三种EB病毒潜伏膜蛋白基因转基因载体的构建①
作者：肖志强 关勇军 段朝军 陈主初 姚开泰
单位：肖志强 关勇军 段朝军 陈主初 姚开泰(肿瘤研究所 长沙 410078)
关键词：EB病毒；潜伏膜蛋白；转基因载体
湖南医科大学学报990101 提要 为制备EB病毒潜伏膜蛋白(LMP)基因转基因小鼠，探讨LMP的体内致瘤作用，本文构建了三种不同的LMP基因转基因载体，即pBR322-MT-LMP，pMci3-LMP和pMV-LMP-c-myc；并分别讨论了上述三种载体的特征及其应用前景。
中国图书分类号 R373.11
Construction of three transgenic vectors carrying the latent
, http://www.100md.com
membrane protein gene of Epstein-Barr virus
Xiao Zhiqiang Guan Yongjun Duan Chaojun Chen Zhuchu Yao Kaitai
(Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha 410078)
In order to produce transgenic mice carrying the latent membrane protein(LMP) gene of Epstein-Barr virus(EBV) and to study the oncogenic role of LMP gene in vivo, three different transgenic vectors carrying the LMP gene were constructed. In pBR322-MT-LMP vector, the promoter of LMP gene is the regulation region of mouse metallothionein-Ⅰ gene. In pMci3-LMP shuttle vector, the promoter of LMP gene is the replication origin(oriP) of EBV. In pMV-LMP-c-myc retroviral vector, the long terminal repeat(LTR) of mouse sarcomavirus serves as the promoter of LMP gene. The characterization and usefulness of these three transgenic vectors are also discussed.
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Key words Epstein-Barr virus; latent membrane protein; transgene vector
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)是一种与人Burkitt's淋巴瘤和鼻咽癌等密切相关的DNA肿瘤病毒。大量研究表明，EBV的瘤基因为潜伏膜蛋白(Latent membrane protein, LMP)基因，其编码产物LMP在体外可引起多种细胞转化甚至致瘤，但对LMP在体内的致瘤作用目前仍知之甚少[1～3]。制备LMP基因转基因小鼠，对于进一步阐明LMP的体内作用及其与肿瘤发病的关系具有重要意义。制备转基因小鼠的关键是转基因能够表达，最好是能组织特异性地表达，而基因的表达特征主要由基因的调控序列(启动子/增强子)所决定[4，5]。因此，选择合适的基因调控序列构建转基因载体是制备转基因小鼠首先要解决的问题。本文用不同的基因调控序列与EBV LMP的结构基因相连，分别构建了三种不同的LMP基因转基因载体，为制备LMP基因转基因小鼠奠定了坚实的基础。
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1 材料与方法
1.1 材料 pCMVα-LMP及pMV-c-myc质粒分别从英国和美国引进；pBR322-MT及pMci3质粒分别由北京大学生物系和复旦大学遗传所提供；E.coli受体菌株HB101为本所保存。分子生物学试剂如限制性核酸内切酶、小牛肠碱性磷酸酶(CIP)和T4 DNA连接酶购自GIBCO公司。其它常用试剂为国产分析纯。
1.2 方法 质粒DNA的提取、酶切、电泳，酶切片段的回收、连接、转化及转化子的酶切鉴定均按文献[6]的方法进行。
2 结 果
2.1 pBR322-MT-LMP载体的构建 pBR322-MT-LMP载体的构建过程如图1。即用BamHⅠ酶切9.14kb pCMVα-LMP质粒，低熔点琼脂糖凝胶电泳分离、回收3.2kb含LMP基因的BamHⅠ酶切片段；并用Bge1Ⅱ和BamHⅠ双酶切8.16kb pBR322-MT质粒，去掉鼠金属硫蛋白(Metallothionein, MT)结构基因，同时回收5.8kb pBR322-MT载体片段(该片段含鼠MT基因调控区和pBR322质粒部分)。载体片段经CIP处理后，通过T4 DNA连接酶与3.2kb含LMP基因片段相连。连接物转化E.coliHB101获得重组体转化子，小量扩增后快速抽提质粒DNA并酶切鉴定。结果如下：EcoRI酶切证实重组体含2.4kb LMP基因片段(图2)；SalⅠ酶切有两种构型，LMP基因正方向插入酶切后有1.0kb和8.0kb的带，而反方向插入有2.7kb和6.3kb的带(图3)。说明已获得两种LMP基因分别以正、反方向与鼠MT基因调控区相连的大小约为9.0kb的pBR322-MT-LMP载体。
