乙型肝炎病毒特异性核酶与丁型肝炎病毒重组体的构建*
作者：温淑娟 祁学忠 周荣 黄镇华
单位：第一军医大学南方医院医学基因技术中心，广州，510515
关键词：丁型肝炎病毒；乙型肝炎病毒；核酶重组体；克隆
第一军医大学学报990124 摘要：目的 将重组丁型肝炎病毒基因组作为乙型肝炎病毒特异性核酶的载体，探讨解决核酶在实际应用中的保护性运载、靶向性和特异性问题。方法 设计了乙型肝炎病毒特异性锤头型核酶结构，采用重组引物，结合“不对称PCR”和“Mega primer PCR”方法将所设计的锤头型核酶基因替代插入到丁型肝炎病毒基因组5’端高变区，重组体经PCR初步鉴定后，克隆到T载体(pTAdv)T7启动子下游，经限制性内切酶酶切、序列测定分析。结果与结论 证实该重组体为预期的乙型肝炎病毒特异性核酶-丁型肝炎病毒基因组重组体，为进一步的体外切割和细胞内与乙型肝炎病毒相互作用的研究提供了基础。
, 百拇医药
中图分类号：R51
Construction of recombinant HDV carring HBV-specific hammerhead ribozyme
Wen Shujuan, Qi Xuezhong, Zhou Rong, Huang Zhenghua
Department of Gene Centre, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou,510515
Abstract: Hepatitis B virus (HBV) is a DNA virus which replicates through reverse transcription of a RNA intermediate (pregenome RNA).A recombinant hepatitis D virus (HDV) cDNA with HBV specific hammerhead ribozyme was constructed by a modified PCR derivated from asymmetric PCR and Mega primer PCR with primers containing mutation. PCR product was cloned in T-vector under the control of T7 promotor, and the clone was selected by restrict endonuclease analysis and DNA sequencing. This study suggest that the recombinant HDV cDNA with HBV specific hammerhead ribozyme might be used as a tool for the further cleavage study of HBV in vitro and in vivo.
, 百拇医药
Key words: ribozyme; hepatitis D virus; Hepatitis B virus; clone; sequencing
乙型肝炎(乙肝)目前尚无有效的治疗方法。乙型肝炎病毒(HBV)的基因治疗是近年来研究的热点，其中核酶(Ribozyme)是一类具有催化活性的RNA分子[1]，能特异地切割所识别的靶RNA。目前已人工设计了多种抗HBV核酶[2~4]，研究提高核酶的高效运载及体内表达对临床应用至关重要。丁型肝炎(丁肝)病毒(HDV)是一种乙型肝炎病毒依赖性缺损病毒，研究表明，HDV有独立的复制能力，但依赖于乙型肝炎病毒包装和释放。HDV 对肝细胞的毒害作用尚无直接的证据。因此，将HDV作为一种肝细胞导向性“基因药物”载体，有望实现核酶在体内的“保护性运载”和高效表达等，促进核酶的应用。
作者设计并构建了HBV特异性锤头型核酶(rRZ)替代插入的HDV基因组重组体[RHDVRZ(A)]，同时克隆了rRZ和部分HDV基因组重组体(rHDVRZ(P))，所有克隆均置于T7启动子下游，并经测序证实。
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1 材料与方法
1.1 质粒 含HDV基因组三联体质粒PSVC-D3由南方医院传染科侯金林教授惠赠。
1.2 主要试剂 dNTP、Taq酶购自上海Sangon生物工程公司；pTAdv T-vector、凝胶纯化试剂盒Advantage TM PCR-pure Kit为美国Clontech公司产品；测序用Pharmacia 公司ABI310自动测序仪完成。
1.3 引物 根据Makino[4]报导序列，由Pharmacia 公司ABI391DNA自动合成仪合成，序列如表1。
表1 PCR引物序列
Tab.1 Sequence of PCR primers Primers
, 百拇医药
Sequences of primers
P1(L)
5’-AGC AAG CTT GAG CCA AGT TCC GAA CAT TGA CAT AGC TCT GAT GAG TCC GTG-3
P2(M)
5’-CTC CGA CGT TCC AAT GCT CCA GGG AAT TAG TAG TTT CGT CCT CAC GGA CTC-3`
P3(R)
5’-GTC GAA TTC GGG CTC GGG CGG CG AGT CCA GCA GTC-3`
P4
, 百拇医药
5’-AGC AAG CTT GAG CCA AGT TCC GAA CGA GGA-3` 30 mer
