孕妇外周血中胎儿有核红细胞的富集及鉴定
作者：邬晋芳 王琳* 马旭* 叶国玲
单位：西安医科大学第二临床医学院遗传室(710004)
关键词：红细胞；离心法，梯密度；糖蛋白类；聚合酶链反应
实用医学杂志990105 摘 要 目的：建立富集分离孕妇外周血胎儿有核红细胞的方法，并证实其为胎儿来源。方法：以血型糖蛋白A(GPA)为识别标志，对5例孕12～40周的孕妇外周血进行密度梯度离心富集胎儿有核红细胞，并经流式细胞分析及PCR技术扩增Y特异性序列以鉴定富集效果。结果：5例孕妇外周血富集后流式细胞分析结果，GPA+细胞含量平均为上层2.38%，下层18.18%，富集后下层GPA+细胞含量是上层的7.6倍；PCR扩增结果，2例阳性，3例阴性，所得结果与实际性别吻合。结论：胎儿有核红细胞的富集及鉴定为无损伤性产前诊断的临床应用开辟了诱人前景。
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孕妇外周血中胎儿细胞的种类有滋养层细胞、有核红细胞、淋巴细胞及粒细胞，可见通过胎盘屏障进入母体循环的胎儿细胞是一个混合群体[1]，针对性的将最适宜于进行产前诊断的靶细胞从母体细胞中区别开来是实施无损伤性产前诊断的前提。目前国内外学者的研究集中在胎儿有核红细胞上，并一致认为胎儿有核红细胞是最佳的靶细胞[1，2]。我们采用红系特异性细胞表面抗原血型糖蛋白A(glycophorin A,GPA)作为识别标记，通过密度梯度离心法富集孕妇外周血胎儿有核红细胞，并经流式细胞分析和PCR技术鉴定其为胎儿来源。
1 资料与方法
1.1 研究对象 以5例12～40周孕妇为研究对象，每例抽取静脉血10 ml(EDTA抗凝)；另外各选一名正常男性及一名未婚且无生育史的正常女性作为阳性及阴性对照。
1.2 密度梯度离心富集胎儿有核红细胞 所用细胞分离介质histopaque1077、histopaque1107为国家计生委科技研究所遗传室配制，具体步骤为：PBS等体积稀释孕妇外周血备用。在10 ml塑料透明锥形管中依次缓缓铺加histopaque1077、histopaque1107各2 ml，使两层液体之间保持清晰界面，后将稀释血液沿管壁轻轻铺在分层液表面，使稀释血与分层液体积为3∶2，室温下水平离心机离心，1 500 r/min，30分钟，见细胞悬浮于各分层液面呈白膜状；用吸管分别吸取上、下两层界面细胞，离心，1 500 r/min，10分钟，PBS悬浮细胞后各取100 μl供上流式细胞分析仪分析细胞类型。
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1.3 有核红细胞的标记和鉴定
1.3.1 上述细胞悬液中加藻红蛋白(R-phycoerythrin,RPE)标记的鼠抗人GPA单克隆抗体(DAKO公司产品)(1∶500)作为阳性对照；同时，另取100 μl细胞悬液加PE-Isotopic抗体(1∶500)作为阴性对照，采用美国Coulter公司生产的Elite型流式细胞仪分别对富集后上、下层界面细胞进行分析鉴定，以明确GPA+细胞含量。
1.3.2 取下层细胞悬液制备DNA标本，按照国家计生委科研所遗传室提供的方法进行Y染色体特异序列的套式PCR扩增。
2 结果
5例孕妇外周血富集后流式细胞分析结果：GPA+细胞含量平均为上层2.38%，下层18.18%，可见经过密度梯度离心富集下层的GPA+细胞含量是上层的7.6倍；套式PCR扩增Y染色体特异序列结果：5例孕妇外周血GPA+细胞的PCR检测，2例扩增出特异性片段，另3例未扩增出，所得结果与胎儿实际性别吻合。见表1、图1。
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表1 GPA+细胞含量及PCR扩增结果 编号
孕周
上层GPA+细胞含量(%)
下层GPA+细胞含量(%)
PCR结果
实际性别
1
16
4.4
16.2
-
女
, 百拇医药
2
39
2.5
35.9
+
男
3
12
0.3
3.5
+
男
4
40
, 百拇医药
3.1
28.1
