去甲二氢愈创木酸对恶性胶质瘤细胞增殖和分化的影响
作者：郭德玉 陈意生 史景泉 卞修武 辛 榕
单位：第三军医大学基础医学部病理学教研室 重庆，400038
关键词：去甲二氢愈创木酸(NDGA)；胶质瘤；诱导分化
第三军医大学学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE1999年 第21卷 第1期 VOL 提 要：目的观察去甲二氢愈创木酸(NDGA)对人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞增殖和分化的影响。方法：细胞培养、免疫组化、光镜和电镜观察及流式细胞仪检测。结果：①在200 μmol/L浓度范围内，NDGA对SHG-44细胞有增殖抑制和诱导分化作用，且这种作用与浓度呈正相关；②在NDGA处理96 h内，NDGA对SHG-44细胞的增殖抑制作用以处理后24 h最明显；③NDGA处理后，SHG-44细胞增殖受阻于G1→S期。结论：NDGA对SHG-44细胞有明显的增殖抑制和诱导分化作用，且这种作用有周期特异性。
, 百拇医药
中图法分类号：R739.4
Effects of nordihydroguaiaretic acid on proliferation and differentiation of human malignant glioma cells
Guo Deyu, Chen Yisheng, Shi Jingquan, Bian Xiuwu, Xin Rong
(Department of Pathology, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To investigate the effects of nordihydroguaiaretic acid (NDGA) on proliferation and differentiation of human malignant glioma cell line SHG-44. Methods: Cell culture, immunohistochemistry, flow cytometry, light and electron microscopy were employed in this study. Results: ①NDGA with a concentration within 200 μmol/L inhibited the proliferation of SHG-44 cells and this effect was positively correlated to the concentration. ②The most conspicuous inhibition of the proliferation was found at the 24th h after treatment with 100 μmol/L NDGA for up to 96 h. ③Cell cycle revealed that the cell proliferation was blocked in the phase of G1 to S after treatment with NDGA. Conclusion: NDGA can inhibit proliferation and induce differentiation of human malignant glioma cells and this effect is cycle-specific.
, 百拇医药
Key words nordihydroguaiaretic acid; glioma; induced differentiation
去甲二氢愈创木酸(Nordihydroguaiaretic acid,NDGA)是从常青灌木Larrea divaricata中提取的一种天然成分，是脂氧化酶的强抑制剂，具有抗氧化作用，国外曾作为食物添加剂使用，以防止食物酸败。近年来发现NDGA具有抗肿瘤作用[1～3]，如抑制实验诱发的大鼠乳腺癌和大肠癌的发生，抑制糖皮质激素诱导的淋巴瘤细胞的增殖等。本研究旨在观察NDGA对人脑恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞增殖和分化的影响。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
人脑恶性胶质瘤细胞系SHG-44(第110代)引自苏州医学院附属二院脑肿瘤研究室。细胞用含10%小牛血清(杭州四季青生物材料研究所生产)的RPMI-1640培养基(Gibco)，另添加适量的HEPES、抗生素(100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)和3%谷氨酰胺(10 μl/ml)置37℃、5% CO2混合气体的孵箱中培养，细胞换液时间为1～2 d，传代3～5 d，传代前用0.25%胰酶消化。
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1.2 NDGA溶液配制