P5
5’-GTT CCT CTA ACT TCT TC TTC CAA CAT TGA GAT AGC TCT GAT GAG TCC-3`
P20
5'-TAT GTC AAT GTT GAA TAA AGC GGG TTT CCA-3'
P13
5’-TGG AAT TCA ACA TTG ACA TAG CTC TGA TGA GTC CGT GAG3’
P14
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5’-ACA AGC TTC CAG GGA ATT AGT AGT TTC GTC CTC ACG GAC3’
P31
5’-CAA AAG GGT CAG TGC TGC3’
1.4 rHDVRZ(A)的PCR扩增及产物的初步鉴定 根据文献[5～7]建立30μl反应体系：20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，50 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，四种dNTP各200μmol/L，引物P1，P2，P3浓度分别为0.05μmol/L，0.005μmol/L，0.05μmol/L，模板20 ng质粒 ，Taq酶1~2 U。92 ℃ 50 s;53 ℃50 s;70 ℃, 120 s;33个循环，最后70 ℃延伸5 min。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检查。将PCR产物稀释10 000倍，取1μl做模板以P1/P3，P5/P3，P1/P20，P5/P20引物对进行PCR初步鉴定。
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1.5 rHDVRZ(A)的克隆及鉴定 PCR产物的凝胶纯化、连接及转化参照试剂盒说明和文献[8]。挑取X-gal平板白色菌落，加裂解缓冲液(试剂盒提供)煮沸裂解，取1μl上清做PCR模板，按上述反应条件以引物对P1/P3进行 PCR扩增鉴定；P31/P3 PCR扩增鉴定正向克隆后，提取质粒，用EcoRI酶切鉴定，以T7，SP6引物双向测序。
1.6 rHDVRZ(P)的克隆及鉴定 采用引物P1(L)，P2(M)和P20(R)，方法同上。
1.7 rRZ的克隆及鉴定 以P13和P14引物直接变性、退火和延伸，同上方法克隆扩增产物。菌落以P31和P14引物对PCR扩增初步鉴定正向克隆后，以T7引物进行单向测序。 2 结果
2.1 rHDVRZ(A)的PCR扩增及产物的初步鉴定 P1、P2、P3引物按不同的比例加入PCR反应体系中，经过35个循环后，取10 μl产物在2% 琼脂糖凝胶电泳，可以观察到大约1.7 kb大小的条带。PCR产物稀释后，用不同的引物对鉴定扩增结果图1所示，P1/P3， P5/P3扩增大小约为1.7 kb， P1/P20， P5/P20扩增约为0.944 kb片段，与预期的大小相符。由于引物P1和P5的3’端与非重组δ因子不匹配，故扩增产物可初步断定为重组体。
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图1 重组体HDVRZ(A)的PCR扩增及初步鉴定
Fig. 1 Amplification and identification of recombinant HDVRZ(A) by PCR
A： PCR product amplified with P1,P20; B.:PCR product amplified with P5,P20;C：PCR product amplified with P1,P3; D:PCR product amplified with P5,P3;E：λDNA/ HindⅢ + EcoRI Marker; F:PCR product of HDVRZ(A) with primers P1, P2, P3
2.2 rHDVRZ(A)、rHDVRZ(P)克隆的鉴定 将P1，P2，P3扩增产物1.7 kb和P1，P2，P20扩增产物0.944 kb分别插入到pTAdV载体T7启动子下游，重组质粒用EcoRI酶切，分别得到约1.7 kb(图2)和0.944 kb(图3)的插入片段，从而筛选出阳性克隆。
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图2 重组体rHDVRZ(A)酶切鉴定
Fig.2 Restriction analysis of recombinant rHDVRZ(A)
A:λ/ HindⅢ+ EcoRI marker; B:rHDVRZ(A)/EcoRI; C:pTAdv/EcoRI; D:PCR product
图3 重组体rHDVRZ(P)酶切鉴定
Fig.3 Restriction analysis of recombinant rHDVRZ(P)
A:λ/ HindIII+ EcoRI marker; B:rHDVRZ(P)/EcoRI; C,D:pTAdv/EcoRI; F:PCR product
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2.3 核酶克隆及鉴定 由于所设计的RZ只有53 bp，克隆后用EcoRI酶切电泳结果难以观察，所以我们在T7启动子上游设计了一条引物，与核酶的P14引物配对，用PCR方法既可筛选阳性克隆，又可鉴定是否为正向插入。经测序，rRZ的序列为AACATTGACATAGCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAACTACTAATTCCCTGGA，与设计吻合。