-
女
5
19
1.6
7.2
-
女
平均
2.38
18.18
, http://www.100md.com
A：分子量标识 B：正常阳性对照 C：正常阴性对照
D：3号标本富集前PCR检测阴性 E：3号标本富集后PCR检测阳性(254 bp片段)
图1 孕妇血富集前后GPA+细胞PCR检测结果
3 讨论
孕妇外周血中存在的胎儿细胞种类多、数量少，富集分离哪一种胎儿细胞是目前产前诊断研究的热点。由于胎儿有核红细胞在胎儿血液循环中比例较高[3]，在成人体内罕见，据报道11周的胚胎有核红细胞占全部红细胞的10%[4]，故推测进入母体循环的数量也较多。另外，有核红细胞表面抗原相对稳定，易于识别[5]，因此成为产前诊断研究的主要对象。
血型糖蛋白A是一种红系特异性细胞表面抗原，在淋巴细胞上不表达，而仅在红系细胞表面表达[6]，单独使用GPA单克隆抗体可用于分离纯化胎儿细胞且诊断准确率达100%[7，8]，本研究采用GPA单克隆抗体对胎儿有核红细胞进行识别标记。密度梯度离心法是依据胎儿细胞与母体细胞在体积、密度、沉降系数、渗透压等方面的不同而设计的一种方法。由于该方法基本上消除了成熟红细胞，因此经流式细胞分析所得到的GPA+细胞大部分应为有核红细胞。流式细胞分析结果表明：富集后下层GPA+细胞含量是上层的7.6倍，说明通过此种方法可初步达到富集分离孕妇外周血中胎儿细胞的目的，这与文献报道一致[9]。对富集后下层GPA+细胞进行PCR检测，2号、3号均扩增出Y特异性片段，且与实际性别吻合，表明：密度梯度离心法能从母血中富集得到胎儿有核红细胞，所富集的量，可以满足PCR扩增单拷贝基因所需的模板量，这与近期文献报道相符[9，10]。由此可见，孕妇外周血中胎儿有核红细胞的分离及鉴定为无损伤性产前诊断的临床应用开辟了诱人的前景。
, 百拇医药
* 国家计划生育委员会科学技术研究所遗传室
4 参考文献
1 Bianchi DW. Clinical trials and experience:Boston. Ann N Y Acad Sci,1994,731:92.
2 马 旭，崔应琦，王 毅，等. 胎儿幼稚红细胞产前遗传学诊断的研究. 中华妇产科杂志，1995，31：271.
3 Forestier F,Daffos F,Catherine N,et al. Development hematopoiesis in normal human fetal blood. Blood,1991,77(11):2360.
4 Simpson JL,Elias S. Isolating fetal cells in the maternal circulation. Hum Reprod Update,1995,1(4):409.
, 百拇医药
5 Alter BP. Biology of erythropoiesis. Ann N Y Acad Sci,1994,731:36.
6 Elias S,Simpson JL. Prenatal diagnosis of aneuploidy using fetal cells isolated from maternal blood. Ann N Y Acad Sci,1994,731:80.
7 Simpson JL,Elias S. Isolating fetal cells from maternal blood. Advances in prenatal diagnosis through molecular technology. JAMA,1993,270:2357.
8 Bianchi DW,Zickwolf GK,Yih MC,et al. Erythroid-specific antibodies enhance detection of fetal nucleated erythrocytes in maternal blood. Prenat Diagn,1993,13:293.
9 宋 杰，李守柔，张爱臣，等. 富集孕妇外周血中胎儿细胞行胎儿性别诊断. 中华妇产科杂志，1998，33：74.
