菌种保存方法的改进
作者：黄霞云
单位：广东医学院微生物教研室，湛江 524023
关键词：菌种；保存方法；改进
广东医学院学报JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE1999年 第17卷 第1期 Vol 菌种保存工作是从事微生物学、免疫学教学及科研工作的一项十分重要的任务.以往的菌种保存，常采用人工传代法，既费时、费力，又增加了菌种污染的机会.近十年来，我们对以往的菌种保存方法进行了改进，在实验中摸索出一种简易的菌种保存法——低温保存法，并取得了较满意的效果，现报道如下.
1 材料和方法
1.1 菌种 葡萄球菌属(Staphylococcus)：金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)、表皮葡萄球菌(Staph.epidermidis)；链球菌属(Streptococcus)：甲型溶血型链球菌(α-hemolytic streptococcus)、乙型溶血性链球菌(β-hemolytic streptococcus)、丙型链球菌(γ-streptococcus)、肺炎双球菌(Pneumococcus)；奈瑟氏菌属(Neisseria)：脑膜炎双球菌(meningococcus)；埃希氏菌属(Escherichia):大肠杆菌(E.coli)；沙门氏菌属(Salmonella):伤寒杆菌(S.typhi)；志贺氏菌属(Shigella): 痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae)；棒状杆菌属(Corynebacterium):白喉杆菌(C.diphtheriae)；芽胞杆菌属(Bacillus)；炭疽杆菌(B.anthracis)；嗜血杆菌属(Haemophilus):流感杆菌(H.influenzae)；鲍特氏菌属(Bordetella):百日咳杆菌(B.pertussis)； 假单胞菌属(Pseudomonas)：绿脓杆菌(P.aeruginosa).上述菌种均为我室保存菌种.
, 百拇医药
图1 低温保存的金黄色葡萄球菌，镜下观察 (10×100) 图2 人工传代的金黄色葡萄球菌，镜下观察 (10×100)
1.2 菌种保存液的配制 K2HPO412 .6g，柠檬酸钠0.98g，MgSO4*7H2O 0.18g，KH2PO4 3.6g，甘油88g，加蒸馏水至1000mL，103.4kPa灭菌30min.
1.3 菌种保存方法 将细菌接种于肉汤培养基中，37℃培养16～18h，或斜面培养物刮取于生理盐水中，然后加入等体积的菌种保存液，冻存于-70℃或-20℃中.
2 结果与讨论
2.1 延长菌种保存时间 我们对人工传代细菌和低温保存的细菌进行了比较：甲型溶血型链球菌、肺炎双球菌、流感杆菌、百日咳杆菌、绿脓杆菌等耐受力低的细菌，用低温保存方法，在-70℃可保存10a以上，在-20℃可保存2a以上，大大延长了细菌存活时间.而人工传代上述细菌，需每隔2、3d传代一次，一些耐受力较强的细菌，亦需每隔20d传代一次.
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2.2 保持菌种生物学特性的稳定 经低温保存方法保存的细菌，经10a后，取出复苏，菌种长势良好，未发现变异现象.人工传代的细菌，如金黄葡萄球菌经几十次传代后，菌落变小，色素变浅，细菌经革兰氏染色，其形态变大，且由革兰氏阳性变为革兰氏阴性(见图1、2)，血浆凝固酶由阳性变为阴性.
2.3 操作简单 低温保存方法保存菌种，只需经肉汤培养加等量保存液，分装小试管，塞上棉塞，注明保存日期，存放于-70℃或-20℃中.人工的传代方法要根据不同的菌种在不同的培养基生长情况，采用不同的培养基接种，费工费时.
2.4 减少污染机会 低温保存方法，菌种在小试管内封存，需要时，取出一支，避免了污染杂菌的机会.人工传代方法，每传代一次，都有可能被人为污染的机会.
低温保存方法简单，易掌握，无需特别的设备，尤其适宜于大、中专院校及一些基层单位作为保存菌种用.
