高效液相法测定缺血时小鼠脑组织中ATP、ADP和AMP含量的变化
作者：马丽焱 肖培根 张曙明 张 琪 王春兰 陈建民
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所，北京 100094
关键词：高效液相法；磷酸腺苷；脑缺血
中国老年学杂志/990124 摘 要 本实验采用高效液相法、乙腈磷酸缓冲液作为流动相、紫外检测(254nm)、在ODS柱上成功地分离并测定了小鼠脑组织中APT、ADP和AMP的含量。方法简便、灵敏，重复性好。比较正常以及缺血条件下脑组织中高能磷酸化合物含量的变化，结果发现60 s内随着缺血时间延长，ATP减少，AMP增加，ADP呈双相变化。
缺血性卒中时首先出现的是组织缺血引起的能量代谢障碍，因而提高局部血流量，改善能量代谢无疑将有助于减少操作，促进局部组织功能恢复。观测小鼠全脑缺血后喘息持续时间的变化，是筛选抗脑缺血性损伤药物的经典方法之一。但是该法比较粗糙，缺乏准确性。液相色谱法是目前应用范围最广、最常用的一种分析方法。本文采用高效液相色谱法测定断头引起的完全性脑缺血不同时间内小鼠脑组织中ATP、ADP和AMP含量的变化，旨在为筛选抗脑缺血性损伤药物提供一种快速、精确、简便的检测方法。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 HPLC 600泵、486多波长紫外检测器、MillenniumTM2010软件系统：Waters公司。分离柱5 μ Hypersil ODS 250mm×40 mm id，中国科学院大连化学物理研究所。
1.2 色谱条件〔1〕 参照文献并加以改进。流动相A：150 mmol/L KH2PO4+150 mmol/L KCl，用2 mol/L KOH调pH至6.0；流动相B：85%A相+15%乙腈。实验当天流动相经孔径为0.45 μm的微孔滤膜过滤。洗脱梯度：0 min，0%B，0.1 min，3% B，5 min，9%B，11 min,3%B,16 min，0%B，再平衡5 min。流速0.9 ml/min。流动相以15 ml/min的流速充入氦气持续脱气。柱温为室温(14～18 ℃)检测波长254 nm；检测灵敏度1 AUFS。进样量5～25 μl。ATP、ADP和AMP的理论塔板数分别为5 213、9 493和20 177。
, 百拇医药
1.3 样品制备 小鼠断头后在液氮温度下取前脑，加入0.1 mol/L HCl-99%甲醇溶液0.5 ml，0.3 mol/L HClO4溶液2.5 ml冰浴匀浆，匀浆液于4 ℃，8 000 r/min离心10 min，沉淀物作蛋白含量测定；将上清液移至另一Eppendorff管中，加入1.5 mol/L KOH、0.3 mol/L HCl和0.4 mol/L咪唑混合液中和，再以8 000 r/min重复离心10 min，取上清液置于-20 ℃待测定。
1.4 蛋白含量测定 考马斯亮兰法〔2〕，以牛血清白蛋白为标准。
2 结 果
2.1 标准曲线 分别称取ATP、ADP和AMP标准品，用蒸馏水配成10×10-3mol/L的母液，1∶100稀释后取5，10，15，20，25 μl进样，并根据进样量和测得的峰面积求取回归方程及相关系数。
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结果表明ATP、ADP和AMP进样量与峰面积呈良好的线性关系，所得直线方程分别为ATP：y=1.085×106x，r=0.999 7；ADP：y=7.227×105x+5.753×104，r=0.999 7；AMP：y=7.571×105x+5.940×104，r=0.999 3。三种标准腺苷酸分离较完全，分辨率>1.5。
2.2 回收试验和重复性试验〔3，4〕 组织中加入一定量的标准品，经过沉淀蛋白、中和酸性等步骤，测定腺苷酸类物含量，与取自同一组织同批处理的样品比较，计算标准品的回收率。结果见表1。
表1 脑组织中ATP和AMP含量(nmol/L)回收率测定结果(n=6)
已知量
, 百拇医药 加入量
实测值
回收率(%)
ATP
1.090
1.768
2.638
87.56
AMP
2.900
1.334
4.159
94.45
, 百拇医药
ATP
1.815
0.548
2.258