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图1 pBR322-MT-LMP载体构建图 图2 EcoRI酶切pBR322-MT-LMP载体 1.pCMVα-LMP质粒，EcoRI酶切有2.4kb LMP基因片段 2.λDNA/Hind Ⅲ marker 3.pBR322-MT-LMP载体，EcoRI酶切有2.4kb LMP基因片段 图3
SalⅠ酶切pBR322-MT-LMP载体 1.pBR322-MT-LMP载体，未酶切 2.pBR322-MT-LMP载体，SalⅠ酶切为1.0kb和8.0kb两条带，示LMP基因正方向与MT基因调控区相连 3.ΦX 174/Hae Ⅲ marker
Fig.1 Construction of pBR322-MT-LMP vector Fig.2 EcoRI digestion of pBR322-MT-LMP vector 1.pCMVα-LMP plasmid, EcoRI digestion displays 2.4kb LMP gene fragment. 2.λDNA/HindⅢ marker 3.pBR322-MT-LMP vector, EcoRI digestion displays the insertion of 2.4kb LMP gene fragment. Fig.3 SalⅠ digestion of pBR322-MT-LMP vector 1.uncut pBR322-MT-LMP vector 2.pBR322-MT-LMP vector, SalⅠ digestion displays two bands of 1.0 and 8.0kb, indicating LMP gene positively links to the regulation region of MT gene. 3. ΦX 174/HaeⅢ marker
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2.2 pMci3-LMP载体的构建 pMci3-LMP载体的构建过程如图4所示。简言之，分别用BamHⅠ酶切9.14kb pCMVα-LMP质粒及11.4kb pMci3质粒，琼脂糖凝胶电泳分离，电洗脱法回收3.2kb含LMP基因片段和9.1kb pMci3载体片段。其中载体片段含EBV复制起始区(oriP)，EB病毒核抗原-1(EBNA1)基因，潮霉素阻抗基因(Hygr)及pBR322质粒部分。经CIP处理(防止载体自身环化)后，两片段如前所述进行连接和转化，所得的重组体转化子酶切鉴定的结果为：BamHI酶切证实重组体含3.2kb LMP基因片段(图5)；SalⅠ酶切有两种构型，LMP基因正方向插入 切得2.4kb和9.9kb的带，而反方向插入切得1.0kb和11.3kb的 带(图6，7)。说明获得了两种LMP基因正或反方向与EBV oriP相连的大小约12.3kb的pMci3-LMP载体。
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图4 pMci3-LMP载体的构建 图5 BamHI酶切pMci3-LMP载体 1.pMci3-LMP载体，BamHI酶切有3.2kb LMP基因片段 2.λDNA/HindⅢ marker 3.pMci3质粒，BamHI酶切有2.3kb lacⅠ基因片段 图6 SalⅠ酶切pMci3-LMP载体 1.λDNA/HindⅢ marker 2,3,4. pMci3-LMP载体，SalⅠ酶切有2.4kb和9.9kb两条带，示LMP基因正方向与EBV oriP相连 图7 SalⅠ酶切pMci3-LMP载体 1.ΦX174/HaeⅢ marker 2,3. pMci3-LMP载体，SalⅠ酶切为1.0kb和11.3kb两条带，示LMP基因反方向与EBV oriP相连
Fig.4 Construction of pMci3-LMP vector Fig.5 BamHI digestion of pMci3-LMP vector 1.pMci3-LMP vector, BamHI digestion displays 3.2kb LMP gene fragment 2.λDNA Hind/Ⅲ marker 3.pMci3 plasmid, BamHI digestion displays 2.3kb lacⅠ gene fragment Fig.6 SalⅠ digestion of pMci3-LMP vector 1.λDNA/HindⅢ marker 2,3,4. pMci3-LMP vectors, SalⅠ digestion displays two bands of 2.4 and 9.9kb, indicating LMP gene positively links to EBV oriP. Fig.7 SalⅠ digestion of pMci3-LMP vector 1.ΦX174/HaeⅢ marker 2,3. pMci3-LMP vector, SalⅠ digestion displays two bands of 1.0 and 11.3kb, indicating LMP gene negatively links to EBV oriP.
