人红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶分离纯化方法的改进
作者：黄进明 凌光鑫
单位：(黄进明)广东省深圳市福田区梅林医院，深圳 518049；(凌光鑫)广东医学院生化教研室，湛江 524023
关键词：红细胞；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；纯化方法
广东医学院学报JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE1999年 第17卷 第1期 Vol 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)是磷酸戊糖途径的限速酶.传统的以NADP-Sepharose 4 B作为亲和吸附剂的纯化方法由于较昂贵的NADP-Sepharose 4 B用量多，且耗时长，为此，作者对此传统方法进行了改进.报道如下：
1 材料与方法
1.1 分离纯化 G-6-PD的分离纯化根据Kahn[1]和Craney[2]等的方法加以改进.纯化过程简述如下：人抗凝血1000mL，离心，吸弃血浆及白细胞层，用生理盐水洗涤红细胞，加入溶胞液和少量甲苯，剧烈振摇破坏红细胞，制得溶血液.10g DEAE-Sephadex A 50(Pharmacia 产品)用含20mmol/LNaCl的磷酸盐缓冲液(50mmol/L，pH6.4)平衡后抽干，倒入溶血液中，不时搅拌，吸附40min，抽干，用含50mmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液抽滤洗涤，再用含250mmol/L NaCl，10μmol/L NADP+(Sigma产品)的磷酸盐缓冲液洗脱G-6-PD，加入2 mmol/L NADP+使其终浓度为20 μ mol/L。将固体(NH4)2 SO4加入G-6-PD洗脱液中至终浓度为36%，收集沉淀物，透析.样品上40mL NADP-Sepharose 4 B(按Lamed等的方法合成[3].
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Sepharose 4 B为Sigma产品)亲和柱，用600mmol/L NaCl，50μmol/L NADP+，50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH9.0)洗脱G-6-PD，超滤浓缩至2ml后再加入含50μmol/L NADP+的磷酸盐酸冲液(10mmol/L，pH8.0)50mL，继续超滤脱盐至2mL.样品上DEAE-Sephadex A 50柱，用NaCl梯度洗脱G-6-PD，超滤浓缩.
1.2 酶活力的测定
1.2.1 定量测定 按赵剑等[4]的方法进行.温度为25℃.
1.2.2 定性测定 在黑色陶瓷板的凹孔中加入洗脱液、反应液和G-6-P(Sigma产品)各一滴，在紫外灯下观察有无荧光产生.
1.3 蛋白质浓度的测定 采用考马斯亮蓝G-250(进口分装)染色法[5]，以BSA为标准品.
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1.4 SDS-PAGE 按Laemmli[6]的方法进行.分离胶浓度为7.5%，浓缩胶为4%.
2 结果与讨论
经上述纯化步骤后，得到了G-6-PD纯品.分离纯化流程和
结果见表1. 从1000mL人全血中，得到G-6-PD1.68mg，比活性165U/mg，回收率54%，SDS-PAGE 显示单一条带(图1).
表1 人红细胞G-6-PD纯化流程和结果 纯化步骤
总蛋白
(m/mg)
总活性
(U)
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比活性
(U/mg)
回收率
/%
溶血液
106800
509
0.0048
100
第一次DEAE-Sephadex A 50层析
1302
463
0.36
, 百拇医药
91
(NH4)2SO4沉淀
300
463
1.54
91
NADP-Sepharose 4 B亲和层析
4.45
356
80
70
第二DEAE-Sephadex A 50柱层析
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1.68
277
165
54
图1 人红细胞G-6-PD不同纯化阶段SDS-PAGE电泳图谱
1 从第一次DEAE-Sephadex A 50层析洗脱的样品
2 从NADP-Sepharose 4 B 亲和柱洗脱的样品
3 从第二次DEAE-Sephadex A 50层析柱洗脱的G-6-PD纯品
文献[2，7]曾报道过用NADP-Sepharose 4 B亲和层析纯化人红细胞G-6-PD的方法。其分离纯化的步骤是先用NADP-Sepharose 4 B吸附溶血液中的G-6-PD，再用(NH4)2 SO4沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析等方法进一步纯化而得到G-6-PD纯品.纯化500mL人全血需要50mL NADP-Sepharose 4 B.本法采用的纯化线路是先用离子交换层析和(NH4)2SO4沉淀以除去大部分杂蛋白，再经NADP-Sepharose 4 B 亲和层析和第二次离子交换层析而获得G-6-PD纯品.纯化1000mL人全血仅需40mL NADP-Sepharose 4 B.减少价格较贵的NADP-Sepharose 4 B 的用量，可以降低纯化费用，有利于一次性制备多量G-6-PD纯品及缩减制备时间，是一种有效实用的方法。纯化的结果表明，所获得的G-6-PD是纯的[2，7]，可以用于结构分析.
