细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子研究进展
作者：黄 健 王国华
单位：黄健 桂林医学院生物工程研究所；王国华 广西桂林市 541004 桂林医学院附属医院口腔科
关键词：
华夏医学990186 细胞周期与细胞癌变的关系是近年来生命科学研究中的热门课题之一。细胞周期是细胞生命活动的基本过程，正常情况下，细胞在周期时相的变迁中进入增殖、分化、衰老和死亡等生理状态。如果细胞周期调控异常，细胞将进入病理状态，如细胞转化、癌变。参与细胞周期调控的因子主要有：细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinase,CDK)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI)。Cyclin目前发现有8个成员，分别命名为Cyclin A、B、C、D、E、F、G、H。CDK目前发现7个成员，分别命名为CDK1-7。CKI为新发现的一类蛋白，通过与CDK、cyclin或cyclin-cdk复合物的结合，抑制CDK的激酶活性，从而调节细胞周期正常、有序地进行。目前CKI分为两大家族：①Ink4(Inhibitor of cdk 4):包括P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，其蛋白质结构与功能具有高度相似性，特异性抑制cdk4·cyclin D1、cdk6·cyclin D1的磷酸化激酶活性。②Kip(Kinase inhibition protein)：包括P21cip1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2，它们在N-末端具有高度的结构和功能相似性，抑制现已知的大多数cdk、cyclin的磷酶化激酶活性。
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1 Ink4
根据其功能不同，Ink4又分为两类：一类为P16ink4a和P15ink4b ，或MTS1和MTS2(mutiple tumor suppressor gene,MTS)，在大多数肿瘤细胞和细胞株中有基因突变。另一类为P18ink4c和P19ink4d，目前肿瘤中有关P18或P19基因突变的报道少见。
1.1 P16ink4a 和P15ink4b
早在1992年，Skolmick小组就提出在人类染色体的9P21区位含有一个皮肤癌的易感性危险基因[1，2]。 后来不但在皮肤癌发现这个9P21区位出现缺失和突变，而且在其它癌症中也很普遍。这些发现表明，该区是一个多肿瘤抑制基因常常发生突变的“是非之地”。到1993年初，通过各种研究方法确认该区含有MTS1和另一个MTS2基因。其中MTS1基因含有中间307bp的编码序列以及两侧的两个内含子和两个外显子，中间的307bp组成外显子2(exon 2)，外显子序列全长8.5Kb，编码CDK的抑制蛋白，即P16。MTS2为P15蛋白的染色体组基因，不含MTS1基因的外显子1，与MTS1相似，它们的第二个外显子中255个碱基对的同源性为93%[3] 。
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正常情况下，肿瘤抑制基因是一个细胞周期的调节者，它在细胞增殖周期的某个关键环节上对细胞分裂和生长进行适当抑制，使细胞按正常程序性周期分裂、生长和死亡，防止细胞周期失控变成无限制地扩增、分裂、生长最终向肿瘤发展和转化。肿瘤抑制基因的功能主要是通过它们表达的产物来实施的，作为肿瘤抑制基因的P16与类似癌基因的细胞周期素D(cyc D)，竞争性地同cdk4结合，当P16同cdk4结合时，阻止细胞生长分裂，当cyc D同cdk4结合时，刺激细胞生长分裂；相反，当P16由于MTS1基因突变而不能正常表达时，一方面不能竞争结合cdk4阻止细胞分裂，另一方面增加cyc D同cdk4结合，进一步刺激细胞的分裂，从而使细胞失去控制，向癌变发展。由于MTS1基因产物P16直接抑制cdk4，因而对于肿瘤的发生和细胞分裂周期的控制，比P53发挥更直接的作用[3，4]。到目前为止，P16成为人类发现的第一个最直接抑制肿瘤发生的细胞固有成分，在阐述癌发生机制方面提供了第一个直接的证据。该区基因亦称作P16ink4a、CDK4I、CDKN2基因。
