.3
755±62.3
皮质面积(mm2)
28.8±5.7
28.2±5.8
, http://www.100md.com
骨外膜面积(mm2)
61.0±5.9
62.2±3.8
皮质骨比率(%)
47.2±10.1
45.3±9.5
无统计学差异，VS假手术组
3.透射电镜观察。
去势组破骨细胞体积较大，亮区明显，胞浆内线粒体及溶酶体均非常丰富，内质网扩张，线粒体呈圆形，大小均匀，嵴呈轮辐状排列。亮区可见液泡及由细长微绒毛构成的皱褶缘，其它部位膜表面微绒毛亦清晰可见。假手术组破骨细胞线粒体减少，空泡化，且大小不一，膜略萎陷，微绒毛不明显。去势组成骨细胞胞浆内线粒体减少，空泡化，内质网、高尔基体不发达，而假手术组胞浆内线粒体丰富，内质网扩张明显。
, 百拇医药
四、去势对大鼠骨胳生物力学的影响见表4、5。
表4股骨生物力学参数测定
假手术组
(n＝10)
去势组
(n＝10)
惯性矩(mm4)
12.06±2.45
12.32±1.88
抗弯截面模数(mm3)
6.33±1.00
, http://www.100md.com
6.39±0.77
最大负荷(N)
169.6±51.7
133.6±20.6
最大桡度(mm)
1.12±0.18
1.22±0.40
弯曲刚性系数(Nmm2)
3.65±1.97
2.34±0.61
弯曲韧性系数(mm/N)
, 百拇医药
2.53±1.45
2.47±1.02
强度极限(MPa)
135.1±36.3
102.1±18.5*
弹性模量(GPa)
3.24±1.36
1.91±0.47*
?P<0.05，VS假手术组表5生物力学参数测定
假手术组
(n＝9)
, 百拇医药
去势组
(n＝8)
椎体截面积(mm2)
16.0±2.1
15.3±2.1
最大负荷(N)
327.3±89.9
187.5±54.8**
压缩率(%)
4.4±1.6
2.3±1.0**
, http://www.100md.com
比例极限(MPa)
18.7±6.5
11.8±3.0*
强度极限(MPa)
20.4±8.2
13.2±3.2*
弹性模量(GPa)
0.65±0.12
0.88±0.24
*P<0.05 **P<0.01，VS假手术组讨 论
, http://www.100md.com
一、老龄雄性大鼠去势后骨量变化
本研究中SPA法和QCT法均发现去势组骨量降低。其中股骨中点骨密度值较对照组减少4.2%，L3骨矿含量减少25%，P值均小于0.001，有极明显差异。此结果与Vanderchuren等用DEXA法所测得的皮质骨、松质骨骨量变化相近[7]。可见，老龄大鼠去势4个月后，伴随血浆睾酮水平的下降，皮质骨和松质骨均有丢失，并以后者更明显。本文中另一反映松质骨骨量的参数-骨小梁面积百分数(%TbAr)去势后降低42%，远远大于QCT法所测得的骨量变化，提示对松质骨骨量的检测，骨组织形态计量学方法优于非侵入性骨量测定方法。
二、老龄雄性大鼠去势后骨重建改变
80年代初Riggs提出原发性骨质疏松症的分型，并认为男性骨质疏松症以低转换型为主。然而近年来许多学者发现，雄性大鼠去势后，短期内往往表现为高转换型骨丢失[8～11]。Vanderchuren等[9]观察到，雄性大鼠去势后1个月，类骨质表面及成骨细胞表面显著增加，4个月后此变化消失。Tukaren[11]等在给3月龄雄性大鼠行睾丸切除术后，第8周已观察到成骨细胞表面及破骨细胞表面明显减少。本实验中雄性老龄大鼠去势后4个月，骨吸收周长百分数(%RS)仍高于对照组，类骨质骨长百分数(%FS)两组间无差异。电镜下可见去势组破骨细胞仍然活跃，成骨细胞功能低于对照组。此结果提示老龄雄性大鼠去势4个月后，骨转换率开始下降但仍高于正常，骨转换率下降过程中骨形成功能减退先于骨吸收功能减退。