维生素C对沙眼衣原体增殖的影响及其应用①
作者：余 平 韦超凡 扈凤平 龚道科 石歆莹
单位：余 平 韦超凡 扈凤平(免疫学教研室 长沙 410078)；龚道科 石歆莹(临床微生物学教研室 长沙 410078)
关键词：沙眼衣原体；维生素C；细胞培养
湖南医科大学学报990104 提要 采用细胞培养法和免疫荧光法，对288份临床标本进行沙眼衣原体(CT)的分离鉴定，并观察维生素C(vitC)对阳性标本中CT包涵体形成的影响。结果显示CT在vitC 5μg.ml-1组中包涵体形成率为29.5%，与含放线菌酮的对照组比较差异无显著性(P>0.05)。提示vitC是CT所需要的一种营养物质，可促进CT在细胞内的增殖；并可替代放线菌酮用于McCoy细胞培养检测CT感染的临床标本。
中国图书分类号 R374.1
, 百拇医药
Effects and Applications of Ascorbic Acid
on the Proliferation of Chlamydia trachomatis
Yu Ping Wei Chaofan Hu Fengping
(Department of Immunology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
Gong Daoke Shi Xingying
(Department of Clinic Microbiology and Immunology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
, 百拇医药
Two hundred and eighty-eight samples of patients with nongonococcal urethritis (NGU) and prostatitis were detected by cell culture and immunofluorescence assay for Chlamydia trachomatis (CT) and the effects of ascorbic acid(vitC) on the formation rate of inclusion of CT in positive samples were also studied. The results showed that the formation rate of inclusion of CT was 29.5% when the concentration of vitC was 5μg.ml-1. The difference between test group and control group which contained cycloheximide in the media was insignificant (P>0.05). The results suggested that vitC was a kind of nutrient needed for CT. The proliferation of CT in the cell can be promoted by vitC. We can replace cycloheximide by vitC in McCoy cell culture to detect clinic samples with CT.
, 百拇医药
Key words Chlamydia trachomatis; vitC; cell culture
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, CT)是非淋菌性尿道炎(nongonococcal urethritis, NGU)的主要病原体，约40%～50% NGU病例由其引起，其中50%～70%的患者临床上只有轻微的不适或常无症状，因而易被人们忽视[1]。衣原体性宫颈炎如不治疗，30%～40%患者将发展为输卵管炎、盆腔炎、宫外孕及输卵管性不孕症等远期后遗症[2]。由此，对CT的分离、培养及早期诊断就显得非常重要。CT分离培养，传统的方法是在培养液中加入放线菌酮；而在培养液中加入vitC促进CT生长的研究国内未见报道。本文应用对CT高度敏感的McCoy细胞，在含不同浓度的vitC培养液中观察CT包涵体形成的情况。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料 (1)标本来源 1995年7月～1997年10月在长沙市级医院、湖南医科大学皮肤性病专科门诊就诊，具有临床病症3个月以上的NGU和前列腺炎患者506例，年龄20～67岁，其中男性314例，女性192例。(2)试剂 ①CT传送液为RPMI-1640加万古霉素40μg.ml-1、庆大霉素300μg.ml-1、二性霉素B 10μg.ml-1及1%的的小牛血清。②营养液为RPMI-1640培养液加万古霉素4μg.ml-1、庆大霉素50μg.ml-1、二性霉素B 5μg.ml-1及7.5%小牛血清。③维生素C注射液0.25g.ml-1支，南京第三制药厂。④放线菌酮，Sigma公司。⑤衣原体荧光单克隆抗体诊断试剂盒，中山医科大学免疫室提供。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 标本采集及保存 女性用无菌棉拭子插入宫颈1～2cm，缓慢转动一圈取出，直接置入CT传送液；男性用无菌棉拭子插入尿道1.5～3cm，取尿道分泌物，直接置入CT传送液，或进行前列腺按摩，将前列腺液滴入CT传送液中，置4℃冰箱保存，24h内进行细胞培养。或将传送液置-70℃保存。