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随着对P16基因结构及功能的了解，越来越多的科学工作者开始对各种肿瘤细胞及细胞株中的P16基因进行研究，以进一步了解其在肿瘤恶性进程中的作用，及在不同类型肿瘤中变异的情况。Moulton等检测27例原发性恶性神经胶质瘤，发现9例有MTS1基因缺失[5]。Gruis等在33例原发膀胱癌细胞中发现3例有MTS1基因缺失，在34例黑色素瘤中有5例MTS1基因缺失[6]。 Nayashi等[7] 对61例原发性非小细胞肺癌(NSCLC)进行了检测，14例发生错义突变，5例发生缺失。并有报道，NSCLC中P16和P15的缺失率高达83.3%(15/18)[8] 。对食管鳞状细胞癌的研究亦显示出MTS1基因的高突变比例(14/27)[9]。 Yeudall等用PCR技术检测了14例口腔鳞状细胞癌细胞株中的MTS1基因变异情况，结果其中8例有明显的MTS1基因缺失,余下的6例虽可表达正常的P16蛋白的mRNA,进一步研究发现,其基因结构中第2-16碱基对亦有缺失出现[10]。 说明MTS1基因的失活在这些肿瘤的发生中起重要作用。除此以外，淋巴细胞性白血病、胰腺癌、胃癌、肝癌、副甲状腺癌、卵巢癌、结肠癌、肾肿瘤等肿瘤细胞中亦发现MTS1基因缺失存在。在一定程度上证明MTS1是一多肿瘤抑制基因。一些研究还发现肿瘤细胞株的缺失率较原发性肿瘤组织的高[11]， 这种情况可能表明有MTS1损伤可使细胞株的培养具有长期生长的优点，含有MTS1基因变异的肿瘤更易培养成为细胞株。还发现某些恶性度高、肿瘤急变或预后差也与P16基因缺失有关。
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MTS1和MTS2基因变异主要有等位基因的纯合缺失、杂合缺失、错义突变等，但一般情况下缺失较点突变常见。一些肿瘤组织中P16基因缺失同时伴有P15基因的纯合性或杂合性缺失，有P15基因缺失则总是伴有P16基因缺失[12] ，但另外一些肿瘤组织中有P15基因缺失而P16基因完好无损[13]。 P15是TGF-β介导的细胞周期阻断的效应因子以抑制CDK4和CDK6激酶，但目前还不能确定P15是TGF-β诱导的细胞周期阻断的唯一介导者，还是P15必须和其它的TGF-β响应途径合作[14]。对于P15基因的功能有待进一步深入研究。用腺病毒载体介导将P16基因导入9P21缺失或P16基因缺失的肿瘤细胞中，可阻碍进入S期而抑制肿瘤增殖，进一步证实P16的抑癌作用及可能用于基因治疗的尝试[15]。由于P16分子量比P53低很多，又是最直接抑制肿瘤发生的细胞固有成分，因此，预计P16ink4a这个新的肿瘤抑制基因将给癌研究领域带来突破性的进展，并将有广阔的应用前景。
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1.2 P18ink4c和P19ink4d
P18和P19基因被认为同属于Ink4基因家族，P18基因定位于1P32，与P15和P16基因有高度同源性，能牢固地与CDK4、CDk6结合，抑制CDK4、CDK6的激酶活性。P19基因定位于19P13，能抑制Cyclin D-CDK4/6的激酶活性，目前肿瘤中有关P18或P19基因突变的报道少见。Tasaka等[16] 首先报道在对17例多发性骨髓瘤的研究中，发现一例P15和P18基因同时纯合缺失,提示这两个基因在骨髓瘤的发生发展中起重要作用。Rusin等[17] 对71例在非小细胞肺癌(NSCLC)研究中发现一例P18基因杂合缺失，但未发现基因内突变。大部分研究均未发现P18或P19基因突变。P18和P19基因能否成为肿瘤抑制基因的候选者仍需深入研究。
2 Kip
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现已知的Kip包括P21cip1 、P27kip1及P57kip23种细胞周期抑制蛋白，它们在N-末端具有高度的结构和功能相似性(P27kip1与P21cip1 N-端间具有42%的同源性，P27kip1 与P57kip2N-端间具有47%的同源性),特异性抑制Cdk4·Cyclin D1、Cdk 6·Cyclin D1、Cdk2·Cyclin E、Cdk2·Cyclin A的蛋白激酶活性，其作用的最适底物为Cdk2·Cyclin E和Cdk2·Cyclin A，具有与Ink4相似的功能。P21cip1 、P27kip1在绝大多数高等动物细胞中均有表达，以量的方式调节细胞周期和细胞分化。P57kip2则只在部分组织和细胞中表达，故在此不详述。