此结果与前面所提及的研究一样，均观察到雄性大鼠去势后早期存在的骨骼高转换期，但所观察到的高转换率持续时间相对较长。近期有部分研究认为雄激素也可直接通过其受体影响骨髓基质细胞内IL-6基因转录，该发现是否为雄性大鼠去势后出现高转换率的病理生理机制仍有待进一步研究。雄激素有刺激成骨细胞增殖及胶原合成的作用[12]，较持久的雄激素缺乏可能是去势组骨形成减少的主要原因。由于各研究中鼠种、月龄、实验方法等因素的不统一，所以对雄性大鼠去势后骨骼高转换率持续时间仍难有定论，但正是由于去势后这种骨代谢变化导致了明显的骨丢失。
, 百拇医药
三、老龄雄性大鼠去势后骨骼生物力学变化
有学者认为，雄性大鼠去势后皮质骨内膜面骨吸收增加，而外膜面骨形成减少，导致皮质骨变薄，骨强度降低[7，13]。然而本文结果不支持上述观点。本文检测了大鼠股骨截面皮质骨厚度、皮质骨比率及股骨强度(Pb)、刚度(f)等参数，去势组虽有降低，但和对照组无统计学差异；而股骨材料强度、刚度去势组明显低于对照组(σb和E分别减少24%和41%)。骨骼强度主要取决于其材料属性及几何构造。上述结果提示老龄雄性大鼠去势后，伴随皮质骨骨量的减少，其材料属性发生改变，而骨膜面骨重建变化对几何强度的影响并不明显。本文中大鼠去势后，其股骨材料强度变化比骨量变化更明显(24%vs4.2%)，提示去势后皮质骨骨量变化的基础上，可能也存在其他影响骨质的因素，如皮质骨显微结构[14，15]、骨组织成分等。椎体纵向压缩试验主要反映松质骨力学性质变化。本实验检测发现，去势组椎体强度(Pb)、强度极限(σb)、压缩率(Ψ)明显降低，其强度极限降低比股骨更明显(37%vs24%)，此表现与骨量变化一致。所以我们认为，富含松质骨的骨骼更适于选作模型中力学检测标本。
, 百拇医药
总之，本文中雄性大鼠去势后骨转换的改变是骨量丢失、骨骼生物力学下降的根本原因，通过雄性大鼠去势手术，可建成男性骨质疏松症较理想的动物模型。
邮政编码：210008
参考文献
[1] Schneider EL， et al. JAMA 1990；263：2335.
[2] Lukert BP， et al. Ann Intern Med 1990；112：352.
[3] Diamond T， et al. Am J Med 1989；86：282.
[4] Seeman E， et al. Am J Med 1995；98(2A)：76.
, http://www.100md.com
[5] 王以进，等.骨科生物力学.北京：人民军医出版社，1985；21～86.
[6] 过邦辅.临床骨科生物力学基础.上海：远东出版社，1986；1～70.
[7] Vanderchuren D， et al. Calcif Tissue Int 1993；53(5)：342.
[8] Vanderchuren D， et al. J Bone Miner Res 1994；26：123.
[9] Vanderchuren D， et al. Endocrinology 1992；130：2906.
[10] Gunness M， et al. Bone 1995；16：126.
, 百拇医药 [11] Tukaren J， et al. Calcif Tissue Int 1994；55：33.
[12] Orwoll ES， et al. Calcif Tissue Int 1991；49：182.
[13] Turner RT， et al. J Bone Miner Res 1989；4：557.
[14] Wink CS， et al. Calcif Tissue Int 1980；32：77.
[15] Wink CS， et al. Calcif Tissue Int 1982；34：54.
