金黄色葡萄球菌的分子生物学分型研究
作者：周 坚 郭思建
单位：周坚 郭思建(临床微生物学和免疫学教研室 长沙 410078)
关键词：金黄色葡萄球菌；随机扩增多态性DNA分型*；聚合酶链反应；分子生物学
湖南医科大学学报990106 提要 应用ERIC-2，Ap1和Ap7三种随机引物进行26株临床分离金黄色葡萄球菌的随机扩增多态性DNA分型研究。结果显示：三种引物均能有效地进行金黄色葡萄球菌的分子生物学分型，分别分为9型、6型和10型，而引物Ap7具有更好的可分型性。表明该方法具有应用前景。
中国图书分类号 R378.11
Molecular typing of staphylococcus aureus with
, 百拇医药
randomly amplified polymorphic DNA
Zhou Jian Guo Sijian
(Department of Clinical Microbiology and Immunology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
The randomly amplified polymorphic DNA(RAPD) was used to type the 26 clinically isolated strains of staphylococcus aureus. The results were that all three primers of this method, ERIC-2, Ap1, and Ap7 on molecular typing of staphylococcus aureus and identified 9,6, and 10 genotypes, respectively; the primer Ap7 produced better results than the other primers. The present study suggests that RAPD is a simple and rapid method and has a practical value in the molecular typing of staphylococcus aureus.
, 百拇医药
Key words staphylococcus aureus; randomly amplified polymorphic DNA*; polymerase chain reaction; molecular biology
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus;简称金葡菌)是临床上引起化脓性感染和医院内感染常见的病原菌，严重地危害人类生命健康。耐药菌株，尤其是多重耐药菌株，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus; MRSA)的出现和广泛传播，更成为临床治疗棘手的难题[1]。防治金葡菌感染，必须采取有效、快速的检测手段进行病原体鉴定和分型，以寻找感染源，切断传播途径。既往多采用噬菌体分型金葡菌，但此方法依赖于噬菌体库的建立，操作方法较繁琐，可分型性较低，不能满足临床需要。近年来，国内外学者均试图应用分子生物学方法进行金葡菌的基因分型。目前常用的方法有：质粒图谱分型、限制性酶切分型、核糖体分型、聚合酶链分型(Polymerase Chain Reaction; PCR)+酶切分型、脉冲凝胶电泳分型(Pulsed Field Gel Electrophoresis; PFGE)及随机扩增多态性DNA分型(Randomly Amplified Polymorphic DNA; RAPD)[2]。这些方法中因后两者的可分型性、重复性和分辨力均较好，更为常用。本文拟采用三种随机引物分别进行临床分离的26株金葡菌的RAPD分型研究，旨在建立一种简便实用的分子生物学分型方法。
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1 材料与方法
1.1 菌株 分别从湘雅医院分离金葡菌26株，均经形态学和生化试验鉴定证实，菌株编号为CHXY 9601～9626。
1.2 方法
1.2.1 样本DNA的分离 参照Boom R等的方法应用Celite进行金葡菌染色体DNA分离[3]。测定抽提后DNA的浓度，置-20℃冰箱保存备用。
1.2.2 RAPD分型 参照Alex van B等的方法[4]。取5 ng样本DNA于PCR反应缓冲液，内含10 mmol Tris.HCl pH8.0, 50 mmol KCl, 2.5 mmol MgCl2, 0.1%明胶，0.1% Triton X-100,0.02 mmol dNTP, 0.2 U Taq酶及50 pmol引物。三种引物序列分别为：ERIC-2 5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′；Ap1 5′-GGTTGGGTGAGAATTGCACG-3′；Ap7 5′-GTGGATGCGA-3′。PCR反应液覆盖50 μl矿物油后进行扩增，先94℃预变性5 min，然后94℃ 1 min，25℃ 1 min,74℃ 2 min。40个循环后取20 μl扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，扩增产物带型经紫外反射仪上观察并摄片。
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2 结 果
RAPD扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后呈现不同带型，同一株细菌可出现泳动速率各异的数条带型，将带型数目及位置完全相同者归为同一型(附图)。分型株类型分别以A～J等10个英文字母表示，株型号列于附表中。三种引物分别将26株金葡菌分为9型、6型和10型。