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2.1 P21cip1
P21cip1是首先发现的CKIs家族成员。早在1992年，就发现在二倍体成纤维细胞中P21与Cyclin D1/Cyclin D3、cdk2/cdk4/cdk5、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)形成四聚体复合物。另外，P21能抑制CLN-CDK家族的各成员的活性，如CLND-CDK4、CLNE-CDK2、CLNA-CDK2、CLNB-CDC2等，因而认为P21是一种CDK的广泛抑制物。对G1/S转换中所需CDK均有抑制作用，可抑制哺乳动物细胞过度繁殖。P21功能丧失可使细胞在负生长信号存在条件下继续增殖，因而P21可能是一种新的肿瘤抑制物[18] 。
P21基因定位于6P21.2，由长度分别为68bp、450bp、1600bp的3个外显子组成，翻译起始信号位于第二外显子，其启动区含有与P53结合的特异序列及TGF-β、Sp-1、Sp-3(转录因子)结合必需的长度为10bp的序列。由于发现途径不同，P21基因又名为Cip1、Waf1、Sdi1、Cap20。目前已知两条途径可诱导P21，一是由DNA损伤激活的依赖P53的途径，在此途径中，P21转录受P53诱导，P21是P53生长负调控的中介者，是联系抑癌基因与细胞周期调控的桥梁。二是当细胞进入G1期时由促细胞分裂素激活的不依赖于P53的途径，在此途径中，生长因子(PDGF、FGF、EGF、NGF、TGF-β)等作为细胞外信号刺激细胞，通过促细胞分裂素激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径，调节P21的转录，使其在早G1期表达，因为P21只有在达到一定量时才引起生长抑制，在G1早期，P21就可阻止合成的CDK-Cyclin复合物活性，防止提前进入S期。故P21也是细胞外信号(TGF-β)生长抑制作用的中介物。
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大多数肿瘤组织中未发现P21基因突变，但在其第31密码子处有基因多态性，碱基C变成A，从而丝氨酸变为精氨酸，不管是丝氨酸还是精氨酸，对P21蛋白的免疫组化染色没有差别，不但在肿瘤组织中有此现象，正常组织也一样[19]。P21通常是以量的方式调节细胞周期和细胞分化。P21蛋白表达与胰腺癌的早期临床阶段显著相关，P21阳性或P53阴性的癌症患者在化疗或放疗后增加生存机会[20]。 对食管癌中的P21蛋白的免疫组化调查分析发现，在20例分化好的鳞状细胞癌中有13例P21阳性，阳性细胞主要分布在癌巢内层；而在大多数形态上正常的鳞状上皮细胞标本中，P21阳性细胞大多在侧基底层(增殖层)；在癌前损害时，P21仅在损害区顶部周围的细胞中出现[21]。 推测P21的表达与肿瘤分化相关。P21cip1/waf1 的表达具有组织特异性，而不同的肿瘤类型有不同的P21表达特点[19]。故对于P21的功能及作用方式有待深入研究。能否将其用于肿瘤基因治疗还有待于其作用机制的进一步阐明。
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2.2 P27kip1
P27又名kip。由polyak等于1994年在TGF-β处理的生长抑制细胞及接触生长抑制的细胞株中发现的另一种分子量为27KD的耐热细胞周期抑制蛋白，由198个氨基酸残基组成，其编码区至少由两个外显子和一个内含子组成，P27kip1基因定位于12P12-12P13.1。 P27的作用与P21相似,能按化学剂量方式抑制不同类型Cyclin与CDK的结合或复合物的激活,阻碍G1期进入S期。P27的表达受TGF-β和接触抑制所诱导，属翻译后水平的调节，P15可使P27竞争性释放而加强TGF-β的相滞留作用[22]。
