自身胆汁以不同压力和时间灌注犬胰管对血清溶菌酶和补体活性的影响
作者：谢秩勋 吴江琳 谢冰 谢军 陈莉
单位：成都军区总医院分子生物研究室 610083
关键词：急性胰腺炎；胆汁；灌注；溶菌酶；总补体
重庆医学990108
摘要 为探讨血清溶菌酶，补体活性与急性胰腺炎病变程度的关系，本实验以30只健康成年犬为动物模型，采用自身胆汁以不同压力和持续时间灌注犬胰管，观察由此所造成的急性胰腺炎在严重程度上有何不同。结果显示：水肿性与坏死性组于灌注后24h起血清溶菌酶与对照比较明显升高(P<0.01)，坏死性组总补体活性与对照和水肿性比较则明显下降(P<0.01)，提示血清溶菌酶，补体活性在急性胰腺炎的发病机理中具有一定的作用。
The effects of autobile perfusing pancreatic duct of dog with different pressures and time on serum lysozyme and complement activies
, http://www.100md.com
Xie Zhixun,Wu Jiangling,Xie Bin,et al.
Research Laboratory of Molecular Biology.The General Hospital of Chengdu
Military Command,Chengdu 610083
Abstract This study was to observe the relationship of serum lysozyme and complement activities with severify of acute pancreatitis.30 healthy adult dogs were used as experimental animals.The severity of acute pancreatits caused by autobile perfusing pancreatic duct of dog with different pressure and time was studied.The results showed that serum lysozyme of edematous group and necrotic group raised at 24 hour after perfusion compared with conrtol group(P<0.01),but the complement activity in necrotic group was lower than that in conrtol group and edematous group(P<0.01).It is suggessted that serum lysozyme and complement avtivities play a significant role in the pathogenesis of acute pancreatitis.
, 百拇医药
Key words Acute pancreatitis,Bile,perfusion.
急性胰腺炎是外科常见急腹症之一，在临床上一般将病情重，出现多器官功能受损的急性胰腺炎称急性重症胰腺炎，在病理上又将胰腺炎及周围组织出血和坏死又称急性坏死性胰腺炎，以区别普通型胰腺炎即急性水肿性胰腺炎。目前，急性重症胰腺炎尚没有一种可靠，有效的治疗方法，因此死亡率较高。近年来，大量临床资料证实急性重症胰腺炎是由急性水肿性胰腺炎加重恶化所致，经临床观察，胆源性因素在急性胰腺炎病因中占有重要地位，胆汁逆流进入胰管的压力和持续时间是决定急性胰腺炎病变程度的始动因子，即压力越大，时间越长而导致的急性胰腺炎病情越重。为了证实这种假说，本研究利用犬大体动物模型，以不同压力和持续时间将犬自身胆汁灌注胰管后诱发不同程度的急性胰腺炎，同时观察血清溶菌酶，补体活性的变化，探讨它们与急性胰腺炎病变程度的关系。
材料和方法
, http://www.100md.com 1 标本来源：
实验动物为本地健康成年杂种犬，雌雄不限(由成都军区总医院实验动物中心提供)，共30只，体重9.5～14.3kg(11.7±3.1kg)。
2 动物分组：
实验前一周动物置相同条件下统一饲养，将30只犬随机分成五组，每组6只，一组为对照组，二组在4.0kPa压力下持续灌注犬自身胆汁入胰管2h，三组在4.0kPa下灌注6h，四组在8.0kPa压力下持续灌注犬自身胆汁入胰管2h，五组在8.0kPa下灌注6h。
3 实验方法：
(1)手术：所有实验犬均于术前24h禁食，饮水，3%戊巴比妥钠后肢小隐静脉注射(剂量为30mg/kg体重)，麻醉后仰卧固定于动物手术台上，气管插管，在无菌条件下行右侧股静脉插管采血于肝素抗凝瓶中，剪毛铺巾，经上腹部正中切口逐层进腹，探查胰腺，在胆总管入肠壁远侧缝扎副胰管，在十二指肠系膜内找到主胰管，紧贴十二指肠壁结扎其远端，近端向胰腺内插入1.0mm导管，深度约1.0cm，固定，另从皮肤切一小口引出体外并固定于腹壁，接三通开关，并与生理记录仪及胆汁灌注导管相连，胆囊造瘘。插入直径5mm塑料导管，缝合固定，另从皮肤开一小口引出体外，接无菌瓶引流胆汁备用。