1.2.2 制备单层McCoy细胞瓶[3] McCoy细胞在组织培养瓶中生成致密单层。经0.25%胰酶消化后，加入细胞生长液配成约含1×105细胞/ml的细胞悬液，吸取1ml分装于细胞培养小瓶中，瓶底预先置一块12mm×12mm的盖玻片，在5% CO2 37℃二氧化碳孵育箱中孵育24～48h，使细胞在盖玻片上形成单层细胞。
1.2.3 实验分组及标本筛选 细胞培养液以含1μg.ml-1放线菌酮为对照组；含vitC浓度分别为2，5，12.5和125μg.ml-1为实验组Ⅰ；含放线菌酮(1μg.ml-1)+vitC(5μg.ml-1)为实验组Ⅱ；未加放线菌酮和VitC的细胞培养液为实验组Ⅲ。288份临床标本未经传统的细胞培养法培养后，用碘染色和荧光单克隆抗体鉴定CT。将86份阳性标本和20份阴性标本进行实验。
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1.2.4 接种标本 经鉴定为阳性和阴性的标本，旋涡振荡20min，取上清，接种至各试验瓶中，每瓶接种100μl，每种浓度各接种2瓶。以3000r.min-1离心1h后，置37℃温箱孵育4h，吸去上清液，每瓶再分别加入与接种时相同浓度的含vitC或放线菌酮的培养液，置5% CO2 37℃二氧化碳孵育中孵育48～72h。
1.2.5 制片染色计数 孵育后，取出盖玻片，无水甲醇固定10min，一片作碘染色，在显微镜下观察McCoy细胞中是否有包涵体形成，并计数500个细胞中有多少含包涵体的细胞(包涵体形成百分率)；另一片作荧光单克隆抗体检测(按试剂盒说明书的要求操作和判断结果)，在荧光显微镜下观察细胞形态完整，胞浆中有苹果绿荧光者判为阳性。
1.3 统计学处理 所得数据用χ2检验进行统计分析。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 实验标本筛选结果 288份临床标本筛选结果见表1。
表1 288份临床标本CT感染检测结果 标本
性别
标本数
检出感染率(%)
宫颈分泌物
女
?92
28/92(30.4)
尿道口拭子
男
?94
, 百拇医药
?28/94(29.8)
前列腺液
男
102
30/102(29.4)
合计
288
86/288(29.9)
2.2 VitC对CT增殖的作用 20份阴性标本在各实验组CT检测结果均为阴性。86份阳性标本在对照组及各实验组包涵体形成率见附图和表2。
附图 不同浓度的vitC对CT包涵体形成的影响
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Fig. The effect of vitC on the formation rate of CT inclusion
表2 不同细胞培养液对CT包涵体形成的影响 组别
vitC
(μg.ml-1)
放线菌酮
(μg.ml-1)
包涵体形成率
(%)
对照组
0
, http://www.100md.com
1
29.2
实验组Ⅰ
2
0
25.6
5
0
29.5
12.5
0
29.4
125
, http://www.100md.com 0
1.4
实验组Ⅱ
5
1
29.7
实验组Ⅲ
0
0
9
2.3 临床标本检测 218份NGU患者的临床标本进行CT的分离培养，检查CT包涵体用碘染色和CT荧光单克隆抗体的结果见表3。表3 不同细胞培养液分离培养CT结果 组别
例数
, 百拇医药
碘染色
荧光染色
阳
性
数
阳
性
率
(%)
P
阳
性
数
阳
, 百拇医药
性
率
(%)
P
放线菌酮组
(μg.ml-1)
218
63
28.9
63
28.9
>0.05
>0.05
, 百拇医药
vit C组
(5μg.ml-1)
218
65
29.8
65
29.8
3 讨 论
沙眼衣原体(CT)是引起NGU的病原体之一，主要通过性行为传播。国外学者指出，CT是性病中发病率较高的病原体，性传播的CT感染是淋病发病率的2倍，20%的男性和40%的女性感染淋病的同时也感染了CT，50%的NGU是CT引起的[2]。本实验506份临床标本经细胞培养法检测荧光单克隆抗体鉴定阳性151份，阳性率29.8%。由此可见，CT为NGU和前列腺炎的病原体之一。妇女感染CT后常患有输卵管炎，能造成宫外孕和不孕症，婴儿通过感染的产道，易得衣原体肺炎和结膜炎。男性附睾炎中至少2/3由CT引起，可造成不育症。不少衣原体感染的妇女并无症状，易被漏检，造成流行病学上的严重问题[5]。而寻找一种可靠的、经济的检验CT感染方法尤为重要。