(1997年11月13日收稿 1998年5月27日修回), 百拇医药
单位：南京市鼓楼医院
关键词：雄性大鼠 去势 骨重建 生物力学
江苏医药990108 摘要 观察了老龄雄性大鼠去势后骨骼重建的变化，并对其生物力学性能作了检测。结果老龄雄性大鼠去势4个月后，骨形成功能减退，而骨吸收仍然活跃，其松质骨和皮质骨骨量、生物力学性能均降低，且以松质骨改变更为明显，是男性骨质疏松症较理想的动物模型。
近年来国外统计资料显示，男性骨质疏松骨折发病率较人们想象的高得多，并呈逐年上升趋势[1]。男性骨质疏松研究方面，雄激素与骨质疏松的关系以及替代治疗的有效性也是众多学者关心的问题。雄激素缺乏不但本身是男性骨质疏松症主要病因之一，而且也参与其他危险因素所导致骨质疏松的病理过程，如老龄、皮质激素过量、酗酒等[2，3]。有统计资料认为，临床约5%～33%的骨质疏松性椎体骨折病人存在低性腺功能，而髋部骨折的病人中低性腺功能可能更为普遍[4]。可见雄激素与骨质疏松症有着相当密切的关系。本实验对老龄雄性大鼠行去势手术后观察其骨重建状态、骨骼生物力学变化，以期探讨雄激素缺乏所导致的骨重建缺陷及雄激素减少对骨骼生物力学的影响。
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材料与方法
一、实验动物及检测标本
21只SD大鼠，雄性、14月龄、体重360～440g。随机分为两组，一组11只手术切除双侧睾丸，另一组10只行假手术。同等条件下饲养，4个月后腹主动脉放血致死，分离出血浆，留取双侧股骨、胫骨和第三腰椎(L3)。所有标本置低温冰箱保存。
二、检测项目
1.血浆睾酮测定(放免法)。
2.骨量测定：
(1)皮质骨骨量：SPA法左股骨中点骨密度(BMD)
(2)松质骨骨量：QCT法测L3骨矿含量(BMC)
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3.骨骼形态学观察：
(1)光镜观察：取左胫骨干骺端，纵向切开，人工制成30μm骨磨片，1%甲苯胺蓝染色。另取右股骨中点截面制成30μm骨磨片，半自动图像分析系统测量并计算出各种骨组织形态学参数。
(2)透射电镜观察：取右胫骨干骺端3×3mm组织块制成超薄切片。
4.骨骼生物力学测定：
采用股骨三点弯曲试验和椎体纵向压缩试验[5，6]。
三、统计学处理
各参数值均以
±s表示，并采用t检验分析。, http://www.100md.com
结 果
一、血浆睾酮浓度改变
去势组血浆睾酮浓度均低于0.7nmol/L。假手术组睾酮平均浓度为3.07±1.59nmol/L。说明双侧睾丸切除能有效降低血浆睾酮浓度，造成雄激素缺乏。
二、股骨与椎体骨量变化见表1。
表1股骨椎体骨量测定
假手术组
(n＝10)
去势组
(n＝11)
股骨BMD(g/cm2)
, http://www.100md.com
0.406±0.010
0.389±0.008*
L3BMC(mg/cm3)
82.3±11.5
51.9±8.7*
*P<0.001，VS假手术组
三、骨骼形态学改变
1.去势对胫骨干骺端骨组织形态学的影响见表2。
表2骨组织形态计量学各参考数值测定
假手术组
, 百拇医药
(n＝10)
去势组
(n＝11)
骨小梁面积百分数(%)
14.2±4.4
8.2±1.7***
骨小梁厚度(μm)
75.2±10.8
57.9±9.5**
骨小梁数目(＃/mm)
2.3±0.5
, 百拇医药
1.7±0.3**
骨吸收周长百分数(%)
1.5±0.5
2.3±0.6*
类骨质周长百分数(%)
5.7±1.2
6.5±0.9
类骨质厚度(μm)
8.8±1.1
8.3±0.9
*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001， VS假手术组
, 百拇医药
2.去势对皮质骨结构的影响见表3。
表3股骨中点横截面结构测量
假手术组
(n＝10)
去势组