用蒸馏水先配制0.01 mol/L pH7.2的PBS液，用孔径0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，作为对照液。NDGA(Sigma)液用上述PBS液配制，浓度为5mmol/L,37℃水浴并调整pH值直至完全溶解为止(溶液呈浅棕黄色)，过滤除菌，备用。
1.3 光镜观察及免疫组化染色
生长旺盛的SHG-44细胞按105/ml密度接种于预先置有干净消毒盖玻片的6孔培养板中或直径为35 mm的培养皿中，5 h细胞贴壁后加入NDGA液，使其终浓度分别为10、50、100、150和200 μmol/L，药物作用后24 h和48 h取出盖玻片，用PBS洗涤两次，95%乙醇固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min，自然晾干，4℃保存。临用前用玻璃刀将盖玻片1分为9，常规HE和免疫组织化学染色(SP法)。一抗鼠抗人增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、胶质原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、波形蛋白Vimentin单抗购自中山生物技术有限公司，SP试剂盒购自ZYMED公司，抗体稀释度PCNA、GFAP、Vimentin为1∶25，DAB显色。
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1.4 电镜
经NDGA处理后的细胞PBS冲洗，0.25%胰酶消化，离心后收集细胞沉淀，2.5%戊二醛固定，常规电镜包埋、制样、观察。
1.5 细胞周期分析
细胞按上述密度接种于24孔培养板中，然后加入NDGA液，使NDGA终浓度分别为10、50、100、150和200 μmol/L，药物作用24 h后取样(各3孔)。另将上述细胞密度接种的24孔培养板分3组：A组接种时加NDGA液，使其终浓度为100 μmol/L，B组接种时加等体积、等pH的PBS液，C组接种时不加任何液体，于药物作用12、24、48、72和96 h后取样(各3孔)。方法为：用0.25%胰酶消化细胞，吹打使其分散成单个细胞，用PBS离心洗涤两次，调节每个样品细胞数为2×106/ml，用微量移液器通过350目尼龙网注入70%冷乙醇中，4℃固定。测定前，倒掉酒精，用PBS洗一遍后加入RNA酶，37℃温育30 min后，放入冰浴中终止消化。用碘化丙锭(PI)染色2 h。FACStarplus型流式细胞仪(BECTON DICKINSON公司)检测。每个样本随机测定104个细胞，并求出细胞增殖指数。计算方法为：增殖指数(%)=(S+G2/M)/(G1+S+G2/M)×100%。
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1.6 细胞计数
细胞按上述方法接种于24孔培养板中，经上述NDGA处理后取样本各3孔，用0.4%台盼蓝排除试验计数活细胞平均数(每孔重复计数3次取均值)，并求出细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=(对照组活细胞数-NDGA组活细胞数)-对照组活细胞数×100%。
1.7 统计学处理
采用本校数理统计教研室的统计程序，进行两样本均数比较的统计学处理。
2 结果
2.1 形态学观察
对照组瘤细胞大部分呈椭圆形或短梭形，胞体丰满，核分裂像多见，电镜下见核形状不规则，有较深的核沟，并见核内假包涵体，胞浆中细胞器较少，部分细胞见稀疏、短小的胶质细丝。NDGA处理组细胞经NDGA处理后，在倒置显微镜下观察可见细胞透亮性(折光性)下降，并见颗粒，但台盼蓝试验阴性。HE染色见细胞分裂像减少，细胞胞体呈短梭形，胞突细而长，电镜下见瘤细胞核异型性降低，核仁小，胞浆内出现较多的胶质细丝，细胞器较丰富，部分有退变。
, 百拇医药
2.2 免疫组织化学染色
PCNA阳性呈棕黄色，位于胞核。GFAP、Vimentin阳性呈棕黄色，位于胞浆。对照组瘤细胞大部分GFAP呈阴性，少数细胞呈弱阳性，见图1；几乎所有瘤细胞均呈Vimentin强阳性，PCNA阳性反应，标记指数(Labeling index,LI)为65%。NDGA处理24 h后瘤细胞GFAP反应较对照组增强，见图2，Vimentin反应减弱，PCNA的LI降低为40%。
图1 SHG-44细胞胞浆GFAP表达较弱 对照组24 h (S-P×200)
Fig 1 Weaker positive staining of GFAP in the SHG-44 cytoplasm control 24 h (S-P×200)
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图2 SHG-44细胞胞浆GFAP表达增强 NDGA组24 h (S-P×200)
Fig 2 Stronger positive staining of GFAP in the SHG-44 cytoplasm 24 h after NDGA treatment (S-P×200)