P27kip1是一种化学剂量抑制物，其表达水平的差别与细胞周期进程有很大关系，在肿瘤细胞中与肿瘤的恶性程度密切相关。即在原发性肿瘤及细胞株中，游离的P27kip1 的量远远低于正常的细胞的量[23]。P27kip1与P21cip1一样，在人类肿瘤组织中很少出现基因缺失或突变，迄今为止，仅在极少数的肿瘤中发现P27kip1 的突变，并且已发现的突变中，要么P27kip1蛋白二级结构变化不大，要么是沉默突变，沉默突变则构成P27kip1基因的局部位点的多态现象[24]。Kawamata等在140种不同肿瘤组织和18种不同类型细胞株中，检测P27基因突变，仅发现109密码子的多态性，未见突变发生。推测肿瘤组织中P27kip1基因突变率极低的现象可能是由于其突变是致死的，而不是造成细胞转化[25]。P27作为实体瘤耐药调节物提示：P27作为肿瘤的靶对抗剂在抗癌治疗中也许是一有用的化学敏感剂[26]。 在癌治疗方面有一定的应用前景。
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综上所述，CKIs的发现建立了肿瘤抑制和细胞周期调控之间的直接联系。在细胞发生恶性转化过程中，除癌基因/抑癌基因的正负调节失控外，细胞周期中正向调节作用的Cyclin、CDK及负向调节作用的CKIs都参与这一过程。抑癌基因P53通过P21；TGF-β通过P15、P27抑制肿瘤细胞的增殖；且由于CKIs对细胞周期的抑制作用，它们本身就是潜在的抑癌因子，如P16。但它们与癌症发生的相关性仍需进一步研究。
近年来由于分子生物学和细胞生物学技术的长足发展，肿瘤研究的深入，有关细胞周期调控的研究进展迅速。但细胞周期的调控是一极其复杂的过程，目前CKIs对Cyclin-CDK的抑制作用证据大多来自体外实验，在体内的抑制特性是否完全与之相符不得而知，在体内CKIs对CDKs的抑制具体以何种方式在细胞周期进程中起作用还需更深入、全面的研究。有关CKIs的研究才刚起步，预计将有更多新的CKIs逐步为人们所发现和利用。
第一作者现在桂林医学院生物化学与分子生物学教研室工作。
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参考文献
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(收稿 1998-02-01), 百拇医药
单位：黄健 桂林医学院生物工程研究所；王国华 广西桂林市 541004 桂林医学院附属医院口腔科
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华夏医学990186 细胞周期与细胞癌变的关系是近年来生命科学研究中的热门课题之一。细胞周期是细胞生命活动的基本过程，正常情况下，细胞在周期时相的变迁中进入增殖、分化、衰老和死亡等生理状态。如果细胞周期调控异常，细胞将进入病理状态，如细胞转化、癌变。参与细胞周期调控的因子主要有：细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinase,CDK)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI)。Cyclin目前发现有8个成员，分别命名为Cyclin A、B、C、D、E、F、G、H。CDK目前发现7个成员，分别命名为CDK1-7。CKI为新发现的一类蛋白，通过与CDK、cyclin或cyclin-cdk复合物的结合，抑制CDK的激酶活性，从而调节细胞周期正常、有序地进行。目前CKI分为两大家族：①Ink4(Inhibitor of cdk 4):包括P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，其蛋白质结构与功能具有高度相似性，特异性抑制cdk4·cyclin D1、cdk6·cyclin D1的磷酸化激酶活性。②Kip(Kinase inhibition protein)：包括P21cip1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2，它们在N-末端具有高度的结构和功能相似性，抑制现已知的大多数cdk、cyclin的磷酶化激酶活性。
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1 Ink4