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2.3 pMV-LMP-c-myc载体的构建 pMV-LMP-c-myc载体的构建过程如图8。首先用EcoRI酶切9.5kb pMV-c-myc质粒将其线性化，该质粒含人c-myc基因cDNA；然后用EcoRI酶切9.14kb pCMVα-LMP质粒，琼脂糖凝胶电泳分离，电洗脱法回收2.4kb含LMP结构基因的EcoRⅠ酶切片段。线性化的pMV-c-myc同样经CIP处理后，与2.4kb含LMP基因的EcoRI片段连接，连接物转化E.coli HB101，获得的重组体转化子用EcoRI和Bg1Ⅱ酶切鉴定。其中，EcoRI酶切发现有2.4kb含LMP基因的插入片段(图9)；Bg1Ⅱ酶切有两种构型，LMP基因正方向插入酶切得4.3kb和7.6kb的带，而反方向插入酶切得2.9kb和9.0kb的带(图10)。说明已获得正、反方向插入的两种大小约11.9kb的pMV-LMP-c-myc载体。
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图8 pMV-LMP-c-myc载体的构建 图9 EcoRⅠ酶切pMV-LMP-c-myc载体 1.λDNA HindⅢ marker 2.pMV-c-myc质粒，EcoRI酶切将其线性化 3.pMV-LMP-c-myc载体，EcoRI酶切有2.4kb LMP基因插入片段 图10 Bg1Ⅱ酶切pMV-LMP-c-myc载体 1.λDNA HindⅢ marker 2.pMV-LMP-c-myc载体，Bg1Ⅱ酶切为4.3kb和7.6kb两条带，示LMP基因正方向与5′LTR相连 3，4.pMV-LMP-c-myc载体，Bg1Ⅱ酶切为2.9kb和9.0kb两条带，示LMP基因反方向与5′LTR相连
Fig.8 Construction of pMV-LMP-c-myc vector Fig.9 EcoRI digestion of pMV-LMP-c-myc vector 1.λDNA/HindⅢ marker 2.pMV-c-myc plasmid, EcoRI digestion displays only 9.5kb band 3.pMV-LMP-c-myc vector, EcoRI digestion displays the insertion of 2.4kb LMP gene fragment. Fig.10 Bg1Ⅱ digestion of pMV-LMP-c-myc vector 1.λDNA/HindⅢ marker 2.pMV-LMP-c-myc vector, Bg1Ⅱ digestion display two bands of 4.3 and 7.6kb, indicating LMP gene positively links to 5′LTR. 3,4.pMV-LMP-c-myc vector, Bg1Ⅱ digestion displays two bands of 2.9 and 9.0kb, indicating LMP gene negatively links to 5′LTR
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3 讨 论
为制备LMP基因转基因小鼠，本文构建了三种不同的携带LMP基因的转基因载体。首先是pBR322-MT-LMP。该载体以鼠MT基因调控区作为LMP基因的启动子，主要基于下列考虑：①MT基因调控区的启动子作用较强，在哺乳类动物体内大多数组织细胞尤其是内脏器官中均能指导结构基因的表达；②MT基因调控区受重金属镉和锌等的诱导，在它们的作用下转录增强[7，8]。预计用该载体制备的转基因小鼠，不仅体内有LMP基因的表达，而且LMP基因的表达水平还会受重金属的调控。另外早期流行病学调查显示，金属镍可能是鼻咽癌发病的因素之一，并且镍在元素周期表上紧邻重金属。因此，用该载体制备的转基因小鼠也为同时研究EB病毒与金属镍在鼻咽癌发病中的作用提供了很好的动物模型。
pMci3属于EBV载体。已知EBV载体具有如下特征：①在哺乳类细胞中一般以游离体形式存在，但在小鼠等啮齿类动物细胞中也可整合入宿主细胞基因组；②其携带的目的基因在哺乳类细胞中均有较高水平的表达[9]。在pMci3-LMP载体中，LMP基因的启动子为EBV复制起始区(oriP)。构建此载体的想法有二：一是已知EBV既嗜B淋巴细胞也亲上皮细胞，在上皮细胞中EBV能复制和表达病毒基因，EBV oriP及其反式作用因子EBNA1是维持EBV复制的主要成分。用pMci3-LMP载体制备转基因小鼠，在EBV oriP的指导下，LMP基因可在小鼠鼻咽上皮细胞表达。二是pMci3-LMP载体同时携带EBV EBNA1基因，具有一过性表达EBNA1的功能，而LMP和EBNA1又是在鼻咽癌组织中能检测到的仅有的两个EBV蛋白质。因此，利用该载体制备转基因小鼠可研究LMP和EBNA1共同致鼻咽癌的作用。
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pMV-LMP-c-myc为逆转录病毒载体[10]，目的基因(LMP和c-myc)的调控区为鼠肉瘤病毒的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。该载体具有下述特点：其一，它能高水平表达克隆的目的基因；其二，用该载体可制备携带LMP基因和c-myc基因的双转基因小鼠，便于研究LMP和c-myc基因致鼻咽癌的协同作用；其三，既可用显微注射法，又可用逆转录病毒载体感染法将目的基因导入小鼠胚胎，制备转基因小鼠。目前作者已将该载体导入至Ψ-2包装细胞，试图用重组逆转录病毒感染法制备转基因小鼠。
作者：肖志强 男35岁 副研究员 ①国家自然科学基金资助项目(编号39500169)This research was suppoted by a rant from Natioal Natura Science Foundation of China(No.39500169)