2.3 NDGA对SHG-44细胞生长的影响
2.3.1 NDGA影响SHG-44细胞生长的剂量效应从图3可看出，与对照组相比，10～200 μmol/L不同浓度的NDGA对SHG-44细胞数均有影响，且NDGA液浓度越高，这种影响越明显，即呈明显的剂量依赖性。当将NDGA处理后的细胞置于新鲜培养基中(不含NDGA)培养24 h，则细胞恢复原有的增殖分裂能力。不同浓度(10、50、100、150、200 μmol/L)的NDGA处理细胞24 h后，对细胞的生长抑制率分别为15.8%、21.1%、31.6%、36.8%和63.2%。
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2.3.2 NDGA影响SHG-44细胞生长的时间效应从图4可看出，与对照组相比，给NDGA后SHG-44细胞的生长明显受到抑制，24 h后细胞总数较对照组明显减少，且作用时间越长，细胞总数较对照组减少越明显。100 μmol/L的NDGA处理不同时间后对SHG-44细胞的生长抑制率24 h为31.6%，48 h为68.1%，72 h为75.0%，96 h为75.6%。
图3 NDGA影响SHG-44细胞生长的剂量效应
Fig 3 Dose effect of NDGA on the growth of SHG-44 cells
图4 NDGA影响SHG-44细胞生长的时间效应
, 百拇医药
Fig 4 Time effect of NDGA treatment on the
growth of SHG-44 cells
2.4 细胞周期分析
2.4.1 NDGA影响SHG-44细胞周期的剂量效应见表1，与对照组相比，10～200 μmol/L不同浓度NDGA对SHG-44细胞周期均有作用，使G1期细胞增多(由67.0%→83.1%)，S期和G2/M期细胞减少(分别由28.2%→13.6%、4.7%→3.0%)，细胞增殖指数降低(由32.9%→16.8%)，且NDGA液浓度越高，这种作用越明显，即有明显的剂量依赖性。
表1 不同浓度NDGA对SHG-44细胞周期及
增殖指数(PI)的影响(%)
, 百拇医药
Tab 1 Effects of different NDGA concentrations on the
cell cycle and PI of SHG-44 cells(%)
Concentration of NDGA(μmol/L)
Control
10
50
100
150
200
G1
, 百拇医药 67.0
74.3
73.2
77.2*
77.3*
83.1* *
S
28.2
20.2*
23.1*
19.8*
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19.5*
13.6* *
G2/M
4.7
5.6
3.8
3.0*
3.2*
3.2*
PI
32.9
25.8
, 百拇医药
26.9
22.8*
22.7*
16.8*
*:P<0.05, * *：P<0.01 vs control
2.4.2 NDGA影响SHG-44细胞周期的时间效应见表2，与对照组相比，100 μmol/L NDGA处理细胞后24～72 h，使SHG-44细胞周期中G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，细胞增殖指数降低，且这种作用程度与作用时间有关，以给NDGA后24 h最明显(G1期由68.0%→81.1%、S期由27.7%→17.2%、G2/M期由4.3%→1.7%，细胞增殖指数由32.0%→18.9%,P<0.01)。而给PBS后各时相点与对照组差异不显著(P>0.05)。
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表2 不同处理时间NDGA对SHG-44细胞周期的影响(%)
Tab 2 Effects of different durations of NDGA treatment on the cell cycle of SHG-44 cells(%)
12 h
24 h
48 h
72 h
96 h
Groups
G1
S
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G2/M
G1
S
G2/M
G1
S
G2/M
G1
S
G2/M
G1
S
G2/M
, http://www.100md.com NDGA
72.0
22.4
5.5
81.1* *
17.2* *
1.7* *
79.2
8.1*
2.7*
74.1*
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19.6
6.4*
80.2
18.2
1.5
PBS
76.3
19.8
3.9
67.0
28.6
4.4
73.8
, 百拇医药
15.3
10.9
65.1
22.0
12.9
72.4
22.7
4.9
Control
76.7
19.5
3.9
68.0
, 百拇医药
27.7