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3 参考文献
1 Kahn A，Dreyfus TC.Purification of glucose-6-phosphate dehydrogenase from red blood cells and from human leukocytes. Biochim Biophys Acta，1974，334：257
2 Craney CL，Coffredo ME. A rapid affinity chromatography procedure for the isolation of glucose-6-phosphate dehydrogenase from human erythrocytes. Anal Biochem，1983，128：312
3 Lamed R，Levin Y，Wilche M.Covalent coupling of nucleotides to agarose for affinity chromatography.Biochim Biophys Acta，1973，304：231
, 百拇医药
4 赵剑，凌光鑫.国产721型分光光度计在近紫外光区酶动力学分析中的应用.中华血液学杂志，1985，6(3)：173
5 Sedmak JJ，Grossbery SE.A rapid sensitive and versatile assay for protein using coomassie brilliant blue G 250.Anal Biochem，1977，79：544
6 Laemmli UK.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature，1970，227：680
7 蔡望伟，凌光鑫，陈历昌.人类红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的分离纯化与鉴定.生物化学杂志，1991，7(6)：747
收稿日期： 1998-04-13, 百拇医药
单位：(黄进明)广东省深圳市福田区梅林医院，深圳 518049；(凌光鑫)广东医学院生化教研室，湛江 524023
关键词：红细胞；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；纯化方法
广东医学院学报JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE1999年 第17卷 第1期 Vol 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)是磷酸戊糖途径的限速酶.传统的以NADP-Sepharose 4 B作为亲和吸附剂的纯化方法由于较昂贵的NADP-Sepharose 4 B用量多，且耗时长，为此，作者对此传统方法进行了改进.报道如下：
1 材料与方法
1.1 分离纯化 G-6-PD的分离纯化根据Kahn[1]和Craney[2]等的方法加以改进.纯化过程简述如下：人抗凝血1000mL，离心，吸弃血浆及白细胞层，用生理盐水洗涤红细胞，加入溶胞液和少量甲苯，剧烈振摇破坏红细胞，制得溶血液.10g DEAE-Sephadex A 50(Pharmacia 产品)用含20mmol/LNaCl的磷酸盐缓冲液(50mmol/L，pH6.4)平衡后抽干，倒入溶血液中，不时搅拌，吸附40min，抽干，用含50mmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液抽滤洗涤，再用含250mmol/L NaCl，10μmol/L NADP+(Sigma产品)的磷酸盐缓冲液洗脱G-6-PD，加入2 mmol/L NADP+使其终浓度为20 μ mol/L。将固体(NH4)2 SO4加入G-6-PD洗脱液中至终浓度为36%，收集沉淀物，透析.样品上40mL NADP-Sepharose 4 B(按Lamed等的方法合成[3].
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Sepharose 4 B为Sigma产品)亲和柱，用600mmol/L NaCl，50μmol/L NADP+，50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH9.0)洗脱G-6-PD，超滤浓缩至2ml后再加入含50μmol/L NADP+的磷酸盐酸冲液(10mmol/L，pH8.0)50mL，继续超滤脱盐至2mL.样品上DEAE-Sephadex A 50柱，用NaCl梯度洗脱G-6-PD，超滤浓缩.