参考文献
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[1]Wang D, Leibowitz D, Kieff E. An EBV membrane protein expressed in immortalized lymphocytes transforms established rodent cells. Cell, 1985,43:831-840
[2]Dawson CW, Rickinson AB, Young LS. Epstein-Barr virus latent membrane protein inhibits human epithelial cell differentiation. Nature, 1990,344:777-780
[3]Fahraeus R, Rymo L, Johng S, et al. Morphological transformation of human keratinocytes expressing the LMP gene of Epstein-Barr virus. Nature, 1990,345:447-449
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[4]Palmiter RD. Germ-line transformation of mice. Annu Rev Genet, 1986,20:465-499
[5]Maniatis T, Goodbourn S, Fischer JA. Regulation of inducible and tissue-specific gene expression. Science, 1987,36:1237-1244
[6]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor, 1989.
[7]Hamer DH. Metallothioneins. Annu Rev Biochem, 1986,55:813-851
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[8]Durnam DM, Palmiter RD. Transcriptional regulation of the mouse metallothionein-Ⅰ gene by heavy metal. J Biol Chem, 1981,256:5712-5716
[9]Yates J, Warren D, Sugden B. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature, 1985,313:812-815
[10]Kirschmeier PT, Housey GM, Johnson MD, et al. Laboratory methods: construction and characterization of a retroviral vector demonstrating efficient expression of cloned cDNA sequence. DNA, 1988,7:219-225
1997-04-25 收稿, 百拇医药
单位：肖志强 关勇军 段朝军 陈主初 姚开泰(肿瘤研究所 长沙 410078)
关键词：EB病毒；潜伏膜蛋白；转基因载体
湖南医科大学学报990101 提要 为制备EB病毒潜伏膜蛋白(LMP)基因转基因小鼠，探讨LMP的体内致瘤作用，本文构建了三种不同的LMP基因转基因载体，即pBR322-MT-LMP，pMci3-LMP和pMV-LMP-c-myc；并分别讨论了上述三种载体的特征及其应用前景。
中国图书分类号 R373.11
Construction of three transgenic vectors carrying the latent
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membrane protein gene of Epstein-Barr virus
Xiao Zhiqiang Guan Yongjun Duan Chaojun Chen Zhuchu Yao Kaitai
(Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha 410078)
In order to produce transgenic mice carrying the latent membrane protein(LMP) gene of Epstein-Barr virus(EBV) and to study the oncogenic role of LMP gene in vivo, three different transgenic vectors carrying the LMP gene were constructed. In pBR322-MT-LMP vector, the promoter of LMP gene is the regulation region of mouse metallothionein-Ⅰ gene. In pMci3-LMP shuttle vector, the promoter of LMP gene is the replication origin(oriP) of EBV. In pMV-LMP-c-myc retroviral vector, the long terminal repeat(LTR) of mouse sarcomavirus serves as the promoter of LMP gene. The characterization and usefulness of these three transgenic vectors are also discussed.