4.3
74.2
17.7
8.1
62.4
18.5
19.1
74.3
23.1
2.6
*:P<0.05, * *：P<0.01 vs control
, 百拇医药 3 讨论
肿瘤细胞增殖活性是目前肿瘤病理检验和研究中受到普遍关注的课题，它不仅决定肿瘤的发生、发展，而且在肿瘤对化疗、放疗的反应中有着重要意义[4]。以往有关NDGA的抗肿瘤作用，多集中于肿瘤的促发阶段，而对已形成的肿瘤的作用报道较少。本实验检测了SHG-44细胞生长情况、DNA含量(流式细胞仪检测)和PCNA标记指数(免疫组化)等多种反映细胞增殖活性的指标，观察NDGA对SHG-44细胞增殖的影响。结果发现，NDGA对SHG-44细胞有明显的增殖抑制作用，具体表现为NDGA处理后细胞增殖指数降低、细胞生长减慢、免疫组化显示细胞PCNA标记指数下降等，且这种作用有明显的剂量依赖性和时间依赖性，即在10～200 μmol/L浓度范围内，NDGA浓度越高，这种作用越明显，即呈剂量依赖性；在100 μmol/L NDGA处理SHG-44细胞96 h内，以处理24 h这种增殖抑制作用最明显。同时本实验结果还发现，当将NDGA处理后的细胞置于新鲜培养基中(不含NDGA)培养24 h，则细胞恢复原有的增殖分裂能力，提示NDGA对SHG-44细胞的这种抑制作用是可逆的，从另一侧面说明NDGA对细胞的相对无毒性。
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GFAP一直被视为星形细胞及其肿瘤的特异性标记物，在诊断及鉴别诊断上具有重要价值，我们既往的研究显示GFAP可与另一种中间丝蛋白Vimentin共同表达于人脑星形细胞肿瘤中，与肿瘤的分化程度密切相关，国外报道也是如此[5]。本实验结果发现，SHG-44细胞GFAP表达很弱或不表达，Vimentin强表达，当NDGA处理SHG-44细胞后，细胞GFAP表达明显增强，Vimentin表达明显减弱，且电镜下观察发现细胞胞浆中胶质细丝明显增多，这些均显示细胞向成熟星形细胞分化，提示NDGA有诱导SHG-44细胞分化成熟的作用。
不同的抗恶性肿瘤化疗药物对细胞增殖动力学的影响不同，因此根据药物对细胞周期的影响分成了周期特异性药物和周期非特异性药物两类。本实验研究结果表明，NDGA对SHG-44细胞周期有明显的影响，NDGA处理后，SHG-44细胞G1期细胞比例明显增多，S期和G2/M期细胞比例明显减少，使细胞增殖受阻于G1→S期，显示NDGA能够通过有效作用于细胞周期某一时相(G1→S期)，从而抑制胶质瘤细胞的生长和增殖。
, 百拇医药
综上所述，NDGA对人脑恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞有明显的增殖抑制和诱导分化作用，且这种增殖抑制作用具有周期特异性，但其作用机制尚有待进一步研究。
国家自然科学基金资助项目，NO.39670296
作者简介：郭德玉，男，31岁，讲师，博士
参考文献
[1] McCormick D L, Spicer A M. Nordihydroguaiaretic acid suppression of rat mammary carcinogenesis induced by N-methyl-N-nitrosourea. Cancer Lett,198
,(2):139
[2] Birkenfeld S, Zaltsmam Y A, Krispin M, et al. Antitumor effects of inhibitors of arachidonic acid cascade on experimentally induced intestinal tumors. Dis Colon Rectum,1987,30(1)：43
, 百拇医药
[3] Wilson D E, DiGianfilippo A, Orey F G, et al. Effect of nordihydroguaiaretic acid on culture rat and human glioma cell proliferation. J Neurosurg,1989,71(4):551
[4] Wilson G D， Saunders M I, Dische S, et al. Direct comparison of bromodeoxyuridine and Ki-67 labelling indices in human tumors. Cell Proli,1996,29(3):141
[5] Rutka J T, Murakami M, Dirs P B, et al. Role of glial filaments in cells and tumors of glial origin: a review. J Neurosurg,1997,87(3):420
收稿：1998-06-03；修回：1998-12-04, http://www.100md.com
单位：第三军医大学基础医学部病理学教研室 重庆，400038
关键词：去甲二氢愈创木酸(NDGA)；胶质瘤；诱导分化