(n＝11)
皮质厚度(μm)
777±99.3
755±62.3
皮质面积(mm2)
28.8±5.7
28.2±5.8
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骨外膜面积(mm2)
61.0±5.9
62.2±3.8
皮质骨比率(%)
47.2±10.1
45.3±9.5
无统计学差异，VS假手术组
3.透射电镜观察。
去势组破骨细胞体积较大，亮区明显，胞浆内线粒体及溶酶体均非常丰富，内质网扩张，线粒体呈圆形，大小均匀，嵴呈轮辐状排列。亮区可见液泡及由细长微绒毛构成的皱褶缘，其它部位膜表面微绒毛亦清晰可见。假手术组破骨细胞线粒体减少，空泡化，且大小不一，膜略萎陷，微绒毛不明显。去势组成骨细胞胞浆内线粒体减少，空泡化，内质网、高尔基体不发达，而假手术组胞浆内线粒体丰富，内质网扩张明显。
, 百拇医药
四、去势对大鼠骨胳生物力学的影响见表4、5。
表4股骨生物力学参数测定
假手术组
(n＝10)
去势组
(n＝10)
惯性矩(mm4)
12.06±2.45
12.32±1.88
抗弯截面模数(mm3)
6.33±1.00
, http://www.100md.com
6.39±0.77
最大负荷(N)
169.6±51.7
133.6±20.6
最大桡度(mm)
1.12±0.18
1.22±0.40
弯曲刚性系数(Nmm2)
3.65±1.97
2.34±0.61
弯曲韧性系数(mm/N)
, 百拇医药
2.53±1.45
2.47±1.02
强度极限(MPa)
135.1±36.3
102.1±18.5*
弹性模量(GPa)
3.24±1.36
1.91±0.47*
?P<0.05，VS假手术组表5生物力学参数测定
假手术组
(n＝9)
, 百拇医药
去势组
(n＝8)
椎体截面积(mm2)
16.0±2.1
15.3±2.1
最大负荷(N)
327.3±89.9
187.5±54.8**
压缩率(%)
4.4±1.6
2.3±1.0**
, http://www.100md.com
比例极限(MPa)
18.7±6.5
11.8±3.0*
强度极限(MPa)
20.4±8.2
13.2±3.2*
弹性模量(GPa)
0.65±0.12
0.88±0.24
*P<0.05 **P<0.01，VS假手术组讨 论
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一、老龄雄性大鼠去势后骨量变化
本研究中SPA法和QCT法均发现去势组骨量降低。其中股骨中点骨密度值较对照组减少4.2%，L3骨矿含量减少25%，P值均小于0.001，有极明显差异。此结果与Vanderchuren等用DEXA法所测得的皮质骨、松质骨骨量变化相近[7]。可见，老龄大鼠去势4个月后，伴随血浆睾酮水平的下降，皮质骨和松质骨均有丢失，并以后者更明显。本文中另一反映松质骨骨量的参数-骨小梁面积百分数(%TbAr)去势后降低42%，远远大于QCT法所测得的骨量变化，提示对松质骨骨量的检测，骨组织形态计量学方法优于非侵入性骨量测定方法。
二、老龄雄性大鼠去势后骨重建改变
80年代初Riggs提出原发性骨质疏松症的分型，并认为男性骨质疏松症以低转换型为主。然而近年来许多学者发现，雄性大鼠去势后，短期内往往表现为高转换型骨丢失[8～11]。Vanderchuren等[9]观察到，雄性大鼠去势后1个月，类骨质表面及成骨细胞表面显著增加，4个月后此变化消失。Tukaren[11]等在给3月龄雄性大鼠行睾丸切除术后，第8周已观察到成骨细胞表面及破骨细胞表面明显减少。本实验中雄性老龄大鼠去势后4个月，骨吸收周长百分数(%RS)仍高于对照组，类骨质骨长百分数(%FS)两组间无差异。电镜下可见去势组破骨细胞仍然活跃，成骨细胞功能低于对照组。此结果提示老龄雄性大鼠去势4个月后，骨转换率开始下降但仍高于正常，骨转换率下降过程中骨形成功能减退先于骨吸收功能减退。