2.4 rHDVRZ(A)序列 阳性重组质粒rHDVRZ(A)经SP6和T7引物双向测序，结果显示rHDVRZ(P)序列包含在rHDVRZ中，从1开始终止于第944 nt。
3 讨论
Hutchins等[9]提出的锤头型结构核酶，由催化中心和结合部位两部分组成，是已知核酶中结构最简单的一种。我们针对HBV复制过程中出现的RNA中间体，设计了53 bp HBV特异性锤头型核酶结构，选择HBV的保守C区基因作为靶序列，设计了较长的结合序列(30 nt)：UCC AGG GAA UUA GUA GUC AGC UAU GUC AAU GUU(2 141~2 175)(GUC为切割位点)，以期减少非特异切割作用。由于HDV基因组5’端为高变区(17~88位)，选择此部位替代插入核酶可能不会影响其复制。在构建rHDVRZ(A)重组体时，结合“不对称PCR”和“Mega primer PCR”方法[5~7]，设计了三条引物(L、R为左、右向引物，M为中间引物，其中L、M为重组引物，R为正常引物)，适当调整引物之间的比例，一次PCR就获得所要的阳性重组体，方法简便、快速、高效，对在基因组中选择性引入突变具有一定的方法学意义。
, 百拇医药
鉴于HDV基因组的二级结构可能会影响到核酶与靶RNA的作用，同时还扩增了约944 bp的rHDVRZ(P)。所有重组体PCR产物均用T载体(pTAdv)克隆到T7启动子下游，并经测序最终证实，为进一步的体外转录、切割和细胞内与HBV相互作用的研究奠定了基础。
*本课题由广东省自然科学基金资助
作者简介：温淑娟，女，1962年出生，主管技师。
参考文献
1 Cech TR. The chemistry of self-splicing RNA and RNA enzymes. Science, 1987,236(807): 1532
2 Weizsacker FV，Blum HE, Wands JR. Cleavage of hepatitis B virus RNA by three ribozymes transcripted from a single DNA template. Biochem Biophys Res Commun,1992, 189(2):743
, 百拇医药
3 Beck J, Nassal M. Efficient hammerhead ribozyme–mediated cleavage of the structured hepatitis B virus encapsidation signal in vitro and in cell extracts, but not in intact cells. Nucleic Acids Res, 1995,23(24): 4954
4 Makino SJ, Chang MF, Shieh CK et al. Molecular cloning and sequencing of a human hepatitis delta(δ) virus RNA.Naturue,1987, 329 (6145) :343
5 Picard V, Ersdal-Badju E, Lu AQ et al. A rapid and efficient one-tube PCR based mutagenesis technique using Pfu DNA polymerase. Nucleic Acids Res, 1994,22(13): 2587
, 百拇医药
6 Marini F, Naeem A, Lapeyre J N et al. An efficient 1-tube PCR method for internal site-directed mutagenesis of large amplified molecules. Nucleic Acid Res, 1993, 21(9): 2277
7 Barettino O, Feigenbutz M, Valcarel R et al. Improved method for PCR-mediated site-directed mutagenesis .Nucleic Acids Res,1994,22(3):541
8 Sambrook J, Frittsch EF, Maniattis T. Molecular Clone Laboratory Manual, 2nd ed, New York: Spring Harbor Labratory. Cold Spring Harbor, 1989,49~55
9 Hutchins CJ, Rathjen PD, Forster AC et al. Self-cleavage of plus and minus RNA transcripts of avcado sun-blotch viroid. Nucleic Acids Res, 1986,14(9): 3627
(收稿日期：1998-08-06), http://www.100md.com
单位：第一军医大学南方医院医学基因技术中心，广州，510515
关键词：丁型肝炎病毒；乙型肝炎病毒；核酶重组体；克隆