第三军医大学学报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE1999年 第21卷 第1期 VOL 提 要：目的观察去甲二氢愈创木酸(NDGA)对人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞增殖和分化的影响。方法：细胞培养、免疫组化、光镜和电镜观察及流式细胞仪检测。结果：①在200 μmol/L浓度范围内，NDGA对SHG-44细胞有增殖抑制和诱导分化作用，且这种作用与浓度呈正相关；②在NDGA处理96 h内，NDGA对SHG-44细胞的增殖抑制作用以处理后24 h最明显；③NDGA处理后，SHG-44细胞增殖受阻于G1→S期。结论：NDGA对SHG-44细胞有明显的增殖抑制和诱导分化作用，且这种作用有周期特异性。
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中图法分类号：R739.4
Effects of nordihydroguaiaretic acid on proliferation and differentiation of human malignant glioma cells
Guo Deyu, Chen Yisheng, Shi Jingquan, Bian Xiuwu, Xin Rong
(Department of Pathology, Third Military Medical University, Chongqing, 400038)
Abstract Objective: To investigate the effects of nordihydroguaiaretic acid (NDGA) on proliferation and differentiation of human malignant glioma cell line SHG-44. Methods: Cell culture, immunohistochemistry, flow cytometry, light and electron microscopy were employed in this study. Results: ①NDGA with a concentration within 200 μmol/L inhibited the proliferation of SHG-44 cells and this effect was positively correlated to the concentration. ②The most conspicuous inhibition of the proliferation was found at the 24th h after treatment with 100 μmol/L NDGA for up to 96 h. ③Cell cycle revealed that the cell proliferation was blocked in the phase of G1 to S after treatment with NDGA. Conclusion: NDGA can inhibit proliferation and induce differentiation of human malignant glioma cells and this effect is cycle-specific.
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Key words nordihydroguaiaretic acid; glioma; induced differentiation
去甲二氢愈创木酸(Nordihydroguaiaretic acid,NDGA)是从常青灌木Larrea divaricata中提取的一种天然成分，是脂氧化酶的强抑制剂，具有抗氧化作用，国外曾作为食物添加剂使用，以防止食物酸败。近年来发现NDGA具有抗肿瘤作用[1～3]，如抑制实验诱发的大鼠乳腺癌和大肠癌的发生，抑制糖皮质激素诱导的淋巴瘤细胞的增殖等。本研究旨在观察NDGA对人脑恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞增殖和分化的影响。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
人脑恶性胶质瘤细胞系SHG-44(第110代)引自苏州医学院附属二院脑肿瘤研究室。细胞用含10%小牛血清(杭州四季青生物材料研究所生产)的RPMI-1640培养基(Gibco)，另添加适量的HEPES、抗生素(100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)和3%谷氨酰胺(10 μl/ml)置37℃、5% CO2混合气体的孵箱中培养，细胞换液时间为1～2 d，传代3～5 d，传代前用0.25%胰酶消化。
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1.2 NDGA溶液配制