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Key words Epstein-Barr virus; latent membrane protein; transgene vector
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)是一种与人Burkitt's淋巴瘤和鼻咽癌等密切相关的DNA肿瘤病毒。大量研究表明，EBV的瘤基因为潜伏膜蛋白(Latent membrane protein, LMP)基因，其编码产物LMP在体外可引起多种细胞转化甚至致瘤，但对LMP在体内的致瘤作用目前仍知之甚少[1～3]。制备LMP基因转基因小鼠，对于进一步阐明LMP的体内作用及其与肿瘤发病的关系具有重要意义。制备转基因小鼠的关键是转基因能够表达，最好是能组织特异性地表达，而基因的表达特征主要由基因的调控序列(启动子/增强子)所决定[4，5]。因此，选择合适的基因调控序列构建转基因载体是制备转基因小鼠首先要解决的问题。本文用不同的基因调控序列与EBV LMP的结构基因相连，分别构建了三种不同的LMP基因转基因载体，为制备LMP基因转基因小鼠奠定了坚实的基础。
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1 材料与方法
1.1 材料 pCMVα-LMP及pMV-c-myc质粒分别从英国和美国引进；pBR322-MT及pMci3质粒分别由北京大学生物系和复旦大学遗传所提供；E.coli受体菌株HB101为本所保存。分子生物学试剂如限制性核酸内切酶、小牛肠碱性磷酸酶(CIP)和T4 DNA连接酶购自GIBCO公司。其它常用试剂为国产分析纯。
1.2 方法 质粒DNA的提取、酶切、电泳，酶切片段的回收、连接、转化及转化子的酶切鉴定均按文献[6]的方法进行。
2 结 果
2.1 pBR322-MT-LMP载体的构建 pBR322-MT-LMP载体的构建过程如图1。即用BamHⅠ酶切9.14kb pCMVα-LMP质粒，低熔点琼脂糖凝胶电泳分离、回收3.2kb含LMP基因的BamHⅠ酶切片段；并用Bge1Ⅱ和BamHⅠ双酶切8.16kb pBR322-MT质粒，去掉鼠金属硫蛋白(Metallothionein, MT)结构基因，同时回收5.8kb pBR322-MT载体片段(该片段含鼠MT基因调控区和pBR322质粒部分)。载体片段经CIP处理后，通过T4 DNA连接酶与3.2kb含LMP基因片段相连。连接物转化E.coliHB101获得重组体转化子，小量扩增后快速抽提质粒DNA并酶切鉴定。结果如下：EcoRI酶切证实重组体含2.4kb LMP基因片段(图2)；SalⅠ酶切有两种构型，LMP基因正方向插入酶切后有1.0kb和8.0kb的带，而反方向插入有2.7kb和6.3kb的带(图3)。说明已获得两种LMP基因分别以正、反方向与鼠MT基因调控区相连的大小约为9.0kb的pBR322-MT-LMP载体。
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图1 pBR322-MT-LMP载体构建图 图2 EcoRI酶切pBR322-MT-LMP载体 1.pCMVα-LMP质粒，EcoRI酶切有2.4kb LMP基因片段 2.λDNA/Hind Ⅲ marker 3.pBR322-MT-LMP载体，EcoRI酶切有2.4kb LMP基因片段 图3
SalⅠ酶切pBR322-MT-LMP载体 1.pBR322-MT-LMP载体，未酶切 2.pBR322-MT-LMP载体，SalⅠ酶切为1.0kb和8.0kb两条带，示LMP基因正方向与MT基因调控区相连 3.ΦX 174/Hae Ⅲ marker
Fig.1 Construction of pBR322-MT-LMP vector Fig.2 EcoRI digestion of pBR322-MT-LMP vector 1.pCMVα-LMP plasmid, EcoRI digestion displays 2.4kb LMP gene fragment. 2.λDNA/HindⅢ marker 3.pBR322-MT-LMP vector, EcoRI digestion displays the insertion of 2.4kb LMP gene fragment. Fig.3 SalⅠ digestion of pBR322-MT-LMP vector 1.uncut pBR322-MT-LMP vector 2.pBR322-MT-LMP vector, SalⅠ digestion displays two bands of 1.0 and 8.0kb, indicating LMP gene positively links to the regulation region of MT gene. 3. ΦX 174/HaeⅢ marker