80.84
AMP
1.403
0.356
1.719
88.69
取同一动物的脑组织均分三等分，经相同的样品处理和分析过程，每一样品测二次，计算六次测定所得ATP、ADP和AMP含量的变异系数(RDS)。结果见表2。表2 缺血30 s时脑组织中ATP、ADP和AMP(μmol/g.Pr)
±s
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变异系数(%)
ATP
14.08±0.52
3.678
ADP
24.45±0.61
2.509
AMP
16.59±0.32
1.924
2.3 小鼠全脑缺血不同时间脑组织ATP、ADP和AMP含量的变化 小鼠于断头后0、15、30、60 s时迅速将头放入液氮中，动态观察全脑缺血不同时间脑组织腺苷酸含量的变化，结果发现随着缺血时间的延长，组织中ATP含量逐渐减少，ADP呈现先增高后减少的双相变化，AMP含量逐渐增高。随着时间延长而改变加剧(图1，表3)。
, 百拇医药
图1 高效液相法测定小鼠完全性脑缺血不同时间
内脑组织中ATP、ADP和AMP含量的变化
表3 完全性脑缺血对小鼠脑组织能量代谢的影响(±s，n=6) 含量
(μmol/g Pr)
0
15 s
30 s
60 s
ATP
3.76±0.47
, 百拇医药
1.96±0.21
1.43±0.29
0.68±0.08
ADP
2.38±0.39
2.94±0.12
2.64±0.37
1.54±0.14
AMP
0.81±0.16
1.93±0.08
2.47±0.10
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3.72±0.13
3 讨 论
脑是代谢最活跃的器官，而自身能量和氧储备最少。静息状态下脑组织耗氧量占全身总氧耗的20%，神经元是构成大脑皮层或整个脑的氧耗量的主要部分。脑对缺血、缺氧损伤极为敏感，在无新鲜氧源时，组织只能消耗其高能磷酸化合物储备，并借助于将所贮存的葡萄糖和糖原代谢为乳酸，从而获得能量。高能磷酸化合物(～P)的利用可由公式：△～P=2△ATP+△PCr+△ADP+2△葡萄糖+2.9△糖原计算。在10 min时释放了总量为18 μmol/g的～P单位，这期间1 min用了14，2 min用了16，换而言之，局部缺血2 min后，基本上没有可用的能量了〔5〕。能量耗竭可引起能量泵功能衰竭、神经元内钙超负荷、毒性氧自由基增加、细胞酸中毒等一系列链锁反应，最终导致神经细胞不可逆损害。本实验也显示随着全脑缺血时间的延长，小鼠脑组织中ATP含量迅速降低，60 s时减少了81.8%。
, 百拇医药
采用HPLC测定缺血后脑组织中ATP、ADP和AMP含量的变化，具备简便、快速、灵敏度高，重复性好等优点，并且可使所需测定的三种组分同时获得较满意的分离效果，具有一定的应用价值。
作者简介：马丽焱，女，34岁，博士，副研究员，从事心脑血管药理学研究
参考文献
1 Smolenski RT，Yacoub NH.Liquid chromatgraphic evaluation of purine production in the donor human heart during transplantation.Biomedi Chromat，1993；7：189
2 Bradford MM.A Rapid and sensitive method for thd quantiation of microgram quantities of protein utilzing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem，1976；72：248
3 朱剑琴，李春宝，王新昌.脑内游离氨基酸的微量测定.生物化学与生物物理进展，1981；(4)：61
4 朱志荣，乔雪琴.液化气中元素硫的高效液相色谱法分析.色谱，1997；15：81
5 B.K.齐兹耶.脑的能量代谢.北京：科学出版社，1983：569
〔1998-01-16收稿 1998-09-17修回〕, http://www.100md.com
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所，北京 100094
关键词：高效液相法；磷酸腺苷；脑缺血