用蒸馏水先配制0.01 mol/L pH7.2的PBS液，用孔径0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，作为对照液。NDGA(Sigma)液用上述PBS液配制，浓度为5mmol/L,37℃水浴并调整pH值直至完全溶解为止(溶液呈浅棕黄色)，过滤除菌，备用。
1.3 光镜观察及免疫组化染色
生长旺盛的SHG-44细胞按105/ml密度接种于预先置有干净消毒盖玻片的6孔培养板中或直径为35 mm的培养皿中，5 h细胞贴壁后加入NDGA液，使其终浓度分别为10、50、100、150和200 μmol/L，药物作用后24 h和48 h取出盖玻片，用PBS洗涤两次，95%乙醇固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min，自然晾干，4℃保存。临用前用玻璃刀将盖玻片1分为9，常规HE和免疫组织化学染色(SP法)。一抗鼠抗人增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、胶质原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、波形蛋白Vimentin单抗购自中山生物技术有限公司，SP试剂盒购自ZYMED公司，抗体稀释度PCNA、GFAP、Vimentin为1∶25，DAB显色。
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1.4 电镜
经NDGA处理后的细胞PBS冲洗，0.25%胰酶消化，离心后收集细胞沉淀，2.5%戊二醛固定，常规电镜包埋、制样、观察。
1.5 细胞周期分析
细胞按上述密度接种于24孔培养板中，然后加入NDGA液，使NDGA终浓度分别为10、50、100、150和200 μmol/L，药物作用24 h后取样(各3孔)。另将上述细胞密度接种的24孔培养板分3组：A组接种时加NDGA液，使其终浓度为100 μmol/L，B组接种时加等体积、等pH的PBS液，C组接种时不加任何液体，于药物作用12、24、48、72和96 h后取样(各3孔)。方法为：用0.25%胰酶消化细胞，吹打使其分散成单个细胞，用PBS离心洗涤两次，调节每个样品细胞数为2×106/ml，用微量移液器通过350目尼龙网注入70%冷乙醇中，4℃固定。测定前，倒掉酒精，用PBS洗一遍后加入RNA酶，37℃温育30 min后，放入冰浴中终止消化。用碘化丙锭(PI)染色2 h。FACStarplus型流式细胞仪(BECTON DICKINSON公司)检测。每个样本随机测定104个细胞，并求出细胞增殖指数。计算方法为：增殖指数(%)=(S+G2/M)/(G1+S+G2/M)×100%。
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1.6 细胞计数
细胞按上述方法接种于24孔培养板中，经上述NDGA处理后取样本各3孔，用0.4%台盼蓝排除试验计数活细胞平均数(每孔重复计数3次取均值)，并求出细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=(对照组活细胞数-NDGA组活细胞数)-对照组活细胞数×100%。
1.7 统计学处理
采用本校数理统计教研室的统计程序，进行两样本均数比较的统计学处理。
2 结果
2.1 形态学观察
对照组瘤细胞大部分呈椭圆形或短梭形，胞体丰满，核分裂像多见，电镜下见核形状不规则，有较深的核沟，并见核内假包涵体，胞浆中细胞器较少，部分细胞见稀疏、短小的胶质细丝。NDGA处理组细胞经NDGA处理后，在倒置显微镜下观察可见细胞透亮性(折光性)下降，并见颗粒，但台盼蓝试验阴性。HE染色见细胞分裂像减少，细胞胞体呈短梭形，胞突细而长，电镜下见瘤细胞核异型性降低，核仁小，胞浆内出现较多的胶质细丝，细胞器较丰富，部分有退变。
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2.2 免疫组织化学染色
PCNA阳性呈棕黄色，位于胞核。GFAP、Vimentin阳性呈棕黄色，位于胞浆。对照组瘤细胞大部分GFAP呈阴性，少数细胞呈弱阳性，见图1；几乎所有瘤细胞均呈Vimentin强阳性，PCNA阳性反应，标记指数(Labeling index,LI)为65%。NDGA处理24 h后瘤细胞GFAP反应较对照组增强，见图2，Vimentin反应减弱，PCNA的LI降低为40%。
图1 SHG-44细胞胞浆GFAP表达较弱 对照组24 h (S-P×200)
Fig 1 Weaker positive staining of GFAP in the SHG-44 cytoplasm control 24 h (S-P×200)
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图2 SHG-44细胞胞浆GFAP表达增强 NDGA组24 h (S-P×200)