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2.2 pMci3-LMP载体的构建 pMci3-LMP载体的构建过程如图4所示。简言之，分别用BamHⅠ酶切9.14kb pCMVα-LMP质粒及11.4kb pMci3质粒，琼脂糖凝胶电泳分离，电洗脱法回收3.2kb含LMP基因片段和9.1kb pMci3载体片段。其中载体片段含EBV复制起始区(oriP)，EB病毒核抗原-1(EBNA1)基因，潮霉素阻抗基因(Hygr)及pBR322质粒部分。经CIP处理(防止载体自身环化)后，两片段如前所述进行连接和转化，所得的重组体转化子酶切鉴定的结果为：BamHI酶切证实重组体含3.2kb LMP基因片段(图5)；SalⅠ酶切有两种构型，LMP基因正方向插入 切得2.4kb和9.9kb的带，而反方向插入切得1.0kb和11.3kb的 带(图6，7)。说明获得了两种LMP基因正或反方向与EBV oriP相连的大小约12.3kb的pMci3-LMP载体。
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图4 pMci3-LMP载体的构建 图5 BamHI酶切pMci3-LMP载体 1.pMci3-LMP载体，BamHI酶切有3.2kb LMP基因片段 2.λDNA/HindⅢ marker 3.pMci3质粒，BamHI酶切有2.3kb lacⅠ基因片段 图6 SalⅠ酶切pMci3-LMP载体 1.λDNA/HindⅢ marker 2,3,4. pMci3-LMP载体，SalⅠ酶切有2.4kb和9.9kb两条带，示LMP基因正方向与EBV oriP相连 图7 SalⅠ酶切pMci3-LMP载体 1.ΦX174/HaeⅢ marker 2,3. pMci3-LMP载体，SalⅠ酶切为1.0kb和11.3kb两条带，示LMP基因反方向与EBV oriP相连
Fig.4 Construction of pMci3-LMP vector Fig.5 BamHI digestion of pMci3-LMP vector 1.pMci3-LMP vector, BamHI digestion displays 3.2kb LMP gene fragment 2.λDNA Hind/Ⅲ marker 3.pMci3 plasmid, BamHI digestion displays 2.3kb lacⅠ gene fragment Fig.6 SalⅠ digestion of pMci3-LMP vector 1.λDNA/HindⅢ marker 2,3,4. pMci3-LMP vectors, SalⅠ digestion displays two bands of 2.4 and 9.9kb, indicating LMP gene positively links to EBV oriP. Fig.7 SalⅠ digestion of pMci3-LMP vector 1.ΦX174/HaeⅢ marker 2,3. pMci3-LMP vector, SalⅠ digestion displays two bands of 1.0 and 11.3kb, indicating LMP gene negatively links to EBV oriP.
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2.3 pMV-LMP-c-myc载体的构建 pMV-LMP-c-myc载体的构建过程如图8。首先用EcoRI酶切9.5kb pMV-c-myc质粒将其线性化，该质粒含人c-myc基因cDNA；然后用EcoRI酶切9.14kb pCMVα-LMP质粒，琼脂糖凝胶电泳分离，电洗脱法回收2.4kb含LMP结构基因的EcoRⅠ酶切片段。线性化的pMV-c-myc同样经CIP处理后，与2.4kb含LMP基因的EcoRI片段连接，连接物转化E.coli HB101，获得的重组体转化子用EcoRI和Bg1Ⅱ酶切鉴定。其中，EcoRI酶切发现有2.4kb含LMP基因的插入片段(图9)；Bg1Ⅱ酶切有两种构型，LMP基因正方向插入酶切得4.3kb和7.6kb的带，而反方向插入酶切得2.9kb和9.0kb的带(图10)。说明已获得正、反方向插入的两种大小约11.9kb的pMV-LMP-c-myc载体。