中国老年学杂志/990124 摘 要 本实验采用高效液相法、乙腈磷酸缓冲液作为流动相、紫外检测(254nm)、在ODS柱上成功地分离并测定了小鼠脑组织中APT、ADP和AMP的含量。方法简便、灵敏，重复性好。比较正常以及缺血条件下脑组织中高能磷酸化合物含量的变化，结果发现60 s内随着缺血时间延长，ATP减少，AMP增加，ADP呈双相变化。
缺血性卒中时首先出现的是组织缺血引起的能量代谢障碍，因而提高局部血流量，改善能量代谢无疑将有助于减少操作，促进局部组织功能恢复。观测小鼠全脑缺血后喘息持续时间的变化，是筛选抗脑缺血性损伤药物的经典方法之一。但是该法比较粗糙，缺乏准确性。液相色谱法是目前应用范围最广、最常用的一种分析方法。本文采用高效液相色谱法测定断头引起的完全性脑缺血不同时间内小鼠脑组织中ATP、ADP和AMP含量的变化，旨在为筛选抗脑缺血性损伤药物提供一种快速、精确、简便的检测方法。
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1 材料与方法
1.1 材料 HPLC 600泵、486多波长紫外检测器、MillenniumTM2010软件系统：Waters公司。分离柱5 μ Hypersil ODS 250mm×40 mm id，中国科学院大连化学物理研究所。
1.2 色谱条件〔1〕 参照文献并加以改进。流动相A：150 mmol/L KH2PO4+150 mmol/L KCl，用2 mol/L KOH调pH至6.0；流动相B：85%A相+15%乙腈。实验当天流动相经孔径为0.45 μm的微孔滤膜过滤。洗脱梯度：0 min，0%B，0.1 min，3% B，5 min，9%B，11 min,3%B,16 min，0%B，再平衡5 min。流速0.9 ml/min。流动相以15 ml/min的流速充入氦气持续脱气。柱温为室温(14～18 ℃)检测波长254 nm；检测灵敏度1 AUFS。进样量5～25 μl。ATP、ADP和AMP的理论塔板数分别为5 213、9 493和20 177。
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1.3 样品制备 小鼠断头后在液氮温度下取前脑，加入0.1 mol/L HCl-99%甲醇溶液0.5 ml，0.3 mol/L HClO4溶液2.5 ml冰浴匀浆，匀浆液于4 ℃，8 000 r/min离心10 min，沉淀物作蛋白含量测定；将上清液移至另一Eppendorff管中，加入1.5 mol/L KOH、0.3 mol/L HCl和0.4 mol/L咪唑混合液中和，再以8 000 r/min重复离心10 min，取上清液置于-20 ℃待测定。
1.4 蛋白含量测定 考马斯亮兰法〔2〕，以牛血清白蛋白为标准。
2 结 果
2.1 标准曲线 分别称取ATP、ADP和AMP标准品，用蒸馏水配成10×10-3mol/L的母液，1∶100稀释后取5，10，15，20，25 μl进样，并根据进样量和测得的峰面积求取回归方程及相关系数。
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结果表明ATP、ADP和AMP进样量与峰面积呈良好的线性关系，所得直线方程分别为ATP：y=1.085×106x，r=0.999 7；ADP：y=7.227×105x+5.753×104，r=0.999 7；AMP：y=7.571×105x+5.940×104，r=0.999 3。三种标准腺苷酸分离较完全，分辨率>1.5。
2.2 回收试验和重复性试验〔3，4〕 组织中加入一定量的标准品，经过沉淀蛋白、中和酸性等步骤，测定腺苷酸类物含量，与取自同一组织同批处理的样品比较，计算标准品的回收率。结果见表1。
表1 脑组织中ATP和AMP含量(nmol/L)回收率测定结果(n=6)
已知量
, 百拇医药 加入量
实测值
回收率(%)
ATP
1.090
1.768
2.638
87.56
AMP
2.900
1.334
4.159
94.45
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ATP
1.815
0.548
2.258
80.84
AMP
1.403
0.356
1.719
