柱前衍生化HPLC法定量分析羟脯氨酸初探
作者：农 嵩
单位：右江民族医学院生物化学教研室(百色 533000)
关键词：柱前衍生化；高效液相色谱法；羟脯氨酸；2,4—二硝基氟苯
右江民族医学院学报/9901111 摘要 以2,4—二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生化高效液相色谱法(HPLC法)定量分析羟脯氨酸，同时对线性关系、回收率进行考察，结果表明，进样量在0.016～0.080μg范围内呈良好的线性，相关系数γ=0.9999，回收率误差及变异系数均<3%，说明试验的准确度高，重现性好，为进一步分析羟脯氨酸提供必要的参考。
羟脯氨酸定量分析一般采用化学法，用HPLC法目前尚未见报道。笔者以柱前衍生化HPLC法定量分析羟脯氨酸，操作简便，衍生反应彻底，过量的DNFB对分析无干扰，分析时间短，准确度高，重现性好。现将分析方法及结果介绍如下：
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂 乙腈、无水醋酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、二甲基甲酰胺均为分析纯；2,4—二硝基氟苯为生化试剂；羟脯氨酸对照品由中国科学院上海生物化学研究所提供(含量99%以上)；双蒸馏水。
1.2 仪器及测定条件 仪器：岛津LC-5A型高效液相色谱仪，SPD-2AM可变紫外检测器，C-R2AX数据处理机，微量进样器。测定条件：色谱柱：YWG-C18250X 4.6mm(大连物理化学研究所)，流动相：乙腈∶二甲基甲酰胺∶0.025mol/L醋酸钠(26∶1∶72)，以醋酸调节pH为6.0，检测波长
360nm，流速1ml/min，纸速0.5cm/min，柱温30℃，灵敏度0.01AUFS。
2 试验方法与结果
, 百拇医药 2.1 线性关系试验 精密称取羟脯氨酸对照品10mg，置100ml容量瓶中，加少量水溶解后稀释至刻度。精确移取2ml对照品溶液置25ml容量瓶中，加0.1%2,4—二硝基氟苯乙腈溶液2ml及0.5mol/L碳酸氢钠溶液2ml，摇匀后放到60℃水浴1h，取出放冷，加pH7.0磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，照上述测定条件，进样2、4、6、8、10μl进行分析测定，其结果见表1，色谱图见图1。
表1 线性试验结果 进样量μg
0.016
0.032
0.048
0.064
0.080
峰面积cm2
, 百拇医药
0.4811
0.9211
1.3517
1.7810
2.2256
回归方程 y=-0.001743+0.03679x γ=0.9999
图1 羟脯氨酸对照品色谱图
Ⅰ DNP-羟脯氨酸 Ⅱ DNFB
2.2 回收试验 精密称取羟脯氨酸对照品适量，分别加入已知浓度的对照品溶液中，按照线性试验项下进行操作，进样6μl，测定回收率，试验结果见表2。
, http://www.100md.com
表2 回收率测定结果 加入量
mg
测得量(n=3)
mg
平均回收率
%
变异系数
%
5.50
5.62
5.57
5.70
102.4
, 百拇医药
0.95
11.63
11.70
11.66
11.55
100.1
0.55
15.80
15.40
15.57
15.33
97.67
0.65
, 百拇医药
3 讨论
3.1 在碱性介质下，羟脯氨酸与DNFB乙腈溶液混合振摇即生成DNP-羟脯氨酸[1]，是比较稳定的衍生物，可直接进样测定，过量的DNFB峰对分析没有影响，衍生物在360nm波长处有最大吸收峰，且性质较稳定，室温放置36h后测定组分保持稳定。操作较为简便，分析时间短，对线性及回收率进行考察，结果表明，其线性关系良好，回收率误差<3%，变异系数<3%，说明本试验准确度及重现性均比较满意。
3.2 本试验衍生剂DNFB的加入量是衍生化是否进行彻底的关键，DNFB的加入量应为分析氨基酸量5倍以上[2]，才能得到彻底的衍生物。配制的对照品溶液置棕色瓶中于4℃冰箱存放可稳定60天。
3.3 尿样中羟脯氨酸主要以多肽形式存在，需要特殊处理后才分解成游离的羟脯氨酸，因实验条件的限制，本试验对尿样羟脯氨酸未作进一步分析。
参考文献
[1] 华家柽，奚国良，易庆成，等.实用蛋白质化学技术.上海：上海科学技术出版社，1982：248
[2] 陈娅兰，付宜和，王国林，等.十八种氨基酸注射液的HPLC 2,4—二硝基氟苯柱前衍生化法含量测定.药物分析杂志，1990；10(3)：150
(1998-03-05收稿)
, 百拇医药
单位：右江民族医学院生物化学教研室(百色 533000)
关键词：柱前衍生化；高效液相色谱法；羟脯氨酸；2,4—二硝基氟苯