此结果与前面所提及的研究一样，均观察到雄性大鼠去势后早期存在的骨骼高转换期，但所观察到的高转换率持续时间相对较长。近期有部分研究认为雄激素也可直接通过其受体影响骨髓基质细胞内IL-6基因转录，该发现是否为雄性大鼠去势后出现高转换率的病理生理机制仍有待进一步研究。雄激素有刺激成骨细胞增殖及胶原合成的作用[12]，较持久的雄激素缺乏可能是去势组骨形成减少的主要原因。由于各研究中鼠种、月龄、实验方法等因素的不统一，所以对雄性大鼠去势后骨骼高转换率持续时间仍难有定论，但正是由于去势后这种骨代谢变化导致了明显的骨丢失。
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三、老龄雄性大鼠去势后骨骼生物力学变化
有学者认为，雄性大鼠去势后皮质骨内膜面骨吸收增加，而外膜面骨形成减少，导致皮质骨变薄，骨强度降低[7，13]。然而本文结果不支持上述观点。本文检测了大鼠股骨截面皮质骨厚度、皮质骨比率及股骨强度(Pb)、刚度(f)等参数，去势组虽有降低，但和对照组无统计学差异；而股骨材料强度、刚度去势组明显低于对照组(σb和E分别减少24%和41%)。骨骼强度主要取决于其材料属性及几何构造。上述结果提示老龄雄性大鼠去势后，伴随皮质骨骨量的减少，其材料属性发生改变，而骨膜面骨重建变化对几何强度的影响并不明显。本文中大鼠去势后，其股骨材料强度变化比骨量变化更明显(24%vs4.2%)，提示去势后皮质骨骨量变化的基础上，可能也存在其他影响骨质的因素，如皮质骨显微结构[14，15]、骨组织成分等。椎体纵向压缩试验主要反映松质骨力学性质变化。本实验检测发现，去势组椎体强度(Pb)、强度极限(σb)、压缩率(Ψ)明显降低，其强度极限降低比股骨更明显(37%vs24%)，此表现与骨量变化一致。所以我们认为，富含松质骨的骨骼更适于选作模型中力学检测标本。
, 百拇医药
总之，本文中雄性大鼠去势后骨转换的改变是骨量丢失、骨骼生物力学下降的根本原因，通过雄性大鼠去势手术，可建成男性骨质疏松症较理想的动物模型。
邮政编码：210008
参考文献
[1] Schneider EL， et al. JAMA 1990；263：2335.
[2] Lukert BP， et al. Ann Intern Med 1990；112：352.
[3] Diamond T， et al. Am J Med 1989；86：282.
[4] Seeman E， et al. Am J Med 1995；98(2A)：76.
, http://www.100md.com
[5] 王以进，等.骨科生物力学.北京：人民军医出版社，1985；21～86.
[6] 过邦辅.临床骨科生物力学基础.上海：远东出版社，1986；1～70.
[7] Vanderchuren D， et al. Calcif Tissue Int 1993；53(5)：342.
[8] Vanderchuren D， et al. J Bone Miner Res 1994；26：123.
[9] Vanderchuren D， et al. Endocrinology 1992；130：2906.
[10] Gunness M， et al. Bone 1995；16：126.
, 百拇医药 [11] Tukaren J， et al. Calcif Tissue Int 1994；55：33.
[12] Orwoll ES， et al. Calcif Tissue Int 1991；49：182.
[13] Turner RT， et al. J Bone Miner Res 1989；4：557.
[14] Wink CS， et al. Calcif Tissue Int 1980；32：77.
[15] Wink CS， et al. Calcif Tissue Int 1982；34：54.
(1997年11月13日收稿 1998年5月27日修回), 百拇医药