1.2 酶活力的测定
1.2.1 定量测定 按赵剑等[4]的方法进行.温度为25℃.
1.2.2 定性测定 在黑色陶瓷板的凹孔中加入洗脱液、反应液和G-6-P(Sigma产品)各一滴，在紫外灯下观察有无荧光产生.
1.3 蛋白质浓度的测定 采用考马斯亮蓝G-250(进口分装)染色法[5]，以BSA为标准品.
, 百拇医药
1.4 SDS-PAGE 按Laemmli[6]的方法进行.分离胶浓度为7.5%，浓缩胶为4%.
2 结果与讨论
经上述纯化步骤后，得到了G-6-PD纯品.分离纯化流程和
结果见表1. 从1000mL人全血中，得到G-6-PD1.68mg，比活性165U/mg，回收率54%，SDS-PAGE 显示单一条带(图1).
表1 人红细胞G-6-PD纯化流程和结果 纯化步骤
总蛋白
(m/mg)
总活性
(U)
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比活性
(U/mg)
回收率
/%
溶血液
106800
509
0.0048
100
第一次DEAE-Sephadex A 50层析
1302
463
0.36
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91
(NH4)2SO4沉淀
300
463
1.54
91
NADP-Sepharose 4 B亲和层析
4.45
356
80
70
第二DEAE-Sephadex A 50柱层析
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1.68
277
165
54
图1 人红细胞G-6-PD不同纯化阶段SDS-PAGE电泳图谱
1 从第一次DEAE-Sephadex A 50层析洗脱的样品
2 从NADP-Sepharose 4 B 亲和柱洗脱的样品
3 从第二次DEAE-Sephadex A 50层析柱洗脱的G-6-PD纯品
文献[2，7]曾报道过用NADP-Sepharose 4 B亲和层析纯化人红细胞G-6-PD的方法。其分离纯化的步骤是先用NADP-Sepharose 4 B吸附溶血液中的G-6-PD，再用(NH4)2 SO4沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析等方法进一步纯化而得到G-6-PD纯品.纯化500mL人全血需要50mL NADP-Sepharose 4 B.本法采用的纯化线路是先用离子交换层析和(NH4)2SO4沉淀以除去大部分杂蛋白，再经NADP-Sepharose 4 B 亲和层析和第二次离子交换层析而获得G-6-PD纯品.纯化1000mL人全血仅需40mL NADP-Sepharose 4 B.减少价格较贵的NADP-Sepharose 4 B 的用量，可以降低纯化费用，有利于一次性制备多量G-6-PD纯品及缩减制备时间，是一种有效实用的方法。纯化的结果表明，所获得的G-6-PD是纯的[2，7]，可以用于结构分析.
, http://www.100md.com
3 参考文献
1 Kahn A，Dreyfus TC.Purification of glucose-6-phosphate dehydrogenase from red blood cells and from human leukocytes. Biochim Biophys Acta，1974，334：257
2 Craney CL，Coffredo ME. A rapid affinity chromatography procedure for the isolation of glucose-6-phosphate dehydrogenase from human erythrocytes. Anal Biochem，1983，128：312
3 Lamed R，Levin Y，Wilche M.Covalent coupling of nucleotides to agarose for affinity chromatography.Biochim Biophys Acta，1973，304：231
, 百拇医药
4 赵剑，凌光鑫.国产721型分光光度计在近紫外光区酶动力学分析中的应用.中华血液学杂志，1985，6(3)：173
5 Sedmak JJ，Grossbery SE.A rapid sensitive and versatile assay for protein using coomassie brilliant blue G 250.Anal Biochem，1977，79：544
6 Laemmli UK.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature，1970，227：680
7 蔡望伟，凌光鑫，陈历昌.人类红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的分离纯化与鉴定.生物化学杂志，1991，7(6)：747
收稿日期： 1998-04-13, 百拇医药