88.69
取同一动物的脑组织均分三等分，经相同的样品处理和分析过程，每一样品测二次，计算六次测定所得ATP、ADP和AMP含量的变异系数(RDS)。结果见表2。表2 缺血30 s时脑组织中ATP、ADP和AMP(μmol/g.Pr)
±s, http://www.100md.com
变异系数(%)
ATP
14.08±0.52
3.678
ADP
24.45±0.61
2.509
AMP
16.59±0.32
1.924
2.3 小鼠全脑缺血不同时间脑组织ATP、ADP和AMP含量的变化 小鼠于断头后0、15、30、60 s时迅速将头放入液氮中，动态观察全脑缺血不同时间脑组织腺苷酸含量的变化，结果发现随着缺血时间的延长，组织中ATP含量逐渐减少，ADP呈现先增高后减少的双相变化，AMP含量逐渐增高。随着时间延长而改变加剧(图1，表3)。
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图1 高效液相法测定小鼠完全性脑缺血不同时间
内脑组织中ATP、ADP和AMP含量的变化
表3 完全性脑缺血对小鼠脑组织能量代谢的影响(
±s，n=6) 含量(μmol/g Pr)
0
15 s
30 s
60 s
ATP
3.76±0.47
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1.96±0.21
1.43±0.29
0.68±0.08
ADP
2.38±0.39
2.94±0.12
2.64±0.37
1.54±0.14
AMP
0.81±0.16
1.93±0.08
2.47±0.10
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3.72±0.13
3 讨 论
脑是代谢最活跃的器官，而自身能量和氧储备最少。静息状态下脑组织耗氧量占全身总氧耗的20%，神经元是构成大脑皮层或整个脑的氧耗量的主要部分。脑对缺血、缺氧损伤极为敏感，在无新鲜氧源时，组织只能消耗其高能磷酸化合物储备，并借助于将所贮存的葡萄糖和糖原代谢为乳酸，从而获得能量。高能磷酸化合物(～P)的利用可由公式：△～P=2△ATP+△PCr+△ADP+2△葡萄糖+2.9△糖原计算。在10 min时释放了总量为18 μmol/g的～P单位，这期间1 min用了14，2 min用了16，换而言之，局部缺血2 min后，基本上没有可用的能量了〔5〕。能量耗竭可引起能量泵功能衰竭、神经元内钙超负荷、毒性氧自由基增加、细胞酸中毒等一系列链锁反应，最终导致神经细胞不可逆损害。本实验也显示随着全脑缺血时间的延长，小鼠脑组织中ATP含量迅速降低，60 s时减少了81.8%。
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采用HPLC测定缺血后脑组织中ATP、ADP和AMP含量的变化，具备简便、快速、灵敏度高，重复性好等优点，并且可使所需测定的三种组分同时获得较满意的分离效果，具有一定的应用价值。
作者简介：马丽焱，女，34岁，博士，副研究员，从事心脑血管药理学研究
参考文献
1 Smolenski RT，Yacoub NH.Liquid chromatgraphic evaluation of purine production in the donor human heart during transplantation.Biomedi Chromat，1993；7：189
2 Bradford MM.A Rapid and sensitive method for thd quantiation of microgram quantities of protein utilzing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem，1976；72：248
3 朱剑琴，李春宝，王新昌.脑内游离氨基酸的微量测定.生物化学与生物物理进展，1981；(4)：61
4 朱志荣，乔雪琴.液化气中元素硫的高效液相色谱法分析.色谱，1997；15：81
5 B.K.齐兹耶.脑的能量代谢.北京：科学出版社，1983：569
〔1998-01-16收稿 1998-09-17修回〕, http://www.100md.com