, 百拇医药
(2)取材：取灌注胆汁前，后3、6、12，24、48、72h在无菌条件下分别经股静脉插管采血分离血清，采血同时从胰腺不同部位快速采取病变明显胰组织，作形态学，光镜和电镜标本检查。
(3)血清溶菌酶和血清总补体活性测定，分别采用琼脂糖平板溶菌，溶血法[1、2]。
结果
1 形态学检查：在光镜和电镜下观察其形态结构，标本制作按光镜，电镜制作常规并根据Hansson标准[3]对胰组织的坏死进行分级，在整个实验过程中，胰腺结构正常者7例，出现充血，水肿性改变11例(另7例后出现或伴有坏死改变)平均8.72±6.07h，开始出现充血，水肿性改变，出现坏死性改变者12例，平均于10.75±6.94h出现坏死性改变。
表1 血清溶菌酶测定结果(mg/L)
, 百拇医药
O
3h
6h
12h
24h
48h
72h
对照(n=7)
8.56±3.96
8.33±3.41
8.43±3.33
8.24±3.73
8.10±4.55
, http://www.100md.com
8.27±3.74
8.64±4.06
水肿性(n=11)
8.70±2.99
8.26±3.13
8.34±2.85
8.30±3.12
12.77±3.59*
12.3±3.48*
13.067±3.49*
坏死性(n=12)
, http://www.100md.com
8.31±2.13
7.68±2.59
9.31±2.93
8.44±2.21
14.91±2.84*
13.6±3.54*
13.47±4.80*
*与对照比较P<0.01
从结果看，水肿性与坏死性组于24h起升高，与对照组比较差异显著(P<0.01)，但坏死性与水肿性组间差异不显著(P>0.05)。
, http://www.100md.com 表2 血清总补体测定结果(u/ml)
O
3h
6h
12h
24h
48h
72h
对照(n=7)
90.18±26.99
88.53±27.7
91.15±27.64
, http://www.100md.com 89.99±25.02
87.16±21.51
86.88±21.94
85.28±18.77
水肿性(n=11)
89.15±22.52
90.4±21.68
86.69±14.32
78.73±17.61
80.35±20.64
87.2±18.72
, http://www.100md.com
87.31±13.37
坏死性(n=12)
86.35±12.38
90.67±16.4
89.26±12.86
85.72±11.99
51.84±14.45*
53.54±11.07*
56.13±10.72*
*与对照比较P<0.01
, 百拇医药 从上表可见，坏死性胰腺炎组从24h起开始明显降低，与对照及水肿性组相比差异明显(P<0.01)。
讨论
溶菌酶，补体活性在机体正常非特异性免疫中具有重要作用。近年来，关于溶菌酶，补体活性在急性胰腺炎发病机理中有何作用尚无文献报道。本研究采用大体动物模型以琼脂糖溶菌，溶血法对30只杂种犬分组，应用自身胆汁，以不同压力和持续时间灌注犬胰管后诱发不同程度的胰腺炎，并同时对血清溶菌酶，总补体活性进行测定观察。结果显示：血清溶菌酶于灌注后24h开始升高。其原因，因血清中的溶菌酶主要来自体内中性粒细胞，单核细胞及巨噬细胞的溶酶体，由于高压胆汁对胰腺的长时间作用，导致胰腺腺泡坏死及消化酶原在胰内活化和小胰管破裂，胰液外渗至胰实质以及高压直接损伤上皮，使腺泡细胞内的消化酶提前活化，电镜观察发现胰管上皮绒毛消失，空泡变样细胞间隙增宽，基底膜中断，这时胰腺出现炎性反应，并损伤的组织细胞所释放的组织蛋白酶激活补体系统，放出大量活性介质招引吞噬细胞游走集聚于炎症局部，特别对中性粒细胞有强大的吸引力。这时又由于体内循环免疫复合物(CIC)不断增多，活化的巨噬细胞大量出现在血流中，而溶菌酶又位于巨噬细胞表面释放活跃，同时吞噬活性加强。另外，急性胰腺炎，尤其是坏死性胰腺炎往往存在不同程度的酸中毒现象，由于血液pH值的改变，而使细胞膜受损，细胞膜通透性增加，部分溶菌酶透过胞膜进入血液中，甚至细胞破坏，使细胞内的溶菌酶进入血循环，和机体合成加速等原因，从而导致整个血循环中溶菌酶活性的增加，在本实验中23例胰腺炎有18例(78.26%)12～24h光镜下发现胰组织大量炎性细胞浸润，提示血清溶菌酶活性可反映急性胰腺炎时胰组织炎细胞浸润情况。
, 百拇医药