根据其功能不同，Ink4又分为两类：一类为P16ink4a和P15ink4b ，或MTS1和MTS2(mutiple tumor suppressor gene,MTS)，在大多数肿瘤细胞和细胞株中有基因突变。另一类为P18ink4c和P19ink4d，目前肿瘤中有关P18或P19基因突变的报道少见。
1.1 P16ink4a 和P15ink4b
早在1992年，Skolmick小组就提出在人类染色体的9P21区位含有一个皮肤癌的易感性危险基因[1，2]。 后来不但在皮肤癌发现这个9P21区位出现缺失和突变，而且在其它癌症中也很普遍。这些发现表明，该区是一个多肿瘤抑制基因常常发生突变的“是非之地”。到1993年初，通过各种研究方法确认该区含有MTS1和另一个MTS2基因。其中MTS1基因含有中间307bp的编码序列以及两侧的两个内含子和两个外显子，中间的307bp组成外显子2(exon 2)，外显子序列全长8.5Kb，编码CDK的抑制蛋白，即P16。MTS2为P15蛋白的染色体组基因，不含MTS1基因的外显子1，与MTS1相似，它们的第二个外显子中255个碱基对的同源性为93%[3] 。
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正常情况下，肿瘤抑制基因是一个细胞周期的调节者，它在细胞增殖周期的某个关键环节上对细胞分裂和生长进行适当抑制，使细胞按正常程序性周期分裂、生长和死亡，防止细胞周期失控变成无限制地扩增、分裂、生长最终向肿瘤发展和转化。肿瘤抑制基因的功能主要是通过它们表达的产物来实施的，作为肿瘤抑制基因的P16与类似癌基因的细胞周期素D(cyc D)，竞争性地同cdk4结合，当P16同cdk4结合时，阻止细胞生长分裂，当cyc D同cdk4结合时，刺激细胞生长分裂；相反，当P16由于MTS1基因突变而不能正常表达时，一方面不能竞争结合cdk4阻止细胞分裂，另一方面增加cyc D同cdk4结合，进一步刺激细胞的分裂，从而使细胞失去控制，向癌变发展。由于MTS1基因产物P16直接抑制cdk4，因而对于肿瘤的发生和细胞分裂周期的控制，比P53发挥更直接的作用[3，4]。到目前为止，P16成为人类发现的第一个最直接抑制肿瘤发生的细胞固有成分，在阐述癌发生机制方面提供了第一个直接的证据。该区基因亦称作P16ink4a、CDK4I、CDKN2基因。
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随着对P16基因结构及功能的了解，越来越多的科学工作者开始对各种肿瘤细胞及细胞株中的P16基因进行研究，以进一步了解其在肿瘤恶性进程中的作用，及在不同类型肿瘤中变异的情况。Moulton等检测27例原发性恶性神经胶质瘤，发现9例有MTS1基因缺失[5]。Gruis等在33例原发膀胱癌细胞中发现3例有MTS1基因缺失，在34例黑色素瘤中有5例MTS1基因缺失[6]。 Nayashi等[7] 对61例原发性非小细胞肺癌(NSCLC)进行了检测，14例发生错义突变，5例发生缺失。并有报道，NSCLC中P16和P15的缺失率高达83.3%(15/18)[8] 。对食管鳞状细胞癌的研究亦显示出MTS1基因的高突变比例(14/27)[9]。 Yeudall等用PCR技术检测了14例口腔鳞状细胞癌细胞株中的MTS1基因变异情况，结果其中8例有明显的MTS1基因缺失,余下的6例虽可表达正常的P16蛋白的mRNA,进一步研究发现,其基因结构中第2-16碱基对亦有缺失出现[10]。 说明MTS1基因的失活在这些肿瘤的发生中起重要作用。除此以外，淋巴细胞性白血病、胰腺癌、胃癌、肝癌、副甲状腺癌、卵巢癌、结肠癌、肾肿瘤等肿瘤细胞中亦发现MTS1基因缺失存在。在一定程度上证明MTS1是一多肿瘤抑制基因。一些研究还发现肿瘤细胞株的缺失率较原发性肿瘤组织的高[11]， 这种情况可能表明有MTS1损伤可使细胞株的培养具有长期生长的优点，含有MTS1基因变异的肿瘤更易培养成为细胞株。还发现某些恶性度高、肿瘤急变或预后差也与P16基因缺失有关。