, 百拇医药
细胞培养法是检测CT感染的金标准，传统方法是在培养液中加入放线菌酮，以提高检出阳性率。放线菌酮是一种抗代谢药物，可抑制真核细胞代谢，而不抑制原核细胞的生长繁殖，从而有利于CT在宿主细胞内增殖。无放线菌酮及VitC的细胞培养液培养CT的包涵体形成率只有9%(表2)，而加入VitC(5μg.ml-1)组，CT包涵体的形成率为29.5%，两者比较，VitC提高CT包涵体形成达3.27倍。VitC是一种有效的还原剂，它可维持细菌中巯基酶的活性，对于原核细菌，VitC被认为是影响外膜通透性的物质[4]。Shake Wang认为，VitC亦是CT所需的一种营养物质，含有vitC的培养基，可促进CT在细胞内的分裂和增殖[5]。为探讨vitC对CT在McCoy细胞中的生长影响，本研究将vitC加入细胞培养液中，使其浓度为2，5，12.5和125μg.ml-1(分别代表血清中不足，正常，过量和超量的vitC浓度)，McCoy细胞在含不同浓度的vitC培养液中孵育48～72h后，倒置显微镜下观察，细胞生长速度正常，碘染色镜检，形态学上未发现异常改变。临床标本检测结果CT包涵体形成率在上述浓度分别为25.6%，29.5%，29.4%，1.4%。前三种结果与对照组比较差异无显著性(P>0.05)，说明前三种浓度提高CT包涵体形成率的效果与对照组相同。vitC提高CT感染率依赖于其浓度，当vitC为超过量浓度(125μg.ml-1)时，CT包涵体形成率只有1.4%，比实验组Ⅲ包涵体形成率还低，说明vitC浓度过高，有抑制包涵体形成的作用，其原因有待于进一步研究。
, http://www.100md.com
实验组Ⅱ的CT包涵体形成率与对照组比较无明显差异(P>0.05)，说明放线菌酮与vitC合用无协同增强作用。在既无vitC又无放线菌酮的情况下，CT包涵体形成率只有9%，放线菌酮或vitC对促进CT包涵体的形成是有效的。本实验将218份临床标本分别用含放线菌酮及vitC(5μg.ml-1)的培养基进行分离培养，经碘染色及CT荧光单克隆抗体鉴定，阳性率分别为28.9%和29.8%，两者差异无显著性。结果提示用来源较易且价格便宜的vitC可替代放线菌酮用于细胞培养，检测临床CT感染标本，检出率不受影响。
作者：徐平 女 45岁 副教授 ①湖南省卫生厅资助课题(编号95-9)
参考文献
[1]Speight TM, Holford NHG, Avery S. Drug Treatment. 4ed. New Zeland: Adis Precs.Auckland, 1997:1545-1575
, http://www.100md.com
[2]Schachter J, Grossman M. Chlamydial infections. Ann Rev Med, 1981,32:45-58
[3]Mahony J, Castriciano S, Sellors Jone, et al. Diagnosis of chlamydiatrachomatis genital infections by cell culture and two Enzyme immunoassys detecting different Chlamydial. Antugens. J Clin Microbiol, 1989,27(9):1934-1938
[4]杨藻宸主编.医用药理学，北京：人民卫生出版社，1982：967-968
[5]Sha-ke Wang, Dorothy L, Patton, et al. Effects of Ascorbic acid on chlamydia trachomatis infection and on erythyromycin treatment in primary cultures of human amniotic cells. J Clin Microbiology, 1992,30(10):2551-2554
, 百拇医药
[6]Witkin SS, William J, Ledger M, et al. Antibodies to chlamydia trachomatis in sera of women with recurrent spontaneous abortions. Am J Obstet Gynecol, 1992,167(1):135-139
[7]Toye B, Laferriere C, Claman P, et al. Association between antibody to the chlamydial heat-shock protein and tubal infertility.J Infect Dis, 1993,168:1236-1240
1998-11-13 收稿, 百拇医药
单位：余 平 韦超凡 扈凤平(免疫学教研室 长沙 410078)；龚道科 石歆莹(临床微生物学教研室 长沙 410078)