Fig 2 Stronger positive staining of GFAP in the SHG-44 cytoplasm 24 h after NDGA treatment (S-P×200)
2.3 NDGA对SHG-44细胞生长的影响
2.3.1 NDGA影响SHG-44细胞生长的剂量效应从图3可看出，与对照组相比，10～200 μmol/L不同浓度的NDGA对SHG-44细胞数均有影响，且NDGA液浓度越高，这种影响越明显，即呈明显的剂量依赖性。当将NDGA处理后的细胞置于新鲜培养基中(不含NDGA)培养24 h，则细胞恢复原有的增殖分裂能力。不同浓度(10、50、100、150、200 μmol/L)的NDGA处理细胞24 h后，对细胞的生长抑制率分别为15.8%、21.1%、31.6%、36.8%和63.2%。
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2.3.2 NDGA影响SHG-44细胞生长的时间效应从图4可看出，与对照组相比，给NDGA后SHG-44细胞的生长明显受到抑制，24 h后细胞总数较对照组明显减少，且作用时间越长，细胞总数较对照组减少越明显。100 μmol/L的NDGA处理不同时间后对SHG-44细胞的生长抑制率24 h为31.6%，48 h为68.1%，72 h为75.0%，96 h为75.6%。
图3 NDGA影响SHG-44细胞生长的剂量效应
Fig 3 Dose effect of NDGA on the growth of SHG-44 cells
图4 NDGA影响SHG-44细胞生长的时间效应
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Fig 4 Time effect of NDGA treatment on the
growth of SHG-44 cells
2.4 细胞周期分析
2.4.1 NDGA影响SHG-44细胞周期的剂量效应见表1，与对照组相比，10～200 μmol/L不同浓度NDGA对SHG-44细胞周期均有作用，使G1期细胞增多(由67.0%→83.1%)，S期和G2/M期细胞减少(分别由28.2%→13.6%、4.7%→3.0%)，细胞增殖指数降低(由32.9%→16.8%)，且NDGA液浓度越高，这种作用越明显，即有明显的剂量依赖性。
表1 不同浓度NDGA对SHG-44细胞周期及
增殖指数(PI)的影响(%)
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Tab 1 Effects of different NDGA concentrations on the
cell cycle and PI of SHG-44 cells(%)
Concentration of NDGA(μmol/L)
Control
10
50
100
150
200
G1
, 百拇医药 67.0
74.3
73.2
77.2*
77.3*
83.1* *
S
28.2
20.2*
23.1*
19.8*
, http://www.100md.com
19.5*
13.6* *
G2/M
4.7
5.6
3.8
3.0*
3.2*
3.2*
PI
32.9
25.8
, 百拇医药
26.9
22.8*
22.7*
16.8*
*:P<0.05, * *：P<0.01 vs control
2.4.2 NDGA影响SHG-44细胞周期的时间效应见表2，与对照组相比，100 μmol/L NDGA处理细胞后24～72 h，使SHG-44细胞周期中G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，细胞增殖指数降低，且这种作用程度与作用时间有关，以给NDGA后24 h最明显(G1期由68.0%→81.1%、S期由27.7%→17.2%、G2/M期由4.3%→1.7%，细胞增殖指数由32.0%→18.9%,P<0.01)。而给PBS后各时相点与对照组差异不显著(P>0.05)。
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表2 不同处理时间NDGA对SHG-44细胞周期的影响(%)
Tab 2 Effects of different durations of NDGA treatment on the cell cycle of SHG-44 cells(%)
12 h
24 h
48 h
72 h
96 h
Groups
G1
S
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G2/M
G1
S
G2/M
G1
S
G2/M
G1
S
G2/M
G1
S
G2/M
, http://www.100md.com NDGA
72.0
22.4
5.5
81.1* *
17.2* *
1.7* *
79.2
8.1*
2.7*
74.1*
, http://www.100md.com
19.6
6.4*
80.2
18.2
1.5
PBS
76.3
19.8
3.9
67.0
28.6
4.4
73.8
, 百拇医药
15.3