右江民族医学院学报/9901111 摘要 以2,4—二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生化高效液相色谱法(HPLC法)定量分析羟脯氨酸，同时对线性关系、回收率进行考察，结果表明，进样量在0.016～0.080μg范围内呈良好的线性，相关系数γ=0.9999，回收率误差及变异系数均<3%，说明试验的准确度高，重现性好，为进一步分析羟脯氨酸提供必要的参考。
羟脯氨酸定量分析一般采用化学法，用HPLC法目前尚未见报道。笔者以柱前衍生化HPLC法定量分析羟脯氨酸，操作简便，衍生反应彻底，过量的DNFB对分析无干扰，分析时间短，准确度高，重现性好。现将分析方法及结果介绍如下：
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1 材料与方法
1.1 试剂 乙腈、无水醋酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、二甲基甲酰胺均为分析纯；2,4—二硝基氟苯为生化试剂；羟脯氨酸对照品由中国科学院上海生物化学研究所提供(含量99%以上)；双蒸馏水。
1.2 仪器及测定条件 仪器：岛津LC-5A型高效液相色谱仪，SPD-2AM可变紫外检测器，C-R2AX数据处理机，微量进样器。测定条件：色谱柱：YWG-C18250X 4.6mm(大连物理化学研究所)，流动相：乙腈∶二甲基甲酰胺∶0.025mol/L醋酸钠(26∶1∶72)，以醋酸调节pH为6.0，检测波长
360nm，流速1ml/min，纸速0.5cm/min，柱温30℃，灵敏度0.01AUFS。
2 试验方法与结果
, 百拇医药 2.1 线性关系试验 精密称取羟脯氨酸对照品10mg，置100ml容量瓶中，加少量水溶解后稀释至刻度。精确移取2ml对照品溶液置25ml容量瓶中，加0.1%2,4—二硝基氟苯乙腈溶液2ml及0.5mol/L碳酸氢钠溶液2ml，摇匀后放到60℃水浴1h，取出放冷，加pH7.0磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，照上述测定条件，进样2、4、6、8、10μl进行分析测定，其结果见表1，色谱图见图1。
表1 线性试验结果 进样量μg
0.016
0.032
0.048
0.064
0.080
峰面积cm2
, 百拇医药
0.4811
0.9211
1.3517
1.7810
2.2256
回归方程 y=-0.001743+0.03679x γ=0.9999
图1 羟脯氨酸对照品色谱图
Ⅰ DNP-羟脯氨酸 Ⅱ DNFB
2.2 回收试验 精密称取羟脯氨酸对照品适量，分别加入已知浓度的对照品溶液中，按照线性试验项下进行操作，进样6μl，测定回收率，试验结果见表2。
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表2 回收率测定结果 加入量
mg
测得量(n=3)
mg
平均回收率
%
变异系数
%
5.50
5.62
5.57
5.70
102.4
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0.95
11.63
11.70
11.66
11.55
100.1
0.55
15.80
15.40
15.57
15.33
97.67
0.65
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3 讨论
3.1 在碱性介质下，羟脯氨酸与DNFB乙腈溶液混合振摇即生成DNP-羟脯氨酸[1]，是比较稳定的衍生物，可直接进样测定，过量的DNFB峰对分析没有影响，衍生物在360nm波长处有最大吸收峰，且性质较稳定，室温放置36h后测定组分保持稳定。操作较为简便，分析时间短，对线性及回收率进行考察，结果表明，其线性关系良好，回收率误差<3%，变异系数<3%，说明本试验准确度及重现性均比较满意。
3.2 本试验衍生剂DNFB的加入量是衍生化是否进行彻底的关键，DNFB的加入量应为分析氨基酸量5倍以上[2]，才能得到彻底的衍生物。配制的对照品溶液置棕色瓶中于4℃冰箱存放可稳定60天。
3.3 尿样中羟脯氨酸主要以多肽形式存在，需要特殊处理后才分解成游离的羟脯氨酸，因实验条件的限制，本试验对尿样羟脯氨酸未作进一步分析。
参考文献
[1] 华家柽，奚国良，易庆成，等.实用蛋白质化学技术.上海：上海科学技术出版社，1982：248
[2] 陈娅兰，付宜和，王国林，等.十八种氨基酸注射液的HPLC 2,4—二硝基氟苯柱前衍生化法含量测定.药物分析杂志，1990；10(3)：150
(1998-03-05收稿)
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