关键词：沙眼衣原体；维生素C；细胞培养
湖南医科大学学报990104 提要 采用细胞培养法和免疫荧光法，对288份临床标本进行沙眼衣原体(CT)的分离鉴定，并观察维生素C(vitC)对阳性标本中CT包涵体形成的影响。结果显示CT在vitC 5μg.ml-1组中包涵体形成率为29.5%，与含放线菌酮的对照组比较差异无显著性(P>0.05)。提示vitC是CT所需要的一种营养物质，可促进CT在细胞内的增殖；并可替代放线菌酮用于McCoy细胞培养检测CT感染的临床标本。
中国图书分类号 R374.1
, 百拇医药
Effects and Applications of Ascorbic Acid
on the Proliferation of Chlamydia trachomatis
Yu Ping Wei Chaofan Hu Fengping
(Department of Immunology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
Gong Daoke Shi Xingying
(Department of Clinic Microbiology and Immunology, Hunan Medical University, Changsha 410078)
, 百拇医药
Two hundred and eighty-eight samples of patients with nongonococcal urethritis (NGU) and prostatitis were detected by cell culture and immunofluorescence assay for Chlamydia trachomatis (CT) and the effects of ascorbic acid(vitC) on the formation rate of inclusion of CT in positive samples were also studied. The results showed that the formation rate of inclusion of CT was 29.5% when the concentration of vitC was 5μg.ml-1. The difference between test group and control group which contained cycloheximide in the media was insignificant (P>0.05). The results suggested that vitC was a kind of nutrient needed for CT. The proliferation of CT in the cell can be promoted by vitC. We can replace cycloheximide by vitC in McCoy cell culture to detect clinic samples with CT.
, 百拇医药
Key words Chlamydia trachomatis; vitC; cell culture
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, CT)是非淋菌性尿道炎(nongonococcal urethritis, NGU)的主要病原体，约40%～50% NGU病例由其引起，其中50%～70%的患者临床上只有轻微的不适或常无症状，因而易被人们忽视[1]。衣原体性宫颈炎如不治疗，30%～40%患者将发展为输卵管炎、盆腔炎、宫外孕及输卵管性不孕症等远期后遗症[2]。由此，对CT的分离、培养及早期诊断就显得非常重要。CT分离培养，传统的方法是在培养液中加入放线菌酮；而在培养液中加入vitC促进CT生长的研究国内未见报道。本文应用对CT高度敏感的McCoy细胞，在含不同浓度的vitC培养液中观察CT包涵体形成的情况。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料 (1)标本来源 1995年7月～1997年10月在长沙市级医院、湖南医科大学皮肤性病专科门诊就诊，具有临床病症3个月以上的NGU和前列腺炎患者506例，年龄20～67岁，其中男性314例，女性192例。(2)试剂 ①CT传送液为RPMI-1640加万古霉素40μg.ml-1、庆大霉素300μg.ml-1、二性霉素B 10μg.ml-1及1%的的小牛血清。②营养液为RPMI-1640培养液加万古霉素4μg.ml-1、庆大霉素50μg.ml-1、二性霉素B 5μg.ml-1及7.5%小牛血清。③维生素C注射液0.25g.ml-1支，南京第三制药厂。④放线菌酮，Sigma公司。⑤衣原体荧光单克隆抗体诊断试剂盒，中山医科大学免疫室提供。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 标本采集及保存 女性用无菌棉拭子插入宫颈1～2cm，缓慢转动一圈取出，直接置入CT传送液；男性用无菌棉拭子插入尿道1.5～3cm，取尿道分泌物，直接置入CT传送液，或进行前列腺按摩，将前列腺液滴入CT传送液中，置4℃冰箱保存，24h内进行细胞培养。或将传送液置-70℃保存。