第一军医大学学报990124 摘要：目的 将重组丁型肝炎病毒基因组作为乙型肝炎病毒特异性核酶的载体，探讨解决核酶在实际应用中的保护性运载、靶向性和特异性问题。方法 设计了乙型肝炎病毒特异性锤头型核酶结构，采用重组引物，结合“不对称PCR”和“Mega primer PCR”方法将所设计的锤头型核酶基因替代插入到丁型肝炎病毒基因组5’端高变区，重组体经PCR初步鉴定后，克隆到T载体(pTAdv)T7启动子下游，经限制性内切酶酶切、序列测定分析。结果与结论 证实该重组体为预期的乙型肝炎病毒特异性核酶-丁型肝炎病毒基因组重组体，为进一步的体外切割和细胞内与乙型肝炎病毒相互作用的研究提供了基础。
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中图分类号：R51
Construction of recombinant HDV carring HBV-specific hammerhead ribozyme
Wen Shujuan, Qi Xuezhong, Zhou Rong, Huang Zhenghua
Department of Gene Centre, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou,510515
Abstract: Hepatitis B virus (HBV) is a DNA virus which replicates through reverse transcription of a RNA intermediate (pregenome RNA).A recombinant hepatitis D virus (HDV) cDNA with HBV specific hammerhead ribozyme was constructed by a modified PCR derivated from asymmetric PCR and Mega primer PCR with primers containing mutation. PCR product was cloned in T-vector under the control of T7 promotor, and the clone was selected by restrict endonuclease analysis and DNA sequencing. This study suggest that the recombinant HDV cDNA with HBV specific hammerhead ribozyme might be used as a tool for the further cleavage study of HBV in vitro and in vivo.
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Key words: ribozyme; hepatitis D virus; Hepatitis B virus; clone; sequencing
乙型肝炎(乙肝)目前尚无有效的治疗方法。乙型肝炎病毒(HBV)的基因治疗是近年来研究的热点，其中核酶(Ribozyme)是一类具有催化活性的RNA分子[1]，能特异地切割所识别的靶RNA。目前已人工设计了多种抗HBV核酶[2~4]，研究提高核酶的高效运载及体内表达对临床应用至关重要。丁型肝炎(丁肝)病毒(HDV)是一种乙型肝炎病毒依赖性缺损病毒，研究表明，HDV有独立的复制能力，但依赖于乙型肝炎病毒包装和释放。HDV 对肝细胞的毒害作用尚无直接的证据。因此，将HDV作为一种肝细胞导向性“基因药物”载体，有望实现核酶在体内的“保护性运载”和高效表达等，促进核酶的应用。
作者设计并构建了HBV特异性锤头型核酶(rRZ)替代插入的HDV基因组重组体[RHDVRZ(A)]，同时克隆了rRZ和部分HDV基因组重组体(rHDVRZ(P))，所有克隆均置于T7启动子下游，并经测序证实。
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1 材料与方法
1.1 质粒 含HDV基因组三联体质粒PSVC-D3由南方医院传染科侯金林教授惠赠。
1.2 主要试剂 dNTP、Taq酶购自上海Sangon生物工程公司；pTAdv T-vector、凝胶纯化试剂盒Advantage TM PCR-pure Kit为美国Clontech公司产品；测序用Pharmacia 公司ABI310自动测序仪完成。
1.3 引物 根据Makino[4]报导序列，由Pharmacia 公司ABI391DNA自动合成仪合成，序列如表1。
表1 PCR引物序列
Tab.1 Sequence of PCR primers Primers
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Sequences of primers
P1(L)
5’-AGC AAG CTT GAG CCA AGT TCC GAA CAT TGA CAT AGC TCT GAT GAG TCC GTG-3
P2(M)
5’-CTC CGA CGT TCC AAT GCT CCA GGG AAT TAG TAG TTT CGT CCT CAC GGA CTC-3`
P3(R)
5’-GTC GAA TTC GGG CTC GGG CGG CG AGT CCA GCA GTC-3`
P4
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5’-AGC AAG CTT GAG CCA AGT TCC GAA CGA GGA-3` 30 mer