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MTS1和MTS2基因变异主要有等位基因的纯合缺失、杂合缺失、错义突变等，但一般情况下缺失较点突变常见。一些肿瘤组织中P16基因缺失同时伴有P15基因的纯合性或杂合性缺失，有P15基因缺失则总是伴有P16基因缺失[12] ，但另外一些肿瘤组织中有P15基因缺失而P16基因完好无损[13]。 P15是TGF-β介导的细胞周期阻断的效应因子以抑制CDK4和CDK6激酶，但目前还不能确定P15是TGF-β诱导的细胞周期阻断的唯一介导者，还是P15必须和其它的TGF-β响应途径合作[14]。对于P15基因的功能有待进一步深入研究。用腺病毒载体介导将P16基因导入9P21缺失或P16基因缺失的肿瘤细胞中，可阻碍进入S期而抑制肿瘤增殖，进一步证实P16的抑癌作用及可能用于基因治疗的尝试[15]。由于P16分子量比P53低很多，又是最直接抑制肿瘤发生的细胞固有成分，因此，预计P16ink4a这个新的肿瘤抑制基因将给癌研究领域带来突破性的进展，并将有广阔的应用前景。
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1.2 P18ink4c和P19ink4d
P18和P19基因被认为同属于Ink4基因家族，P18基因定位于1P32，与P15和P16基因有高度同源性，能牢固地与CDK4、CDk6结合，抑制CDK4、CDK6的激酶活性。P19基因定位于19P13，能抑制Cyclin D-CDK4/6的激酶活性，目前肿瘤中有关P18或P19基因突变的报道少见。Tasaka等[16] 首先报道在对17例多发性骨髓瘤的研究中，发现一例P15和P18基因同时纯合缺失,提示这两个基因在骨髓瘤的发生发展中起重要作用。Rusin等[17] 对71例在非小细胞肺癌(NSCLC)研究中发现一例P18基因杂合缺失，但未发现基因内突变。大部分研究均未发现P18或P19基因突变。P18和P19基因能否成为肿瘤抑制基因的候选者仍需深入研究。
2 Kip
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现已知的Kip包括P21cip1 、P27kip1及P57kip23种细胞周期抑制蛋白，它们在N-末端具有高度的结构和功能相似性(P27kip1与P21cip1 N-端间具有42%的同源性，P27kip1 与P57kip2N-端间具有47%的同源性),特异性抑制Cdk4·Cyclin D1、Cdk 6·Cyclin D1、Cdk2·Cyclin E、Cdk2·Cyclin A的蛋白激酶活性，其作用的最适底物为Cdk2·Cyclin E和Cdk2·Cyclin A，具有与Ink4相似的功能。P21cip1 、P27kip1在绝大多数高等动物细胞中均有表达，以量的方式调节细胞周期和细胞分化。P57kip2则只在部分组织和细胞中表达，故在此不详述。
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2.1 P21cip1
P21cip1是首先发现的CKIs家族成员。早在1992年，就发现在二倍体成纤维细胞中P21与Cyclin D1/Cyclin D3、cdk2/cdk4/cdk5、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)形成四聚体复合物。另外，P21能抑制CLN-CDK家族的各成员的活性，如CLND-CDK4、CLNE-CDK2、CLNA-CDK2、CLNB-CDC2等，因而认为P21是一种CDK的广泛抑制物。对G1/S转换中所需CDK均有抑制作用，可抑制哺乳动物细胞过度繁殖。P21功能丧失可使细胞在负生长信号存在条件下继续增殖，因而P21可能是一种新的肿瘤抑制物[18] 。
P21基因定位于6P21.2，由长度分别为68bp、450bp、1600bp的3个外显子组成，翻译起始信号位于第二外显子，其启动区含有与P53结合的特异序列及TGF-β、Sp-1、Sp-3(转录因子)结合必需的长度为10bp的序列。由于发现途径不同，P21基因又名为Cip1、Waf1、Sdi1、Cap20。目前已知两条途径可诱导P21，一是由DNA损伤激活的依赖P53的途径，在此途径中，P21转录受P53诱导，P21是P53生长负调控的中介者，是联系抑癌基因与细胞周期调控的桥梁。二是当细胞进入G1期时由促细胞分裂素激活的不依赖于P53的途径，在此途径中，生长因子(PDGF、FGF、EGF、NGF、TGF-β)等作为细胞外信号刺激细胞，通过促细胞分裂素激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径，调节P21的转录，使其在早G1期表达，因为P21只有在达到一定量时才引起生长抑制，在G1早期，P21就可阻止合成的CDK-Cyclin复合物活性，防止提前进入S期。故P21也是细胞外信号(TGF-β)生长抑制作用的中介物。