附图 金葡菌的RAPD分型扩增产物琼脂糖凝胶电泳 M. DNA标准分子量100 bp梯度标志； 1～26. 标本9601～9626； A. ERIC-2; B. Ap1; C. Ap7
Fig. Agarose gel electrophoresis of RAPD products of S.aureus with ERIC-2(A),Apl(B),Ap7(C)primers M. DNA marker； 1～26. Specimens 9601～9626
, 百拇医药
附表 26株金葡菌的RAPD分型结果 菌株型号
引 物
菌株型号
引 物
ERIC-2
Ap1
Ap7
ERIC-2
Ap1
Ap7
CHXY 9601
A①
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A
A
CHXY 9614
C
B
D
CHXY 9602
A
A
B
CHXY 9615
A
C
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A
CHXY 9603
B
B
C
CHXY 9616
A
C
A
CHXY 9604
A
C
A
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CHXY 9617
A
C
A
CHXY 9605
A
A
A
CHXY 9618
A
A
A
CHXY 9606
, 百拇医药
A
C
A
CHXY 9619
A
A
E
CHXY 9607
A
A
A
CHXY 9620
D
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B
F
CHXY 9608
B
B
C
CHXY 9621
E
E
G
CHXY 9609
A
C
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A
CHXY 9622
D
B
F
CHXY 9610
A
C
A
CHXY 9623
F
B
H
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CHXY 9611
C
D
C
CHXY 9624
G
F
I
CHXY 9612
A
C
A
CHXY 9625
, 百拇医药
H
B
J
CHXY 9613
A
A
A
CHXY 9626
I
B
F
①分离型别
3 讨 论
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RAPD分型方法采用单一引物，通过PCR扩增产生复杂基因组的指纹图谱而进行细菌或其它病原体的分型。其基本原理是采用相当低的退火温度，引物能非特异地识别细菌染色体上相应DNA位点，从而发生多位点的结合。结合位点可存在于两条DNA链上，相互之间的结合距离约数百个乃至数千个碱基，这些位点之间的DNA序列可经PCR扩增，因而在琼脂糖凝胶电泳上出现多条分子量大小不一的DNA带型。理论上，同种同型别的菌株应具备特异而稳定的DNA指纹图谱，故可应用于细菌不同种或不同型别菌株的鉴别。该法较经典的表型或其它分子生物学方法具有更好的分型性和分辨力，结果也易判定和解释[5]。
本研究应用ERIC-2，Ap1和Ap7三种随机引物分别进行临床分离的26株金葡菌的RAPD分型，分别将26株金葡菌分为9型、6型和10型。三者之间虽具有一定的相符性，但Ap7较Ap1和ERIC-2具有更好的可分型性，扩增产物结果更为清晰，故认为Ap7是一种理想的随机引物。
尽管RAPD能有效地进行病原体的分型，但由于采取相当低的退火温度，PCR扩增条件相对宽松，故存在一定错配现象。同时样本DNA浓度、PCR扩增缓冲液中的离子浓度、特别是镁离子浓度、Taq DNA聚合酶、引物G+C含量及引物长度、扩增条件和操作者的技能，均影响分型的重复性，故RAPD分型方法的临床应用有待进一步完善和实验条件的标准化。
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作者：周坚 男 35岁 副教授 ①附属湘雅医院检验科
参考文献
[1]Vandenbrouske-Grauls CMJE. Methicillin-resistant staphylococcus aureus control in hospital: The Dutch experience. Infect Control Hosp Epidemiol, 1996,17(8):512-517
[2]van Belkum A, van Leeuwen W, Kleytmans J, et al. Molecular nosocomial epidemiology: High speed typing of microbial pathogens by arbitrary primed polymerase chain reaction assays. Infect Control Hosp Epidemiol, 1995,16(9):658-666
, 百拇医药
[3]Boom R, Sol CJA, Salimans MMM, et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol, 1990,28(3):495-503
[4]van Belkum A, Kleytamans J, van Leeuwen W, et al. Multicenter evaluation of arbitrary primed PCR for typing of staphylococcus aureus strains. J Clin Microbiol, 1995,33:1537-1547
[5]Tenover FC, Arbeit R, Archer G, et al. Comparison of traditional and molecular methods of typing staphylococcus aureus. J Clin Microbiol, 1994,32(1):407-415