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图8 pMV-LMP-c-myc载体的构建 图9 EcoRⅠ酶切pMV-LMP-c-myc载体 1.λDNA HindⅢ marker 2.pMV-c-myc质粒，EcoRI酶切将其线性化 3.pMV-LMP-c-myc载体，EcoRI酶切有2.4kb LMP基因插入片段 图10 Bg1Ⅱ酶切pMV-LMP-c-myc载体 1.λDNA HindⅢ marker 2.pMV-LMP-c-myc载体，Bg1Ⅱ酶切为4.3kb和7.6kb两条带，示LMP基因正方向与5′LTR相连 3，4.pMV-LMP-c-myc载体，Bg1Ⅱ酶切为2.9kb和9.0kb两条带，示LMP基因反方向与5′LTR相连
Fig.8 Construction of pMV-LMP-c-myc vector Fig.9 EcoRI digestion of pMV-LMP-c-myc vector 1.λDNA/HindⅢ marker 2.pMV-c-myc plasmid, EcoRI digestion displays only 9.5kb band 3.pMV-LMP-c-myc vector, EcoRI digestion displays the insertion of 2.4kb LMP gene fragment. Fig.10 Bg1Ⅱ digestion of pMV-LMP-c-myc vector 1.λDNA/HindⅢ marker 2.pMV-LMP-c-myc vector, Bg1Ⅱ digestion display two bands of 4.3 and 7.6kb, indicating LMP gene positively links to 5′LTR. 3,4.pMV-LMP-c-myc vector, Bg1Ⅱ digestion displays two bands of 2.9 and 9.0kb, indicating LMP gene negatively links to 5′LTR
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3 讨 论
为制备LMP基因转基因小鼠，本文构建了三种不同的携带LMP基因的转基因载体。首先是pBR322-MT-LMP。该载体以鼠MT基因调控区作为LMP基因的启动子，主要基于下列考虑：①MT基因调控区的启动子作用较强，在哺乳类动物体内大多数组织细胞尤其是内脏器官中均能指导结构基因的表达；②MT基因调控区受重金属镉和锌等的诱导，在它们的作用下转录增强[7，8]。预计用该载体制备的转基因小鼠，不仅体内有LMP基因的表达，而且LMP基因的表达水平还会受重金属的调控。另外早期流行病学调查显示，金属镍可能是鼻咽癌发病的因素之一，并且镍在元素周期表上紧邻重金属。因此，用该载体制备的转基因小鼠也为同时研究EB病毒与金属镍在鼻咽癌发病中的作用提供了很好的动物模型。
pMci3属于EBV载体。已知EBV载体具有如下特征：①在哺乳类细胞中一般以游离体形式存在，但在小鼠等啮齿类动物细胞中也可整合入宿主细胞基因组；②其携带的目的基因在哺乳类细胞中均有较高水平的表达[9]。在pMci3-LMP载体中，LMP基因的启动子为EBV复制起始区(oriP)。构建此载体的想法有二：一是已知EBV既嗜B淋巴细胞也亲上皮细胞，在上皮细胞中EBV能复制和表达病毒基因，EBV oriP及其反式作用因子EBNA1是维持EBV复制的主要成分。用pMci3-LMP载体制备转基因小鼠，在EBV oriP的指导下，LMP基因可在小鼠鼻咽上皮细胞表达。二是pMci3-LMP载体同时携带EBV EBNA1基因，具有一过性表达EBNA1的功能，而LMP和EBNA1又是在鼻咽癌组织中能检测到的仅有的两个EBV蛋白质。因此，利用该载体制备转基因小鼠可研究LMP和EBNA1共同致鼻咽癌的作用。
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pMV-LMP-c-myc为逆转录病毒载体[10]，目的基因(LMP和c-myc)的调控区为鼠肉瘤病毒的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。该载体具有下述特点：其一，它能高水平表达克隆的目的基因；其二，用该载体可制备携带LMP基因和c-myc基因的双转基因小鼠，便于研究LMP和c-myc基因致鼻咽癌的协同作用；其三，既可用显微注射法，又可用逆转录病毒载体感染法将目的基因导入小鼠胚胎，制备转基因小鼠。目前作者已将该载体导入至Ψ-2包装细胞，试图用重组逆转录病毒感染法制备转基因小鼠。
作者：肖志强 男35岁 副研究员 ①国家自然科学基金资助项目(编号39500169)This research was suppoted by a rant from Natioal Natura Science Foundation of China(No.39500169)
参考文献
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1997-04-25 收稿, 百拇医药