补体在坏死性胰腺炎组织中于24h起开始明显降低，由于补体是一组不耐热和不稳定的蛋白系统，外界刺激，酸碱和蛋白酶都能使补体失活。因动物在持续胆汁高压灌注胰管后，机体突然受到刺激，补体旁路途径被激活，有作者认为胰蛋白酶和基底膜抗体激活补体[4]，导致强烈血管通透性增加，引起急性胰腺炎胰细胞的破坏，使补体活性下降，又因高压胆汁灌注后引起急性坏死性胰腺炎，这时动物出现严重的酸中毒现象，电解质平衡紊乱，同时机体各种代谢增强，使血液中补体灭活。另外，由于补体大部分在肝脏合成，因机体内环境紊乱，致使肝脏合成发生障碍，体内CIC的大量形成，又需补体参与清除等原因，而使血中补体活性下降。本结果显示，水肿性胰腺炎补体活性无明显改变，坏死性则有总补体活性的明显降低，说明补体消耗程度与急性胰腺炎组织坏死程度范围大小有关，提示补体在坏死性胰腺炎的发病机理中具有一定作用。
根据实验结果还提示，在临床上对水肿性胰腺炎行一般保守治疗是可行的，因绝大多数急性胰腺炎不会发展为坏死性胰腺炎。，对经观察和一般保守治疗无缓解的水肿性胰腺炎应及时进行简单有效的胆管减压，以消除高压胆汁逆流入胰腺这一始动因素，这将可大大降低坏死性胰腺炎的发生率，且能促使坏死性胰腺炎患者病情迅速缓解，从根本上改变急性胰腺炎的预后，降低急性胰腺炎的死亡率。
, http://www.100md.com
参考文献：
1 谢秩勋，大熊猫血清溶菌酶的平板测定法.中国兽医科技 1990；12：34
2 谢秩勋，李素华，朱国标，纯种兔血清总补体活性测定 中国兽医科技 1993；9：22
3 Hansson K,Experimental and clinical studies in aetiologic role of bile reflux in acute pancreatits.Acta chir scand 1967;(Suppl)375:53-54
4 Roxvall Li.Rengtson LA,Sennerby 1.et al.Activation of the Complement Cascde by trypsin,Biol chem Hoppe Seyler 1991;372:273-278, 百拇医药
单位：成都军区总医院分子生物研究室 610083
关键词：急性胰腺炎；胆汁；灌注；溶菌酶；总补体
重庆医学990108
摘要 为探讨血清溶菌酶，补体活性与急性胰腺炎病变程度的关系，本实验以30只健康成年犬为动物模型，采用自身胆汁以不同压力和持续时间灌注犬胰管，观察由此所造成的急性胰腺炎在严重程度上有何不同。结果显示：水肿性与坏死性组于灌注后24h起血清溶菌酶与对照比较明显升高(P<0.01)，坏死性组总补体活性与对照和水肿性比较则明显下降(P<0.01)，提示血清溶菌酶，补体活性在急性胰腺炎的发病机理中具有一定的作用。
The effects of autobile perfusing pancreatic duct of dog with different pressures and time on serum lysozyme and complement activies
, http://www.100md.com
Xie Zhixun,Wu Jiangling,Xie Bin,et al.
Research Laboratory of Molecular Biology.The General Hospital of Chengdu
Military Command,Chengdu 610083
Abstract This study was to observe the relationship of serum lysozyme and complement activities with severify of acute pancreatitis.30 healthy adult dogs were used as experimental animals.The severity of acute pancreatits caused by autobile perfusing pancreatic duct of dog with different pressure and time was studied.The results showed that serum lysozyme of edematous group and necrotic group raised at 24 hour after perfusion compared with conrtol group(P<0.01),but the complement activity in necrotic group was lower than that in conrtol group and edematous group(P<0.01).It is suggessted that serum lysozyme and complement avtivities play a significant role in the pathogenesis of acute pancreatitis.
, 百拇医药
Key words Acute pancreatitis,Bile,perfusion.