1998-05-12 收稿, http://www.100md.com
单位：周坚 郭思建(临床微生物学和免疫学教研室 长沙 410078)
关键词：金黄色葡萄球菌；随机扩增多态性DNA分型*；聚合酶链反应；分子生物学
湖南医科大学学报990106 提要 应用ERIC-2，Ap1和Ap7三种随机引物进行26株临床分离金黄色葡萄球菌的随机扩增多态性DNA分型研究。结果显示：三种引物均能有效地进行金黄色葡萄球菌的分子生物学分型，分别分为9型、6型和10型，而引物Ap7具有更好的可分型性。表明该方法具有应用前景。
中国图书分类号 R378.11
Molecular typing of staphylococcus aureus with
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randomly amplified polymorphic DNA
Zhou Jian Guo Sijian
(Department of Clinical Microbiology and Immunology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
The randomly amplified polymorphic DNA(RAPD) was used to type the 26 clinically isolated strains of staphylococcus aureus. The results were that all three primers of this method, ERIC-2, Ap1, and Ap7 on molecular typing of staphylococcus aureus and identified 9,6, and 10 genotypes, respectively; the primer Ap7 produced better results than the other primers. The present study suggests that RAPD is a simple and rapid method and has a practical value in the molecular typing of staphylococcus aureus.
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Key words staphylococcus aureus; randomly amplified polymorphic DNA*; polymerase chain reaction; molecular biology
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus;简称金葡菌)是临床上引起化脓性感染和医院内感染常见的病原菌，严重地危害人类生命健康。耐药菌株，尤其是多重耐药菌株，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus; MRSA)的出现和广泛传播，更成为临床治疗棘手的难题[1]。防治金葡菌感染，必须采取有效、快速的检测手段进行病原体鉴定和分型，以寻找感染源，切断传播途径。既往多采用噬菌体分型金葡菌，但此方法依赖于噬菌体库的建立，操作方法较繁琐，可分型性较低，不能满足临床需要。近年来，国内外学者均试图应用分子生物学方法进行金葡菌的基因分型。目前常用的方法有：质粒图谱分型、限制性酶切分型、核糖体分型、聚合酶链分型(Polymerase Chain Reaction; PCR)+酶切分型、脉冲凝胶电泳分型(Pulsed Field Gel Electrophoresis; PFGE)及随机扩增多态性DNA分型(Randomly Amplified Polymorphic DNA; RAPD)[2]。这些方法中因后两者的可分型性、重复性和分辨力均较好，更为常用。本文拟采用三种随机引物分别进行临床分离的26株金葡菌的RAPD分型研究，旨在建立一种简便实用的分子生物学分型方法。
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1 材料与方法
1.1 菌株 分别从湘雅医院分离金葡菌26株，均经形态学和生化试验鉴定证实，菌株编号为CHXY 9601～9626。
1.2 方法
1.2.1 样本DNA的分离 参照Boom R等的方法应用Celite进行金葡菌染色体DNA分离[3]。测定抽提后DNA的浓度，置-20℃冰箱保存备用。
1.2.2 RAPD分型 参照Alex van B等的方法[4]。取5 ng样本DNA于PCR反应缓冲液，内含10 mmol Tris.HCl pH8.0, 50 mmol KCl, 2.5 mmol MgCl2, 0.1%明胶，0.1% Triton X-100,0.02 mmol dNTP, 0.2 U Taq酶及50 pmol引物。三种引物序列分别为：ERIC-2 5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′；Ap1 5′-GGTTGGGTGAGAATTGCACG-3′；Ap7 5′-GTGGATGCGA-3′。PCR反应液覆盖50 μl矿物油后进行扩增，先94℃预变性5 min，然后94℃ 1 min，25℃ 1 min,74℃ 2 min。40个循环后取20 μl扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，扩增产物带型经紫外反射仪上观察并摄片。
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2 结 果