10 马 旭，张思仲，罗安雪，等. 孕妇血中胎儿细胞在产前诊断中的初步应用—胎儿SRY基因的鉴定. 中华医学遗传学杂志，1995，12：265., http://www.100md.com(邬晋芳 王琳* 马旭* 叶国玲)
单位：西安医科大学第二临床医学院遗传室(710004)
关键词：红细胞；离心法，梯密度；糖蛋白类；聚合酶链反应
实用医学杂志990105 摘 要 目的：建立富集分离孕妇外周血胎儿有核红细胞的方法，并证实其为胎儿来源。方法：以血型糖蛋白A(GPA)为识别标志，对5例孕12～40周的孕妇外周血进行密度梯度离心富集胎儿有核红细胞，并经流式细胞分析及PCR技术扩增Y特异性序列以鉴定富集效果。结果：5例孕妇外周血富集后流式细胞分析结果，GPA+细胞含量平均为上层2.38%，下层18.18%，富集后下层GPA+细胞含量是上层的7.6倍；PCR扩增结果，2例阳性，3例阴性，所得结果与实际性别吻合。结论：胎儿有核红细胞的富集及鉴定为无损伤性产前诊断的临床应用开辟了诱人前景。
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孕妇外周血中胎儿细胞的种类有滋养层细胞、有核红细胞、淋巴细胞及粒细胞，可见通过胎盘屏障进入母体循环的胎儿细胞是一个混合群体[1]，针对性的将最适宜于进行产前诊断的靶细胞从母体细胞中区别开来是实施无损伤性产前诊断的前提。目前国内外学者的研究集中在胎儿有核红细胞上，并一致认为胎儿有核红细胞是最佳的靶细胞[1，2]。我们采用红系特异性细胞表面抗原血型糖蛋白A(glycophorin A,GPA)作为识别标记，通过密度梯度离心法富集孕妇外周血胎儿有核红细胞，并经流式细胞分析和PCR技术鉴定其为胎儿来源。
1 资料与方法
1.1 研究对象 以5例12～40周孕妇为研究对象，每例抽取静脉血10 ml(EDTA抗凝)；另外各选一名正常男性及一名未婚且无生育史的正常女性作为阳性及阴性对照。
1.2 密度梯度离心富集胎儿有核红细胞 所用细胞分离介质histopaque1077、histopaque1107为国家计生委科技研究所遗传室配制，具体步骤为：PBS等体积稀释孕妇外周血备用。在10 ml塑料透明锥形管中依次缓缓铺加histopaque1077、histopaque1107各2 ml，使两层液体之间保持清晰界面，后将稀释血液沿管壁轻轻铺在分层液表面，使稀释血与分层液体积为3∶2，室温下水平离心机离心，1 500 r/min，30分钟，见细胞悬浮于各分层液面呈白膜状；用吸管分别吸取上、下两层界面细胞，离心，1 500 r/min，10分钟，PBS悬浮细胞后各取100 μl供上流式细胞分析仪分析细胞类型。
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1.3 有核红细胞的标记和鉴定
1.3.1 上述细胞悬液中加藻红蛋白(R-phycoerythrin,RPE)标记的鼠抗人GPA单克隆抗体(DAKO公司产品)(1∶500)作为阳性对照；同时，另取100 μl细胞悬液加PE-Isotopic抗体(1∶500)作为阴性对照，采用美国Coulter公司生产的Elite型流式细胞仪分别对富集后上、下层界面细胞进行分析鉴定，以明确GPA+细胞含量。
1.3.2 取下层细胞悬液制备DNA标本，按照国家计生委科研所遗传室提供的方法进行Y染色体特异序列的套式PCR扩增。
2 结果
5例孕妇外周血富集后流式细胞分析结果：GPA+细胞含量平均为上层2.38%，下层18.18%，可见经过密度梯度离心富集下层的GPA+细胞含量是上层的7.6倍；套式PCR扩增Y染色体特异序列结果：5例孕妇外周血GPA+细胞的PCR检测，2例扩增出特异性片段，另3例未扩增出，所得结果与胎儿实际性别吻合。见表1、图1。
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表1 GPA+细胞含量及PCR扩增结果 编号
孕周
上层GPA+细胞含量(%)
下层GPA+细胞含量(%)
PCR结果
实际性别
1
16
4.4
16.2
-
女
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2
39
2.5
35.9
+
男
3
12
0.3
3.5
+
男
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3.1