急性胰腺炎是外科常见急腹症之一，在临床上一般将病情重，出现多器官功能受损的急性胰腺炎称急性重症胰腺炎，在病理上又将胰腺炎及周围组织出血和坏死又称急性坏死性胰腺炎，以区别普通型胰腺炎即急性水肿性胰腺炎。目前，急性重症胰腺炎尚没有一种可靠，有效的治疗方法，因此死亡率较高。近年来，大量临床资料证实急性重症胰腺炎是由急性水肿性胰腺炎加重恶化所致，经临床观察，胆源性因素在急性胰腺炎病因中占有重要地位，胆汁逆流进入胰管的压力和持续时间是决定急性胰腺炎病变程度的始动因子，即压力越大，时间越长而导致的急性胰腺炎病情越重。为了证实这种假说，本研究利用犬大体动物模型，以不同压力和持续时间将犬自身胆汁灌注胰管后诱发不同程度的急性胰腺炎，同时观察血清溶菌酶，补体活性的变化，探讨它们与急性胰腺炎病变程度的关系。
材料和方法
, http://www.100md.com 1 标本来源：
实验动物为本地健康成年杂种犬，雌雄不限(由成都军区总医院实验动物中心提供)，共30只，体重9.5～14.3kg(11.7±3.1kg)。
2 动物分组：
实验前一周动物置相同条件下统一饲养，将30只犬随机分成五组，每组6只，一组为对照组，二组在4.0kPa压力下持续灌注犬自身胆汁入胰管2h，三组在4.0kPa下灌注6h，四组在8.0kPa压力下持续灌注犬自身胆汁入胰管2h，五组在8.0kPa下灌注6h。
3 实验方法：
(1)手术：所有实验犬均于术前24h禁食，饮水，3%戊巴比妥钠后肢小隐静脉注射(剂量为30mg/kg体重)，麻醉后仰卧固定于动物手术台上，气管插管，在无菌条件下行右侧股静脉插管采血于肝素抗凝瓶中，剪毛铺巾，经上腹部正中切口逐层进腹，探查胰腺，在胆总管入肠壁远侧缝扎副胰管，在十二指肠系膜内找到主胰管，紧贴十二指肠壁结扎其远端，近端向胰腺内插入1.0mm导管，深度约1.0cm，固定，另从皮肤切一小口引出体外并固定于腹壁，接三通开关，并与生理记录仪及胆汁灌注导管相连，胆囊造瘘。插入直径5mm塑料导管，缝合固定，另从皮肤开一小口引出体外，接无菌瓶引流胆汁备用。
, 百拇医药
(2)取材：取灌注胆汁前，后3、6、12，24、48、72h在无菌条件下分别经股静脉插管采血分离血清，采血同时从胰腺不同部位快速采取病变明显胰组织，作形态学，光镜和电镜标本检查。
(3)血清溶菌酶和血清总补体活性测定，分别采用琼脂糖平板溶菌，溶血法[1、2]。
结果
1 形态学检查：在光镜和电镜下观察其形态结构，标本制作按光镜，电镜制作常规并根据Hansson标准[3]对胰组织的坏死进行分级，在整个实验过程中，胰腺结构正常者7例，出现充血，水肿性改变11例(另7例后出现或伴有坏死改变)平均8.72±6.07h，开始出现充血，水肿性改变，出现坏死性改变者12例，平均于10.75±6.94h出现坏死性改变。
表1 血清溶菌酶测定结果(mg/L)
, 百拇医药
O
3h
6h
12h
24h
48h
72h
对照(n=7)
8.56±3.96
8.33±3.41
8.43±3.33
8.24±3.73
8.10±4.55
, http://www.100md.com
8.27±3.74
8.64±4.06
水肿性(n=11)
8.70±2.99
8.26±3.13
8.34±2.85
8.30±3.12
12.77±3.59*
12.3±3.48*
13.067±3.49*
坏死性(n=12)
, http://www.100md.com
8.31±2.13
7.68±2.59
9.31±2.93
8.44±2.21
14.91±2.84*
13.6±3.54*
13.47±4.80*
*与对照比较P<0.01
从结果看，水肿性与坏死性组于24h起升高，与对照组比较差异显著(P<0.01)，但坏死性与水肿性组间差异不显著(P>0.05)。
, http://www.100md.com 表2 血清总补体测定结果(u/ml)
O
3h
6h
12h
24h
48h
72h
对照(n=7)
90.18±26.99
88.53±27.7
91.15±27.64
, http://www.100md.com 89.99±25.02
87.16±21.51
86.88±21.94
85.28±18.77
水肿性(n=11)
89.15±22.52
90.4±21.68
86.69±14.32