1.2.2 制备单层McCoy细胞瓶[3] McCoy细胞在组织培养瓶中生成致密单层。经0.25%胰酶消化后，加入细胞生长液配成约含1×105细胞/ml的细胞悬液，吸取1ml分装于细胞培养小瓶中，瓶底预先置一块12mm×12mm的盖玻片，在5% CO2 37℃二氧化碳孵育箱中孵育24～48h，使细胞在盖玻片上形成单层细胞。
1.2.3 实验分组及标本筛选 细胞培养液以含1μg.ml-1放线菌酮为对照组；含vitC浓度分别为2，5，12.5和125μg.ml-1为实验组Ⅰ；含放线菌酮(1μg.ml-1)+vitC(5μg.ml-1)为实验组Ⅱ；未加放线菌酮和VitC的细胞培养液为实验组Ⅲ。288份临床标本未经传统的细胞培养法培养后，用碘染色和荧光单克隆抗体鉴定CT。将86份阳性标本和20份阴性标本进行实验。
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1.2.4 接种标本 经鉴定为阳性和阴性的标本，旋涡振荡20min，取上清，接种至各试验瓶中，每瓶接种100μl，每种浓度各接种2瓶。以3000r.min-1离心1h后，置37℃温箱孵育4h，吸去上清液，每瓶再分别加入与接种时相同浓度的含vitC或放线菌酮的培养液，置5% CO2 37℃二氧化碳孵育中孵育48～72h。
1.2.5 制片染色计数 孵育后，取出盖玻片，无水甲醇固定10min，一片作碘染色，在显微镜下观察McCoy细胞中是否有包涵体形成，并计数500个细胞中有多少含包涵体的细胞(包涵体形成百分率)；另一片作荧光单克隆抗体检测(按试剂盒说明书的要求操作和判断结果)，在荧光显微镜下观察细胞形态完整，胞浆中有苹果绿荧光者判为阳性。
1.3 统计学处理 所得数据用χ2检验进行统计分析。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 实验标本筛选结果 288份临床标本筛选结果见表1。
表1 288份临床标本CT感染检测结果 标本
性别
标本数
检出感染率(%)
宫颈分泌物
女
?92
28/92(30.4)
尿道口拭子
男
?94
, 百拇医药
?28/94(29.8)
前列腺液
男
102
30/102(29.4)
合计
288
86/288(29.9)
2.2 VitC对CT增殖的作用 20份阴性标本在各实验组CT检测结果均为阴性。86份阳性标本在对照组及各实验组包涵体形成率见附图和表2。
附图 不同浓度的vitC对CT包涵体形成的影响
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Fig. The effect of vitC on the formation rate of CT inclusion
表2 不同细胞培养液对CT包涵体形成的影响 组别
vitC
(μg.ml-1)
放线菌酮
(μg.ml-1)
包涵体形成率
(%)
对照组
0
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1
29.2
实验组Ⅰ
2
0
25.6
5
0
29.5
12.5
0
29.4
125
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1.4
实验组Ⅱ
5
1
29.7
实验组Ⅲ
0
0
9
2.3 临床标本检测 218份NGU患者的临床标本进行CT的分离培养，检查CT包涵体用碘染色和CT荧光单克隆抗体的结果见表3。表3 不同细胞培养液分离培养CT结果 组别
例数
, 百拇医药
碘染色
荧光染色
阳
性
数
阳
性
率
(%)
P
阳
性
数
阳
, 百拇医药
性
率
(%)
P
放线菌酮组
(μg.ml-1)
218
63
28.9
63
28.9
>0.05
>0.05
, 百拇医药
vit C组
(5μg.ml-1)
218
65
29.8
65
29.8
3 讨 论
沙眼衣原体(CT)是引起NGU的病原体之一，主要通过性行为传播。国外学者指出，CT是性病中发病率较高的病原体，性传播的CT感染是淋病发病率的2倍，20%的男性和40%的女性感染淋病的同时也感染了CT，50%的NGU是CT引起的[2]。本实验506份临床标本经细胞培养法检测荧光单克隆抗体鉴定阳性151份，阳性率29.8%。由此可见，CT为NGU和前列腺炎的病原体之一。妇女感染CT后常患有输卵管炎，能造成宫外孕和不孕症，婴儿通过感染的产道，易得衣原体肺炎和结膜炎。男性附睾炎中至少2/3由CT引起，可造成不育症。不少衣原体感染的妇女并无症状，易被漏检，造成流行病学上的严重问题[5]。而寻找一种可靠的、经济的检验CT感染方法尤为重要。