RAPD扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后呈现不同带型，同一株细菌可出现泳动速率各异的数条带型，将带型数目及位置完全相同者归为同一型(附图)。分型株类型分别以A～J等10个英文字母表示，株型号列于附表中。三种引物分别将26株金葡菌分为9型、6型和10型。
附图 金葡菌的RAPD分型扩增产物琼脂糖凝胶电泳 M. DNA标准分子量100 bp梯度标志； 1～26. 标本9601～9626； A. ERIC-2; B. Ap1; C. Ap7
Fig. Agarose gel electrophoresis of RAPD products of S.aureus with ERIC-2(A),Apl(B),Ap7(C)primers M. DNA marker； 1～26. Specimens 9601～9626
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附表 26株金葡菌的RAPD分型结果 菌株型号
引 物
菌株型号
引 物
ERIC-2
Ap1
Ap7
ERIC-2
Ap1
Ap7
CHXY 9601
A①
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A
A
CHXY 9614
C
B
D
CHXY 9602
A
A
B
CHXY 9615
A
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A
CHXY 9603
B
B
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CHXY 9616
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CHXY 9604
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CHXY 9605
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CHXY 9613
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B
F
①分离型别
3 讨 论
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RAPD分型方法采用单一引物，通过PCR扩增产生复杂基因组的指纹图谱而进行细菌或其它病原体的分型。其基本原理是采用相当低的退火温度，引物能非特异地识别细菌染色体上相应DNA位点，从而发生多位点的结合。结合位点可存在于两条DNA链上，相互之间的结合距离约数百个乃至数千个碱基，这些位点之间的DNA序列可经PCR扩增，因而在琼脂糖凝胶电泳上出现多条分子量大小不一的DNA带型。理论上，同种同型别的菌株应具备特异而稳定的DNA指纹图谱，故可应用于细菌不同种或不同型别菌株的鉴别。该法较经典的表型或其它分子生物学方法具有更好的分型性和分辨力，结果也易判定和解释[5]。
本研究应用ERIC-2，Ap1和Ap7三种随机引物分别进行临床分离的26株金葡菌的RAPD分型，分别将26株金葡菌分为9型、6型和10型。三者之间虽具有一定的相符性，但Ap7较Ap1和ERIC-2具有更好的可分型性，扩增产物结果更为清晰，故认为Ap7是一种理想的随机引物。
尽管RAPD能有效地进行病原体的分型，但由于采取相当低的退火温度，PCR扩增条件相对宽松，故存在一定错配现象。同时样本DNA浓度、PCR扩增缓冲液中的离子浓度、特别是镁离子浓度、Taq DNA聚合酶、引物G+C含量及引物长度、扩增条件和操作者的技能，均影响分型的重复性，故RAPD分型方法的临床应用有待进一步完善和实验条件的标准化。
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作者：周坚 男 35岁 副教授 ①附属湘雅医院检验科
参考文献
[1]Vandenbrouske-Grauls CMJE. Methicillin-resistant staphylococcus aureus control in hospital: The Dutch experience. Infect Control Hosp Epidemiol, 1996,17(8):512-517
[2]van Belkum A, van Leeuwen W, Kleytmans J, et al. Molecular nosocomial epidemiology: High speed typing of microbial pathogens by arbitrary primed polymerase chain reaction assays. Infect Control Hosp Epidemiol, 1995,16(9):658-666
, 百拇医药
[3]Boom R, Sol CJA, Salimans MMM, et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol, 1990,28(3):495-503
[4]van Belkum A, Kleytamans J, van Leeuwen W, et al. Multicenter evaluation of arbitrary primed PCR for typing of staphylococcus aureus strains. J Clin Microbiol, 1995,33:1537-1547
[5]Tenover FC, Arbeit R, Archer G, et al. Comparison of traditional and molecular methods of typing staphylococcus aureus. J Clin Microbiol, 1994,32(1):407-415
1998-05-12 收稿, http://www.100md.com