78.73±17.61
80.35±20.64
87.2±18.72
, http://www.100md.com
87.31±13.37
坏死性(n=12)
86.35±12.38
90.67±16.4
89.26±12.86
85.72±11.99
51.84±14.45*
53.54±11.07*
56.13±10.72*
*与对照比较P<0.01
, 百拇医药 从上表可见，坏死性胰腺炎组从24h起开始明显降低，与对照及水肿性组相比差异明显(P<0.01)。
讨论
溶菌酶，补体活性在机体正常非特异性免疫中具有重要作用。近年来，关于溶菌酶，补体活性在急性胰腺炎发病机理中有何作用尚无文献报道。本研究采用大体动物模型以琼脂糖溶菌，溶血法对30只杂种犬分组，应用自身胆汁，以不同压力和持续时间灌注犬胰管后诱发不同程度的胰腺炎，并同时对血清溶菌酶，总补体活性进行测定观察。结果显示：血清溶菌酶于灌注后24h开始升高。其原因，因血清中的溶菌酶主要来自体内中性粒细胞，单核细胞及巨噬细胞的溶酶体，由于高压胆汁对胰腺的长时间作用，导致胰腺腺泡坏死及消化酶原在胰内活化和小胰管破裂，胰液外渗至胰实质以及高压直接损伤上皮，使腺泡细胞内的消化酶提前活化，电镜观察发现胰管上皮绒毛消失，空泡变样细胞间隙增宽，基底膜中断，这时胰腺出现炎性反应，并损伤的组织细胞所释放的组织蛋白酶激活补体系统，放出大量活性介质招引吞噬细胞游走集聚于炎症局部，特别对中性粒细胞有强大的吸引力。这时又由于体内循环免疫复合物(CIC)不断增多，活化的巨噬细胞大量出现在血流中，而溶菌酶又位于巨噬细胞表面释放活跃，同时吞噬活性加强。另外，急性胰腺炎，尤其是坏死性胰腺炎往往存在不同程度的酸中毒现象，由于血液pH值的改变，而使细胞膜受损，细胞膜通透性增加，部分溶菌酶透过胞膜进入血液中，甚至细胞破坏，使细胞内的溶菌酶进入血循环，和机体合成加速等原因，从而导致整个血循环中溶菌酶活性的增加，在本实验中23例胰腺炎有18例(78.26%)12～24h光镜下发现胰组织大量炎性细胞浸润，提示血清溶菌酶活性可反映急性胰腺炎时胰组织炎细胞浸润情况。
, 百拇医药
补体在坏死性胰腺炎组织中于24h起开始明显降低，由于补体是一组不耐热和不稳定的蛋白系统，外界刺激，酸碱和蛋白酶都能使补体失活。因动物在持续胆汁高压灌注胰管后，机体突然受到刺激，补体旁路途径被激活，有作者认为胰蛋白酶和基底膜抗体激活补体[4]，导致强烈血管通透性增加，引起急性胰腺炎胰细胞的破坏，使补体活性下降，又因高压胆汁灌注后引起急性坏死性胰腺炎，这时动物出现严重的酸中毒现象，电解质平衡紊乱，同时机体各种代谢增强，使血液中补体灭活。另外，由于补体大部分在肝脏合成，因机体内环境紊乱，致使肝脏合成发生障碍，体内CIC的大量形成，又需补体参与清除等原因，而使血中补体活性下降。本结果显示，水肿性胰腺炎补体活性无明显改变，坏死性则有总补体活性的明显降低，说明补体消耗程度与急性胰腺炎组织坏死程度范围大小有关，提示补体在坏死性胰腺炎的发病机理中具有一定作用。
根据实验结果还提示，在临床上对水肿性胰腺炎行一般保守治疗是可行的，因绝大多数急性胰腺炎不会发展为坏死性胰腺炎。，对经观察和一般保守治疗无缓解的水肿性胰腺炎应及时进行简单有效的胆管减压，以消除高压胆汁逆流入胰腺这一始动因素，这将可大大降低坏死性胰腺炎的发生率，且能促使坏死性胰腺炎患者病情迅速缓解，从根本上改变急性胰腺炎的预后，降低急性胰腺炎的死亡率。
, http://www.100md.com
参考文献：
1 谢秩勋，大熊猫血清溶菌酶的平板测定法.中国兽医科技 1990；12：34
2 谢秩勋，李素华，朱国标，纯种兔血清总补体活性测定 中国兽医科技 1993；9：22
3 Hansson K,Experimental and clinical studies in aetiologic role of bile reflux in acute pancreatits.Acta chir scand 1967;(Suppl)375:53-54
4 Roxvall Li.Rengtson LA,Sennerby 1.et al.Activation of the Complement Cascde by trypsin,Biol chem Hoppe Seyler 1991;372:273-278, 百拇医药