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细胞培养法是检测CT感染的金标准，传统方法是在培养液中加入放线菌酮，以提高检出阳性率。放线菌酮是一种抗代谢药物，可抑制真核细胞代谢，而不抑制原核细胞的生长繁殖，从而有利于CT在宿主细胞内增殖。无放线菌酮及VitC的细胞培养液培养CT的包涵体形成率只有9%(表2)，而加入VitC(5μg.ml-1)组，CT包涵体的形成率为29.5%，两者比较，VitC提高CT包涵体形成达3.27倍。VitC是一种有效的还原剂，它可维持细菌中巯基酶的活性，对于原核细菌，VitC被认为是影响外膜通透性的物质[4]。Shake Wang认为，VitC亦是CT所需的一种营养物质，含有vitC的培养基，可促进CT在细胞内的分裂和增殖[5]。为探讨vitC对CT在McCoy细胞中的生长影响，本研究将vitC加入细胞培养液中，使其浓度为2，5，12.5和125μg.ml-1(分别代表血清中不足，正常，过量和超量的vitC浓度)，McCoy细胞在含不同浓度的vitC培养液中孵育48～72h后，倒置显微镜下观察，细胞生长速度正常，碘染色镜检，形态学上未发现异常改变。临床标本检测结果CT包涵体形成率在上述浓度分别为25.6%，29.5%，29.4%，1.4%。前三种结果与对照组比较差异无显著性(P>0.05)，说明前三种浓度提高CT包涵体形成率的效果与对照组相同。vitC提高CT感染率依赖于其浓度，当vitC为超过量浓度(125μg.ml-1)时，CT包涵体形成率只有1.4%，比实验组Ⅲ包涵体形成率还低，说明vitC浓度过高，有抑制包涵体形成的作用，其原因有待于进一步研究。
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实验组Ⅱ的CT包涵体形成率与对照组比较无明显差异(P>0.05)，说明放线菌酮与vitC合用无协同增强作用。在既无vitC又无放线菌酮的情况下，CT包涵体形成率只有9%，放线菌酮或vitC对促进CT包涵体的形成是有效的。本实验将218份临床标本分别用含放线菌酮及vitC(5μg.ml-1)的培养基进行分离培养，经碘染色及CT荧光单克隆抗体鉴定，阳性率分别为28.9%和29.8%，两者差异无显著性。结果提示用来源较易且价格便宜的vitC可替代放线菌酮用于细胞培养，检测临床CT感染标本，检出率不受影响。
作者：徐平 女 45岁 副教授 ①湖南省卫生厅资助课题(编号95-9)
参考文献
[1]Speight TM, Holford NHG, Avery S. Drug Treatment. 4ed. New Zeland: Adis Precs.Auckland, 1997:1545-1575
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[2]Schachter J, Grossman M. Chlamydial infections. Ann Rev Med, 1981,32:45-58
[3]Mahony J, Castriciano S, Sellors Jone, et al. Diagnosis of chlamydiatrachomatis genital infections by cell culture and two Enzyme immunoassys detecting different Chlamydial. Antugens. J Clin Microbiol, 1989,27(9):1934-1938
[4]杨藻宸主编.医用药理学，北京：人民卫生出版社，1982：967-968
[5]Sha-ke Wang, Dorothy L, Patton, et al. Effects of Ascorbic acid on chlamydia trachomatis infection and on erythyromycin treatment in primary cultures of human amniotic cells. J Clin Microbiology, 1992,30(10):2551-2554
, 百拇医药
[6]Witkin SS, William J, Ledger M, et al. Antibodies to chlamydia trachomatis in sera of women with recurrent spontaneous abortions. Am J Obstet Gynecol, 1992,167(1):135-139
[7]Toye B, Laferriere C, Claman P, et al. Association between antibody to the chlamydial heat-shock protein and tubal infertility.J Infect Dis, 1993,168:1236-1240
1998-11-13 收稿, 百拇医药