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大多数肿瘤组织中未发现P21基因突变，但在其第31密码子处有基因多态性，碱基C变成A，从而丝氨酸变为精氨酸，不管是丝氨酸还是精氨酸，对P21蛋白的免疫组化染色没有差别，不但在肿瘤组织中有此现象，正常组织也一样[19]。P21通常是以量的方式调节细胞周期和细胞分化。P21蛋白表达与胰腺癌的早期临床阶段显著相关，P21阳性或P53阴性的癌症患者在化疗或放疗后增加生存机会[20]。 对食管癌中的P21蛋白的免疫组化调查分析发现，在20例分化好的鳞状细胞癌中有13例P21阳性，阳性细胞主要分布在癌巢内层；而在大多数形态上正常的鳞状上皮细胞标本中，P21阳性细胞大多在侧基底层(增殖层)；在癌前损害时，P21仅在损害区顶部周围的细胞中出现[21]。 推测P21的表达与肿瘤分化相关。P21cip1/waf1 的表达具有组织特异性，而不同的肿瘤类型有不同的P21表达特点[19]。故对于P21的功能及作用方式有待深入研究。能否将其用于肿瘤基因治疗还有待于其作用机制的进一步阐明。
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2.2 P27kip1
P27又名kip。由polyak等于1994年在TGF-β处理的生长抑制细胞及接触生长抑制的细胞株中发现的另一种分子量为27KD的耐热细胞周期抑制蛋白，由198个氨基酸残基组成，其编码区至少由两个外显子和一个内含子组成，P27kip1基因定位于12P12-12P13.1。 P27的作用与P21相似,能按化学剂量方式抑制不同类型Cyclin与CDK的结合或复合物的激活,阻碍G1期进入S期。P27的表达受TGF-β和接触抑制所诱导，属翻译后水平的调节，P15可使P27竞争性释放而加强TGF-β的相滞留作用[22]。
P27kip1是一种化学剂量抑制物，其表达水平的差别与细胞周期进程有很大关系，在肿瘤细胞中与肿瘤的恶性程度密切相关。即在原发性肿瘤及细胞株中，游离的P27kip1 的量远远低于正常的细胞的量[23]。P27kip1与P21cip1一样，在人类肿瘤组织中很少出现基因缺失或突变，迄今为止，仅在极少数的肿瘤中发现P27kip1 的突变，并且已发现的突变中，要么P27kip1蛋白二级结构变化不大，要么是沉默突变，沉默突变则构成P27kip1基因的局部位点的多态现象[24]。Kawamata等在140种不同肿瘤组织和18种不同类型细胞株中，检测P27基因突变，仅发现109密码子的多态性，未见突变发生。推测肿瘤组织中P27kip1基因突变率极低的现象可能是由于其突变是致死的，而不是造成细胞转化[25]。P27作为实体瘤耐药调节物提示：P27作为肿瘤的靶对抗剂在抗癌治疗中也许是一有用的化学敏感剂[26]。 在癌治疗方面有一定的应用前景。
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综上所述，CKIs的发现建立了肿瘤抑制和细胞周期调控之间的直接联系。在细胞发生恶性转化过程中，除癌基因/抑癌基因的正负调节失控外，细胞周期中正向调节作用的Cyclin、CDK及负向调节作用的CKIs都参与这一过程。抑癌基因P53通过P21；TGF-β通过P15、P27抑制肿瘤细胞的增殖；且由于CKIs对细胞周期的抑制作用，它们本身就是潜在的抑癌因子，如P16。但它们与癌症发生的相关性仍需进一步研究。
近年来由于分子生物学和细胞生物学技术的长足发展，肿瘤研究的深入，有关细胞周期调控的研究进展迅速。但细胞周期的调控是一极其复杂的过程，目前CKIs对Cyclin-CDK的抑制作用证据大多来自体外实验，在体内的抑制特性是否完全与之相符不得而知，在体内CKIs对CDKs的抑制具体以何种方式在细胞周期进程中起作用还需更深入、全面的研究。有关CKIs的研究才刚起步，预计将有更多新的CKIs逐步为人们所发现和利用。
第一作者现在桂林医学院生物化学与分子生物学教研室工作。
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(收稿 1998-02-01), 百拇医药