P5
5’-GTT CCT CTA ACT TCT TC TTC CAA CAT TGA GAT AGC TCT GAT GAG TCC-3`
P20
5'-TAT GTC AAT GTT GAA TAA AGC GGG TTT CCA-3'
P13
5’-TGG AAT TCA ACA TTG ACA TAG CTC TGA TGA GTC CGT GAG3’
P14
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5’-ACA AGC TTC CAG GGA ATT AGT AGT TTC GTC CTC ACG GAC3’
P31
5’-CAA AAG GGT CAG TGC TGC3’
1.4 rHDVRZ(A)的PCR扩增及产物的初步鉴定 根据文献[5～7]建立30μl反应体系：20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，50 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，四种dNTP各200μmol/L，引物P1，P2，P3浓度分别为0.05μmol/L，0.005μmol/L，0.05μmol/L，模板20 ng质粒 ，Taq酶1~2 U。92 ℃ 50 s;53 ℃50 s;70 ℃, 120 s;33个循环，最后70 ℃延伸5 min。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检查。将PCR产物稀释10 000倍，取1μl做模板以P1/P3，P5/P3，P1/P20，P5/P20引物对进行PCR初步鉴定。
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1.5 rHDVRZ(A)的克隆及鉴定 PCR产物的凝胶纯化、连接及转化参照试剂盒说明和文献[8]。挑取X-gal平板白色菌落，加裂解缓冲液(试剂盒提供)煮沸裂解，取1μl上清做PCR模板，按上述反应条件以引物对P1/P3进行 PCR扩增鉴定；P31/P3 PCR扩增鉴定正向克隆后，提取质粒，用EcoRI酶切鉴定，以T7，SP6引物双向测序。
1.6 rHDVRZ(P)的克隆及鉴定 采用引物P1(L)，P2(M)和P20(R)，方法同上。
1.7 rRZ的克隆及鉴定 以P13和P14引物直接变性、退火和延伸，同上方法克隆扩增产物。菌落以P31和P14引物对PCR扩增初步鉴定正向克隆后，以T7引物进行单向测序。 2 结果
2.1 rHDVRZ(A)的PCR扩增及产物的初步鉴定 P1、P2、P3引物按不同的比例加入PCR反应体系中，经过35个循环后，取10 μl产物在2% 琼脂糖凝胶电泳，可以观察到大约1.7 kb大小的条带。PCR产物稀释后，用不同的引物对鉴定扩增结果图1所示，P1/P3， P5/P3扩增大小约为1.7 kb， P1/P20， P5/P20扩增约为0.944 kb片段，与预期的大小相符。由于引物P1和P5的3’端与非重组δ因子不匹配，故扩增产物可初步断定为重组体。
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图1 重组体HDVRZ(A)的PCR扩增及初步鉴定
Fig. 1 Amplification and identification of recombinant HDVRZ(A) by PCR
A： PCR product amplified with P1,P20; B.:PCR product amplified with P5,P20;C：PCR product amplified with P1,P3; D:PCR product amplified with P5,P3;E：λDNA/ HindⅢ + EcoRI Marker; F:PCR product of HDVRZ(A) with primers P1, P2, P3
2.2 rHDVRZ(A)、rHDVRZ(P)克隆的鉴定 将P1，P2，P3扩增产物1.7 kb和P1，P2，P20扩增产物0.944 kb分别插入到pTAdV载体T7启动子下游，重组质粒用EcoRI酶切，分别得到约1.7 kb(图2)和0.944 kb(图3)的插入片段，从而筛选出阳性克隆。
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图2 重组体rHDVRZ(A)酶切鉴定
Fig.2 Restriction analysis of recombinant rHDVRZ(A)
A:λ/ HindⅢ+ EcoRI marker; B:rHDVRZ(A)/EcoRI; C:pTAdv/EcoRI; D:PCR product
图3 重组体rHDVRZ(P)酶切鉴定
Fig.3 Restriction analysis of recombinant rHDVRZ(P)
A:λ/ HindIII+ EcoRI marker; B:rHDVRZ(P)/EcoRI; C,D:pTAdv/EcoRI; F:PCR product