收稿日期：1998-01-23, http://www.100md.com
单位：广东医学院微生物教研室，湛江 524023
关键词：菌种；保存方法；改进
广东医学院学报JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE1999年 第17卷 第1期 Vol 菌种保存工作是从事微生物学、免疫学教学及科研工作的一项十分重要的任务.以往的菌种保存，常采用人工传代法，既费时、费力，又增加了菌种污染的机会.近十年来，我们对以往的菌种保存方法进行了改进，在实验中摸索出一种简易的菌种保存法——低温保存法，并取得了较满意的效果，现报道如下.
1 材料和方法
1.1 菌种 葡萄球菌属(Staphylococcus)：金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)、表皮葡萄球菌(Staph.epidermidis)；链球菌属(Streptococcus)：甲型溶血型链球菌(α-hemolytic streptococcus)、乙型溶血性链球菌(β-hemolytic streptococcus)、丙型链球菌(γ-streptococcus)、肺炎双球菌(Pneumococcus)；奈瑟氏菌属(Neisseria)：脑膜炎双球菌(meningococcus)；埃希氏菌属(Escherichia):大肠杆菌(E.coli)；沙门氏菌属(Salmonella):伤寒杆菌(S.typhi)；志贺氏菌属(Shigella): 痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae)；棒状杆菌属(Corynebacterium):白喉杆菌(C.diphtheriae)；芽胞杆菌属(Bacillus)；炭疽杆菌(B.anthracis)；嗜血杆菌属(Haemophilus):流感杆菌(H.influenzae)；鲍特氏菌属(Bordetella):百日咳杆菌(B.pertussis)； 假单胞菌属(Pseudomonas)：绿脓杆菌(P.aeruginosa).上述菌种均为我室保存菌种.
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图1 低温保存的金黄色葡萄球菌，镜下观察 (10×100) 图2 人工传代的金黄色葡萄球菌，镜下观察 (10×100)
1.2 菌种保存液的配制 K2HPO412 .6g，柠檬酸钠0.98g，MgSO4*7H2O 0.18g，KH2PO4 3.6g，甘油88g，加蒸馏水至1000mL，103.4kPa灭菌30min.
1.3 菌种保存方法 将细菌接种于肉汤培养基中，37℃培养16～18h，或斜面培养物刮取于生理盐水中，然后加入等体积的菌种保存液，冻存于-70℃或-20℃中.
2 结果与讨论
2.1 延长菌种保存时间 我们对人工传代细菌和低温保存的细菌进行了比较：甲型溶血型链球菌、肺炎双球菌、流感杆菌、百日咳杆菌、绿脓杆菌等耐受力低的细菌，用低温保存方法，在-70℃可保存10a以上，在-20℃可保存2a以上，大大延长了细菌存活时间.而人工传代上述细菌，需每隔2、3d传代一次，一些耐受力较强的细菌，亦需每隔20d传代一次.
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2.2 保持菌种生物学特性的稳定 经低温保存方法保存的细菌，经10a后，取出复苏，菌种长势良好，未发现变异现象.人工传代的细菌，如金黄葡萄球菌经几十次传代后，菌落变小，色素变浅，细菌经革兰氏染色，其形态变大，且由革兰氏阳性变为革兰氏阴性(见图1、2)，血浆凝固酶由阳性变为阴性.
2.3 操作简单 低温保存方法保存菌种，只需经肉汤培养加等量保存液，分装小试管，塞上棉塞，注明保存日期，存放于-70℃或-20℃中.人工的传代方法要根据不同的菌种在不同的培养基生长情况，采用不同的培养基接种，费工费时.
2.4 减少污染机会 低温保存方法，菌种在小试管内封存，需要时，取出一支，避免了污染杂菌的机会.人工传代方法，每传代一次，都有可能被人为污染的机会.
低温保存方法简单，易掌握，无需特别的设备，尤其适宜于大、中专院校及一些基层单位作为保存菌种用.
收稿日期：1998-01-23, http://www.100md.com