10.9
65.1
22.0
12.9
72.4
22.7
4.9
Control
76.7
19.5
3.9
68.0
, 百拇医药
27.7
4.3
74.2
17.7
8.1
62.4
18.5
19.1
74.3
23.1
2.6
*:P<0.05, * *：P<0.01 vs control
, 百拇医药 3 讨论
肿瘤细胞增殖活性是目前肿瘤病理检验和研究中受到普遍关注的课题，它不仅决定肿瘤的发生、发展，而且在肿瘤对化疗、放疗的反应中有着重要意义[4]。以往有关NDGA的抗肿瘤作用，多集中于肿瘤的促发阶段，而对已形成的肿瘤的作用报道较少。本实验检测了SHG-44细胞生长情况、DNA含量(流式细胞仪检测)和PCNA标记指数(免疫组化)等多种反映细胞增殖活性的指标，观察NDGA对SHG-44细胞增殖的影响。结果发现，NDGA对SHG-44细胞有明显的增殖抑制作用，具体表现为NDGA处理后细胞增殖指数降低、细胞生长减慢、免疫组化显示细胞PCNA标记指数下降等，且这种作用有明显的剂量依赖性和时间依赖性，即在10～200 μmol/L浓度范围内，NDGA浓度越高，这种作用越明显，即呈剂量依赖性；在100 μmol/L NDGA处理SHG-44细胞96 h内，以处理24 h这种增殖抑制作用最明显。同时本实验结果还发现，当将NDGA处理后的细胞置于新鲜培养基中(不含NDGA)培养24 h，则细胞恢复原有的增殖分裂能力，提示NDGA对SHG-44细胞的这种抑制作用是可逆的，从另一侧面说明NDGA对细胞的相对无毒性。
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GFAP一直被视为星形细胞及其肿瘤的特异性标记物，在诊断及鉴别诊断上具有重要价值，我们既往的研究显示GFAP可与另一种中间丝蛋白Vimentin共同表达于人脑星形细胞肿瘤中，与肿瘤的分化程度密切相关，国外报道也是如此[5]。本实验结果发现，SHG-44细胞GFAP表达很弱或不表达，Vimentin强表达，当NDGA处理SHG-44细胞后，细胞GFAP表达明显增强，Vimentin表达明显减弱，且电镜下观察发现细胞胞浆中胶质细丝明显增多，这些均显示细胞向成熟星形细胞分化，提示NDGA有诱导SHG-44细胞分化成熟的作用。
不同的抗恶性肿瘤化疗药物对细胞增殖动力学的影响不同，因此根据药物对细胞周期的影响分成了周期特异性药物和周期非特异性药物两类。本实验研究结果表明，NDGA对SHG-44细胞周期有明显的影响，NDGA处理后，SHG-44细胞G1期细胞比例明显增多，S期和G2/M期细胞比例明显减少，使细胞增殖受阻于G1→S期，显示NDGA能够通过有效作用于细胞周期某一时相(G1→S期)，从而抑制胶质瘤细胞的生长和增殖。
, 百拇医药
综上所述，NDGA对人脑恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞有明显的增殖抑制和诱导分化作用，且这种增殖抑制作用具有周期特异性，但其作用机制尚有待进一步研究。
国家自然科学基金资助项目，NO.39670296
作者简介：郭德玉，男，31岁，讲师，博士
参考文献
[1] McCormick D L, Spicer A M. Nordihydroguaiaretic acid suppression of rat mammary carcinogenesis induced by N-methyl-N-nitrosourea. Cancer Lett,198
,(2):139
[2] Birkenfeld S, Zaltsmam Y A, Krispin M, et al. Antitumor effects of inhibitors of arachidonic acid cascade on experimentally induced intestinal tumors. Dis Colon Rectum,1987,30(1)：43
, 百拇医药
[3] Wilson D E, DiGianfilippo A, Orey F G, et al. Effect of nordihydroguaiaretic acid on culture rat and human glioma cell proliferation. J Neurosurg,1989,71(4):551
[4] Wilson G D， Saunders M I, Dische S, et al. Direct comparison of bromodeoxyuridine and Ki-67 labelling indices in human tumors. Cell Proli,1996,29(3):141
[5] Rutka J T, Murakami M, Dirs P B, et al. Role of glial filaments in cells and tumors of glial origin: a review. J Neurosurg,1997,87(3):420
收稿：1998-06-03；修回：1998-12-04, http://www.100md.com