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2.3 核酶克隆及鉴定 由于所设计的RZ只有53 bp，克隆后用EcoRI酶切电泳结果难以观察，所以我们在T7启动子上游设计了一条引物，与核酶的P14引物配对，用PCR方法既可筛选阳性克隆，又可鉴定是否为正向插入。经测序，rRZ的序列为AACATTGACATAGCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAACTACTAATTCCCTGGA，与设计吻合。
2.4 rHDVRZ(A)序列 阳性重组质粒rHDVRZ(A)经SP6和T7引物双向测序，结果显示rHDVRZ(P)序列包含在rHDVRZ中，从1开始终止于第944 nt。
3 讨论
Hutchins等[9]提出的锤头型结构核酶，由催化中心和结合部位两部分组成，是已知核酶中结构最简单的一种。我们针对HBV复制过程中出现的RNA中间体，设计了53 bp HBV特异性锤头型核酶结构，选择HBV的保守C区基因作为靶序列，设计了较长的结合序列(30 nt)：UCC AGG GAA UUA GUA GUC AGC UAU GUC AAU GUU(2 141~2 175)(GUC为切割位点)，以期减少非特异切割作用。由于HDV基因组5’端为高变区(17~88位)，选择此部位替代插入核酶可能不会影响其复制。在构建rHDVRZ(A)重组体时，结合“不对称PCR”和“Mega primer PCR”方法[5~7]，设计了三条引物(L、R为左、右向引物，M为中间引物，其中L、M为重组引物，R为正常引物)，适当调整引物之间的比例，一次PCR就获得所要的阳性重组体，方法简便、快速、高效，对在基因组中选择性引入突变具有一定的方法学意义。
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鉴于HDV基因组的二级结构可能会影响到核酶与靶RNA的作用，同时还扩增了约944 bp的rHDVRZ(P)。所有重组体PCR产物均用T载体(pTAdv)克隆到T7启动子下游，并经测序最终证实，为进一步的体外转录、切割和细胞内与HBV相互作用的研究奠定了基础。
*本课题由广东省自然科学基金资助
作者简介：温淑娟，女，1962年出生，主管技师。
参考文献
1 Cech TR. The chemistry of self-splicing RNA and RNA enzymes. Science, 1987,236(807): 1532
2 Weizsacker FV，Blum HE, Wands JR. Cleavage of hepatitis B virus RNA by three ribozymes transcripted from a single DNA template. Biochem Biophys Res Commun,1992, 189(2):743
, 百拇医药
3 Beck J, Nassal M. Efficient hammerhead ribozyme–mediated cleavage of the structured hepatitis B virus encapsidation signal in vitro and in cell extracts, but not in intact cells. Nucleic Acids Res, 1995,23(24): 4954
4 Makino SJ, Chang MF, Shieh CK et al. Molecular cloning and sequencing of a human hepatitis delta(δ) virus RNA.Naturue,1987, 329 (6145) :343
5 Picard V, Ersdal-Badju E, Lu AQ et al. A rapid and efficient one-tube PCR based mutagenesis technique using Pfu DNA polymerase. Nucleic Acids Res, 1994,22(13): 2587
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6 Marini F, Naeem A, Lapeyre J N et al. An efficient 1-tube PCR method for internal site-directed mutagenesis of large amplified molecules. Nucleic Acid Res, 1993, 21(9): 2277
7 Barettino O, Feigenbutz M, Valcarel R et al. Improved method for PCR-mediated site-directed mutagenesis .Nucleic Acids Res,1994,22(3):541
8 Sambrook J, Frittsch EF, Maniattis T. Molecular Clone Laboratory Manual, 2nd ed, New York: Spring Harbor Labratory. Cold Spring Harbor, 1989,49~55
9 Hutchins CJ, Rathjen PD, Forster AC et al. Self-cleavage of plus and minus RNA transcripts of avcado sun-blotch viroid. Nucleic Acids Res, 1986,14(9): 3627
(收稿日期：1998-08-06), http://www.100md.com