28.1
-
女
5
19
1.6
7.2
-
女
平均
2.38
18.18
, http://www.100md.com
A：分子量标识 B：正常阳性对照 C：正常阴性对照
D：3号标本富集前PCR检测阴性 E：3号标本富集后PCR检测阳性(254 bp片段)
图1 孕妇血富集前后GPA+细胞PCR检测结果
3 讨论
孕妇外周血中存在的胎儿细胞种类多、数量少，富集分离哪一种胎儿细胞是目前产前诊断研究的热点。由于胎儿有核红细胞在胎儿血液循环中比例较高[3]，在成人体内罕见，据报道11周的胚胎有核红细胞占全部红细胞的10%[4]，故推测进入母体循环的数量也较多。另外，有核红细胞表面抗原相对稳定，易于识别[5]，因此成为产前诊断研究的主要对象。
血型糖蛋白A是一种红系特异性细胞表面抗原，在淋巴细胞上不表达，而仅在红系细胞表面表达[6]，单独使用GPA单克隆抗体可用于分离纯化胎儿细胞且诊断准确率达100%[7，8]，本研究采用GPA单克隆抗体对胎儿有核红细胞进行识别标记。密度梯度离心法是依据胎儿细胞与母体细胞在体积、密度、沉降系数、渗透压等方面的不同而设计的一种方法。由于该方法基本上消除了成熟红细胞，因此经流式细胞分析所得到的GPA+细胞大部分应为有核红细胞。流式细胞分析结果表明：富集后下层GPA+细胞含量是上层的7.6倍，说明通过此种方法可初步达到富集分离孕妇外周血中胎儿细胞的目的，这与文献报道一致[9]。对富集后下层GPA+细胞进行PCR检测，2号、3号均扩增出Y特异性片段，且与实际性别吻合，表明：密度梯度离心法能从母血中富集得到胎儿有核红细胞，所富集的量，可以满足PCR扩增单拷贝基因所需的模板量，这与近期文献报道相符[9，10]。由此可见，孕妇外周血中胎儿有核红细胞的分离及鉴定为无损伤性产前诊断的临床应用开辟了诱人的前景。
, 百拇医药
* 国家计划生育委员会科学技术研究所遗传室
4 参考文献
1 Bianchi DW. Clinical trials and experience:Boston. Ann N Y Acad Sci,1994,731:92.
2 马 旭，崔应琦，王 毅，等. 胎儿幼稚红细胞产前遗传学诊断的研究. 中华妇产科杂志，1995，31：271.
3 Forestier F,Daffos F,Catherine N,et al. Development hematopoiesis in normal human fetal blood. Blood,1991,77(11):2360.
4 Simpson JL,Elias S. Isolating fetal cells in the maternal circulation. Hum Reprod Update,1995,1(4):409.
, 百拇医药
5 Alter BP. Biology of erythropoiesis. Ann N Y Acad Sci,1994,731:36.
6 Elias S,Simpson JL. Prenatal diagnosis of aneuploidy using fetal cells isolated from maternal blood. Ann N Y Acad Sci,1994,731:80.
7 Simpson JL,Elias S. Isolating fetal cells from maternal blood. Advances in prenatal diagnosis through molecular technology. JAMA,1993,270:2357.
8 Bianchi DW,Zickwolf GK,Yih MC,et al. Erythroid-specific antibodies enhance detection of fetal nucleated erythrocytes in maternal blood. Prenat Diagn,1993,13:293.
9 宋 杰，李守柔，张爱臣，等. 富集孕妇外周血中胎儿细胞行胎儿性别诊断. 中华妇产科杂志，1998，33：74.
10 马 旭，张思仲，罗安雪，等. 孕妇血中胎儿细胞在产前诊断中的初步应用—胎儿SRY基因的鉴定. 中华医学遗传学杂志，1995，12：265., http://www.100md.com(邬晋芳 王琳* 马旭* 叶国玲)